雞脂肪組織TCF21基因啟動子區DNA甲基化與其表達的關系

劉雨萌，馬艷艷，姜海煦，張心揚，武春艷，程博涵，李 輝*

(1.農業農村部雞遺傳育種重點實驗室，哈爾濱 150030；2.黑龍江普通高等學校動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，哈爾濱 150030；3.東北農業大學動物科學技術學院，哈爾濱 150030)

脂肪組織不僅是能量儲存庫，也是機體最大的內分泌器官，通過分泌各種內分泌和旁分泌因子來調節多種生理過程[1-2]。脂肪組織生長發育的細胞學基礎是脂肪細胞數量的增多和體積的增大[3]。其中，脂肪細胞的數量主要受多潛能干細胞向前脂肪細胞定向及前脂肪細胞增殖的調控，而脂肪細胞的體積則與其分化程度及甘油三酯積累量有關[4-5]。脂肪組織的生長發育主要受轉錄因子構成的網絡調控，如過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)[6]、CCAAT增強子結合蛋白(C/EBPs)[7]、固醇調節元件結合蛋白(SREBPs)[8]、Kruppel樣轉錄因子(KLFs)[9]和GATA結合蛋白(GATAs)[10]等。此外，不斷有研究發現新的轉錄因子在調控脂肪組織生長發育過程中發揮重要的作用，如堿性螺旋-環-螺旋(basic helix-loop-helix,bHLH)家族中的轉錄因子TFE3、Ids等[11-12]。

DNA甲基化是一種重要的調控基因表達的表觀遺傳學機制，其調節基因表達的主要方式為改變DNA的穩定性、構象以及與蛋白質之間的相互作用[22-23]。DNA甲基化一般導致基因沉默[24-25]；而DNA去甲基化則相反，往往會重新激活沉默基因的表達[26]。近年來一些研究結果顯示，DNA甲基化在脂肪組織生長發育過程中發揮關鍵的調控作用[27-28]。Li等[29]發現，在誘導分化的小鼠3T3-L1前脂肪細胞中，C/EBPα基因的啟動子呈高甲基化狀態，而在未分化的3T3-L1前脂肪細胞中卻沒有檢測到這種高甲基化信號增加。有研究表明，用DNA甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞苷(5-Aza-dC)處理小鼠C3H/10T1/2干細胞后，會增加其定向分化為脂肪細胞的能力[30]。Li等[31]利用MeDIP-seq技術繪制了豬不同部位脂肪組織(背部淺表脂肪組織和背部深層脂肪組織)的DNA甲基化圖譜，發現與深層脂肪組織相比，淺表脂肪組織中的DNA甲基化程度更高，表明不同部位脂肪組織的甲基化程度不同。以上研究表明，DNA甲基化在脂肪組織的生長發育中扮演重要角色。近年來，對TCF21基因DNA甲基化的研究主要集中在癌癥上面。在多種癌癥中發現TCF21基因的表達與其啟動子區DNA甲基化的狀態密切相關[32-35]。到目前為止，尚未發現脂肪組織中TCF21基因DNA甲基化水平與其表達關系的研究報道。

本實驗室以腹脂率和血漿極低密度脂蛋白為選擇指標，構建了東北農業大學肉雞高、低腹脂雙向選擇品系(Northeast Agricultural University broiler lines divergently selected for abdominal fat content，NEAUHLF)[36]。目前，這兩個品系已經選育了24個世代，兩品系肉雞之間腹脂率差異極顯著。本課題組前期研究發現，TCF21基因在第19世代高脂系肉雞腹部脂肪組織中的表達水平顯著高于低脂系肉雞[21]，但其潛在的調控機制還不清楚。鑒于此，本研究將在前期研究的基礎上，探究雞脂肪組織中TCF21基因啟動子區DNA甲基化與其表達之間的關系。研究結果將有助于揭示高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因差異表達的原因，為深入研究雞TCF21基因的表達調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以高、低脂系第24世代7周齡肉雞(來自于東北農業大學阿城畜牧基地雞場)為試驗材料(每個品系15只雞)。禁食12 h后稱量體重(BW)并屠宰，屠宰后稱量腹脂重(AFW)，并計算腹脂率(AFP=AFW/BW)。采集的腹部脂肪組織樣品于0.75%氯化鈉中清洗，剪成小塊，放置于5 mL采樣管中，并于液氮中速凍，-80 ℃保存待用。需要說明的是：高、低脂系肉雞第24世代每個品系各組建了40個 半同胞家系，定向輸精、系譜孵化。每個品系孵化出1 000只左右的雛雞，公母各半。所有公雞按照肉仔雞的飼養方式飼養至7周齡屠宰。在挑選用于組織樣品采集的雞只時，要符合以下兩個條件：1)每個品系的15只雞生長發育正常；2)每個品系的15只雞來源于不同的半同胞家系。

1.2 載體和細胞系

海腎熒光素酶報告基因載體pRL-TK和螢火蟲熒光素酶報告基因載體pGL3-basic由本實驗室留存；不含CpG位點的螢火蟲熒光素酶報告基因載體，pCpGL-basic由揚州大學戴超輝惠贈[37]；永生化雞前脂肪細胞(ICP1、ICP2細胞)由本實驗室構建[38]。

1.3 主要試劑

TRIzol RNA分離試劑、DMEM/F12培養基、Opti-MEM無血清培養基、LipofectamineTM3000 Transfection Reagent、Penicillin-Streptomycin Liquid購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；0.25% Trypsin-EDTA(1×)購自Gibco公司；PBS緩沖液粉末購自北京中杉金橋生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser購自TaKaRa公司；Fast Start Universal SYBR Green Master購自Roche公司；胎牛血清(FBS)購自Biological Industries公司；CpG甲基轉移酶(M.SssI)購自NEB公司；質粒小提試劑盒購自Axygen公司；雙熒光素酶報告基因試劑盒Dual-Luciferase?Reporter Assay System購自Promega公司。

1.4 生物信息學預測

利用JASPAR(http://jaspar.genereg.net/)、TRANSFAC(http://gene-regulation.com/pub/databases.html)、AnimalTFDB(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/AnimalTFDB)預測轉錄因子結合位點。利用MethPrimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)預測雞TCF21基因啟動子區CpG位點、CpG島的數量和分布。將片段長度大于200 bp，CG含量超過50%，CG核苷酸比率大于0.6 的片段定義為CpG島。

1.5 引物設計和合成

本研究所用引物均根據雞的全基因組序列(http://genome.ucsc.edu,UCSC)Mar.2018(GRCg6a/galGal6)來設計，并委托北京英濰捷基公司進行合成。TCF21基因表達檢測引物使用Primer Premier 5.0軟件設計，其中TCF21-P1擴增片段長度為264 bp、TBP-P1擴增片段長度為122 bp。TCF21基因啟動子區DNA甲基化檢測引物使用Agena EpiDesigner程序設計，其中TCF21-P2引物擴增片段長度為487 bp(-1 961～-1 475 bp)、TCF21-P3引物擴增片段長度為467 bp(-1 455～-989 bp)、TCF21-P4引物擴增片段長度為423 bp(-1 013～-590 bp)、TCF21-P5引物擴增片段長度為490 bp(-676～-187 bp)、TCF21-P6引物擴增片段長度為334 bp(-170～+164 bp)。引物信息見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6 RT-qPCR

采用 TRIzol 試劑提取脂肪組織的總RNA，并反轉錄成cDNA。Real-Time PCR反應液的組成：SYBR 5 μL，上/下游引物各0.2 μL，H2O 3.6 μL，cDNA 1 μL，總體系為10 μL。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。以TATA盒結合蛋白(TATA-box binding protein，TBP)為內參基因，采用2-△△Ct方法計算TCF21基因的相對表達水平[39]，其中ΔCt =Ct(TCF21)-Ct(TBP)。TCF21基因表達檢測引物序列見表1。

來了一個人，正在打量投水似的神氣，把花條子襯衣下角長長的拖著，作成北京城大學生特有的丑樣子，在臉上，也正同樣有一派老去民族特有的憔悴顏色。

1.7 Sequenom MassARRAY檢測DNA甲基化

采用QIAamp DNA Mini Kit提取雞腹部脂肪組織DNA。采用EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit說明書對DNA進行亞硫酸氫鹽處理。以上述亞硫酸鹽處理的DNA為試驗材料，利用Sequenom MassARRAY飛行質譜技術進行TCF21基因啟動子區CpG單元的甲基化水平檢測(委托上海歐易生物醫學科技有限公司完成)。一個CpG單元表示一個單獨的CpG位點或者是多個聯合的CpG位點[40-41]。TCF21基因啟動子區DNA甲基化檢測引物見表1。

1.8 啟動子熒光素酶報告基因載體的構建

委托金唯智生物技術公司合成雞TCF21基因啟動子(將5′-UTR對應的基因組區域及5′-UTR上游2 000 bp定義為TCF21基因啟動子)及5′端截短的啟動子片段并連接至pGL3-Basic載體，構建含有TCF21基因啟動子及5′端截短的啟動子片段的螢火蟲熒光素酶報告基因載體，分別命名為pGL3-2000/+165、pGL3-1500/+165、pGL3-1000/+165、pGL3-500/+165、pGL3-200/+165、pGL3-100/+165，并將雞TCF21基因5′-UTR對應的基因組區域及5′-UTR上游2 000 bp定義為雞TCF21基因啟動子。委托金唯智生物技術公司合成TCF21基因啟動子R2+R3區域(-1 500～-500 bp)、R2區域(-1 500～-1 000 bp)、R3區域(-1 000～-500 bp)DNA片段并連接至pCpGL-Basic載體(該載體骨架不含CG位點)，構建含有TCF21基因啟動子重要區域的螢火蟲熒光素酶報告基因載體，分別命名為pCpGL-1500/-500、pCpGL-1500/-1000和pCpGL-1000/-500。

1.9 細胞轉染及熒光素酶活性檢測

將永生化雞前脂肪細胞接種于24孔板，當細胞70%～90%匯合時，采用Lipofectamine 3000轉染試劑將構建好的螢火蟲熒光素酶報告基因質粒和海腎熒光素酶報告基因質粒以100∶1的比例轉染至細胞中。轉染后48 h收集細胞，根據Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)試劑盒說明書分別檢測螢火蟲熒光素酶活性(Fluc)和海腎熒光素酶活性(Rluc)。TCF21基因啟動子活性用相對熒光素酶活性(Fluc/Rluc)表示。

1.10 DNA甲基化轉移酶處理啟動子報告基因載體

甲基化組：用CpG甲基轉移酶(M.SssI)在37 ℃ 條件下對pCpGL-TCF21-1500/-500、pCpGL-TCF21-1500/-1000、pCpGL-TCF21-1000/-500質粒及陽性對照質粒pGL3-P1和陰性對照質粒pCpGL-basic處理4 h。CpG甲基化酶(M.Sssl)反應體系：10×NEBuffer 230 μL，S-adenosylmethionone (1 600 μmol·L-1)30 μL，質粒15 μg，甲基轉移酶3.75 μL，補充Nuclease-free water至150 μL。非甲基化組：反應體系中用Nuclease-free water代替甲基轉移酶，其它操作與甲基化組相同。質粒處理4 h后，利用PCR純化試劑盒對甲基化組與非甲基化組的質粒進行純化，-20 ℃保存待用。

1.11 統計分析

所有數據結果都表示為“平均值(Mean)±標準差(SD)”。采用Student’st-test進行兩組數據的差異顯著性分析。利用Pearson相關系數分析DNA甲基化水平與基因表達水平之間的相關性。P<0.05 表示差異顯著或相關性顯著，P<0.01或P<0.001表示差異極顯著或相關性極顯著。統計分析所用軟件為JMP 11.0(SAS Institute)。

2 結 果

2.1 高、低脂系肉雞脂肪組織中TCF21基因表達水平的比較分析

結果顯示，高脂系肉雞的腹脂率極顯著高于低脂系肉雞(P<0.001，圖1A)。高脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因mRNA表達水平極顯著高于低脂系肉雞(P<0.001，圖1B)。

A.第24世代7周齡高、低脂系肉雞腹脂率的比較；B.第24世代7周齡高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因的mRNA表達情況。LEAN代表低脂系肉雞(n=15)，FAT代表高脂系肉雞(n=15)；***.P<0.001，下同A.Comparison of abdominal fat percentage between lean and fat line broilers at 7 weeks of age from the 24th generation of NEAUHLF;B.Expression of TCF21 mRNA in abdominal adipose tissue of fat and lean broilers at 7 weeks of age from the 24th generation of NEAUHLF.LEAN represent lean line broilers (n=15),FAT represent fat line broilers (n=15).***.P<0.001,the same as below圖1 高、低脂系肉雞第24世代7周齡腹脂率及腹部脂肪組織中TCF21基因的mRNA表達情況Fig.1 Comparison of AFP and the expression of TCF21 mRNA in abdominal adipose tissue of fat and lean broilers at 7 weeks of age from the 24th generation of NEAUHLF

2.2 雞TCF21基因啟動子結構與功能的初步分析

Methprimer在線軟件分析結果顯示，雞TCF21基因的啟動子區(5′-UTR對應的基因組區域及5′-UTR上游2 000 bp)不存在CpG島，但存在40個CpG位點，這些CpG位點在啟動子的近端和遠端均有分布(圖2)。

每條豎線代表一個CpG位點Each vertical line represents a CpG site圖2 雞TCF21基因啟動子區CpG位點分布Fig.2 Distribution of CpG sites in the promoter region of chicken TCF21

啟動子報告基因活性分析結果顯示，當TCF21基因啟動子從-2 000 bp截短到-1 500 bp時，啟動子活性降低，暗示TCF21基因啟動子-2 000～-1 500 bp之間存在重要的正調控元件，將該區域命名為“R1”(圖3A、B、C)；當TCF21基因啟動子從-1 500 bp截短到-1 000 bp時，啟動子活性上升，暗示TCF21基因啟動子-1 500～-1 000 bp之間存在重要的負調控元件，將該區域命名為“R2”(圖3A、B、C)；當TCF21基因啟動子從-1 000 bp截短到-500 bp時，啟動子活性上升，暗示TCF21基因啟動子-1 000～-500 bp之間存在重要的負調控元件，將該區域命名為“R3”(圖3A、B、C)；當TCF21基因啟動子從-500 bp截短到-200 bp時，啟動子活性降低，暗示TCF21基因啟動子-500～-200 bp之間存在重要的正調控元件，將該區域命名為“R4”(圖3A、B、C)；當TCF21基因啟動子從-200 bp截短到-100 bp時，啟動子活性消失，說明TCF21基因啟動子-200～-100 bp之間具有維持TCF21基因轉錄活性的基本元件，該區域是TCF21基因啟動子的核心區域，將該區域命名為“Core”(圖3A、B、C)。此外，將TCF21啟動子-100～ +165 bp的區域命名為R5(圖3C)。

為明確哪些轉錄因子可能參與調控雞TCF21基因啟動子的活性，本研究利用JASPAR、TRANSFAC和AnimalTFDB在線軟件分析了雞TCF21基因啟動子各個區域內潛在的轉錄因子結合位點。結果顯示，雞TCF21基因啟動子R1區域(-2 000～-1 500 bp)存在CDX1、HOXA2、PDX1、Pax2及Sox17的結合位點；R2區域(-1 500～-1 000 bp)存在Pax2、Sox10、FOS、SPIB及FOXP3的結合位點；R3區域(-1 000～-500 bp)存在FOXA1、CREB1、Sox3及STAT3的結合位點；R4區域(-500～ -200 bp)存在IRF7、KLF5及Pax2的結合位點；Core區域(-200～-100 bp)存在KLFs(KLF4、KLF5、KLF16)，Sps(Sp1、Sp2、Sp3)及GATA5的結合位點(圖3D)。

A.ICP1細胞中雞TCF21基因啟動子的報告基因分析；B.ICP2細胞中雞TCF21基因啟動子的報告基因分析；C.TCF21基因啟動子重要區域；D.雞TCF21基因啟動子區潛在的轉錄因子結合位點。*. P<0.05，**.P<0.01，下同A.Reporter gene analysis of chicken TCF21 promoter in ICP1 cells;B.Reporter gene analysis of chicken TCF21 promoter in ICP2 cells;C.The important region of TCF21 promoter;D.The potential transcription factor binding site in the chicken TCF21 promoter region.*.P<0.05,**.P<0.01,the same as below圖3 雞TCF21基因啟動子的結構和功能的初步分析Fig.3 Structure and function analysis of chicken TCF21 promoter

2.3 TCF21基因啟動子區DNA甲基化分析

利用Sequenom MassARRAY飛行質譜技術檢測高、低脂系肉雞7周齡腹部脂肪組織中TCF21基因啟動子區(-2 000～+165 bp)40個CpG位點的甲基化程度。需要說明的是：一個CpG單元表示一個單獨的CpG位點或者是多個聯合的CpG位點。據此，將40個CpG位點劃分為38個CpG單元(CpG_32與CpG_33合并、CpG_37與CpG_38合并,圖4)。本研究成功檢測到31個CpG單元的甲基化，其中3個CpG單元位于R1區域、7個CpG單元位于R2區域、6個CpG單元位于R3區域、5個CpG單元位于R4區域、1個CpG單元位于Core區域、9個CpG單元位于R5區域(圖4)。

每一行表示一個樣本，每一列表示一個CpG單元。從淺黃色到紅色的變化顯示甲基化水平的升高，白色表示甲基化水平為0或缺失值Each sample is shown in one row,each CpG unit is shown in a column.The methylation degree is shown as a gradient varying from yellow to red.White indicates that methylation level of the CpG unit is 0 or missing data圖4 高、低脂系肉雞脂肪組織中TCF21基因啟動子區CpG單元分布及其甲基化狀態Fig.4 The distribution and methylation status of CpG units in the promoter region of TCF21 in adipose tissue of fat and lean line broilers

根據檢測得到的DNA甲基化情況，本研究首先從整體水平分析了高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動子及啟動子各個區域的DNA甲基化程度(用每個區域內所有成功檢測的CpG單元的平均甲基化水平來代表該區域的DNA甲基化水平,圖5)。結果顯示，TCF21基因啟動子的DNA甲基化水平在高、低脂系間差異不顯著(P>0.05；圖5H)，高脂系R2、R3及R2+R3的區域DNA甲基化水平顯著或極顯著高于低脂系(P<0.05或P<0.001；圖5B、C、G)，其他區域(R1區域、R4區域、Core區域、R5區域)的DNA甲基化水平在高、低脂系間差異不顯著(P>0.05；圖5A、D、E、F)。

A～G.TCF21基因啟動子R1、R2、R3、R4、Core、R5和R2+R3區域的DNA甲基化分析；H.TCF21基因啟動子DNA甲基化分析。ns.差異不顯著A-G.DNA methylation analysis of R1，R2，R3，R4，Core,R5 and R2+R3 regions of TCF21 promoter,respectively;H.DNA methylation analysis of promoter of TCF21.ns.Not significant圖5 高、低脂系肉雞脂肪組織中TCF21基因啟動子區DNA甲基化水平的比較Fig.5 Comparison of DNA methylation level of TCF21 promoter in adipose tissue between fat and lean broilers

另外，本研究還分析了高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動子區每個CpG單元的DNA甲基化水平。結果顯示，高、低脂系肉雞間存在甲基化水平差異的CpG單元有8個，包括CpG_6、CpG_7、CpG_10、CpG_11、CpG_12、CpG_20、CpG_29、CpG_32,33，其中高脂系CpG_6、CpG_7、CpG_10、CpG_12、CpG_20、CpG_32,33單元的甲基化水平顯著或極顯著高于低脂系，而高脂系CpG_11和CpG_29單元的甲基化水平顯著低于低脂系(表2)。

2.4 TCF21基因啟動子區DNA甲基化水平與其mRNA 表達水平的相關性分析

首先，從整體水平分析高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動子及啟動子各個區域的DNA甲基化水平與其mRNA表達水平的相關性。結果顯示，TCF21基因啟動子R2區域、R3區域及R2+R3區域DNA甲基化水平與TCF21基因mRNA表達水平呈顯著的正相關(R2區域：r=0.438，P<0.05；R3區域：r=0.371，P<0.05；R2+R3區域：r=0.489，P<0.05；圖6B、C、G)。以上結果表明，TCF21基因啟動子R2和R3區域的DNA甲基化對于調控TCF21 mRNA的表達可能具有重要作用。

除此之外，本研究還分析了單個CpG單元的甲基化水平與TCF21基因mRNA表達水平的相關性，結果見表2。高、低脂系肉雞中顯著差異的8個CpG單元的甲基化水平與TCF21 mRNA表達水平相關分析的結果顯示：CpG_7、CpG_10、CpG_20的甲基化水平與TCF21 mRNA表達水平呈顯著或極顯著正相關(P<0.05或P<0.01)，CpG_29的甲基化水平與TCF21 mRNA表達水平呈顯著負相關(P<0.05)。

表2 TCF21基因啟動子區DNA甲基化狀態以及單個CpG單元甲基化水平與其mRNA表達水平的相關性Table 2 The DNA methylation status of TCF21 promoter region and the correlation of the levels of individual CpG unit methylation with TCF21 mRNA expression

A.TCF21基因啟動子R1區域DNA甲基化與其mRNA表達的相關性；B.TCF21基因啟動子R2區域DNA甲基化與其mRNA表達的相關性；C.TCF21基因啟動子R3區域DNA甲基化與其mRNA表達的相關性；D.TCF21基因啟動子R4區域DNA甲基化與其mRNA表達的相關性；E.TCF21基因啟動子Core區域DNA甲基化與其mRNA表達的相關性析；F.TCF21基因啟動子R5區域DNA甲基化與其mRNA表達的相關性；G.TCF21基因啟動子R2+R3區域DNA甲基化與其mRNA表達的相關性；H.TCF21基因啟動子DNA甲基化與其mRNA表達的相關性A.The correlation between DNA methylation level of R1 region and TCF21 mRNA expression level;B.The correlation between DNA methylation level of R2 region and TCF21 mRNA expression level;C.The correlation between DNA methylation level of R3 region and TCF21 mRNA expression level;D.The correlation between DNA methylation level of R4 region and TCF21 mRNA expression level;E.The correlation between DNA methylation level of Core region and TCF21 mRNA expression level;F.The correlation between DNA methylation level of R5 region and TCF21 mRNA expression level;G.The correlation between DNA methylation level of R2+R3 region and TCF21 mRNA expression level;H.The correlation between DNA methylation level of promoter of TCF21 gene and TCF21 mRNA expression level圖6 肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動子區DNA甲基化水平與其mRNA表達水平的相關性Fig.6 Correlation between TCF21 promoter DNA methylation level and mRNA expression in abdominal adipose tissue of broilers

2.5 DNA甲基化對雞TCF21基因啟動子活性的影響

本研究發現TCF21基因啟動子R2、R3及R2+R3的區域DNA甲基化水平在高、低脂系肉雞腹部脂肪組織之間差異顯著，且R2區域、R3區域及R2+R3區域DNA甲基化水平與TCF21基因mRNA 表達水平顯著相關，提示TCF21啟動子這些區域的DNA甲基化可能影響其mRNA表達。為進一步分析TCF21啟動子R2區域、R3區域及R2+R3區域的DNA甲基化是否影響其轉錄活性，首先將雞TCF21基因啟動子R2區域、R3區域及R2+R3區域分別克隆到無CpG位點的熒光素酶報告基因載體pCpGL-basic上，將上述3個質粒及pCpGL-basic分別與pRL-TK共轉染于雞ICP1細胞中，轉染48 h后收集細胞，檢測報告基因活性。結果顯示，pCpGL-1500/-500(TCF21基因啟動子R2+R3區域)、pCpGL-1500/-1000(TCF21基因啟動子R2區域)、pCpGL-1000/-500(TCF21基因啟動子R3區域)的報告基因活性顯著高于pCpGL-basic(P<0.05，圖7A)，說明TCF21啟動子R2區域、R3區域、R2+R3區域在雞ICP1細胞中具有轉錄活性。

隨后，將以上3個雞TCF21啟動子報告基因質粒、陽性對照質粒pGL3-P1(該陽性對照質粒是包含雞PPARγ基因P1啟動子的報告基因載體，本實驗室前期發現DNA甲基化能顯著抑制pGL3-P1的報告基因活性[42]。因此，本研究用該陽性對照質粒來證實DNA甲基化酶處理質粒實驗系統的有效性)及陰性對照質粒pCpGL-basic利用CpG甲基轉移酶M.SssI處理，作為甲基化組；而未甲基化組則是用RNase Free H2O處理這5種質粒。將甲基化的質粒pCpGL-1500/-500、pCpGL-1500/-1000、pCpGL-1000/-500、pGL3-P1和pCpGL-basic以及他們對應的未甲基化質粒分別與pRL-TK共轉染于雞ICP1細胞中。報告基因活性分析結果顯示，甲基化的pGL3-P1的報告基因活性顯著低于其對應的未甲基化的報告基因活性(P<0.05，圖7B)，說明DNA甲基化酶處理報告基因質粒這一試驗系統是有效的。此外，甲基化的pCpGL-1500/-500(TCF21基因啟動子R2+R3區域)和pCpGL-1500/-1000(TCF21基因啟動子R2區域)的報告基因活性顯著低于其對應的未甲基化的報告基因活性，報告基因活性分別下調37%和47%(P<0.05，圖7B)，而pCpGL-1000/-500(TCF21基因啟動子R3區域)在甲基化酶處理前后報告基因活性沒有顯著差異(P>0.05，圖7B)。盡管R2+R3區域的DNA甲基化對報告基因活性的抑制作用略弱于單獨的R2區域的DNA甲基化對報告基因活性的抑制作用，但差異并不顯著(P>0.05，圖7C)。以上結果說明R2區域的DNA甲基化會顯著抑制其轉錄活性，而無論是R3區域單獨存在還是與R2區域共同存在，R3區域的DNA甲基化均不會對其轉錄活性造成影響。

A.TCF21基因啟動子報告基因活性；B.TCF21基因啟動子甲基化和未甲基化報告基因活性；C.TCF21基因啟動子R2+R3區域及R2區域甲基化和未甲基化報告基因活性A.Reporter activity of TCF21 promoter;B.Reporter activity of methylation and unmethylation TCF21 promoter;C.Reporter activity of methylation and unmethylation R2+R3 and R2 regions of TCF21 promoter圖7 DNA甲基化對TCF21基因啟動子活性的影響Fig.7 Effect of DNA methylation on promoter activity of TCF21

3 討 論

DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳學修飾，啟動子區發生的DNA甲基化通常與基因的轉錄沉默有關[43]。越來越多的研究表明，TCF21基因啟動子區DNA甲基化水平與其表達水平密切相關。人類上的研究發現，與癌旁組織相比，胃癌組織中TCF21啟動子區DNA甲基化水平顯著升高，同時其基因表達水平顯著降低，用DNA甲基轉移酶抑制劑5-AZA-2’-脫氧-胞嘧啶處理胃癌細胞可以上調TCF21的表達[44]。在頭部和頸部鱗狀細胞癌中，TCF21基因的DNA甲基化及基因表達狀態與在胃癌中相同，啟動子區的高甲基化抑制了該基因的表達[45]。到目前為止，尚未發現雞TCF21基因啟動子區DNA甲基化與其表達關系相關的研究報道。本研究發現TCF21基因在第24世代高、低脂系肉雞7周齡腹部脂肪組織中差異表達(圖1)，這與該群體第19世代的研究結果一致[21]。由于DNA甲基化與基因表達之間存在很強的聯系，這促使本課題組探究雞TCF21基因在高、低脂系腹部脂肪組織的差異表達是否受到其啟動子區DNA甲基化的調控。因此，本研究檢測了雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動子區的甲基化狀態，結果顯示，在高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動子R2、R3、R2+R3區域的DNA甲基化水平存在顯著差異(圖5)，提示TCF21基因在高、低脂系腹脂中的差異表達與R2和R3區域的DNA甲基化水平有關。隨后的研究發現TCF21基因啟動子R2、R3、R2+R3區域的DNA甲基化水平與TCF21基因mRNA表達水平確實有關。但值得注意的是，TCF21基因啟動子上述區域的DNA甲基化水平與其mRNA表達水平呈顯著的正相關(圖6)。這一結果與通常所熟知的DNA甲基化抑制基因的表達并不一致。推測原因可能是雞脂肪組織中TCF21基因的mRNA水平除了受DNA甲基化調控外，還受轉錄因子、組蛋白修飾、染色質重塑等其它因素的調控。前人相關研究也發現了此類現象。在人的肝癌(HCC)和胃腸道癌(GI)細胞系中，TP73基因的表達就是通過DNA甲基化來激活的，當TP73基因啟動子區DNA未甲基化時，轉錄因子CTCF和p53與TP73啟動子不結合，TP73基因的轉錄受到抑制；當TP73基因啟動子區DNA發生甲基化后，CTCF和p53可以與之結合，從而激活TP73基因的表達[46]。研究發現，FoxA2基因啟動子區DNA未甲基化時，Polycomb Group (PcG)蛋白作為轉錄抑制復合物可與FoxA2啟動子區結合，引起FoxA2啟動子區組蛋白H3K27 me3修飾，進而抑制FoxA2啟動子活性與基因表達；當FoxA2基因啟動子區DNA發生甲基化后，阻礙了PcG蛋白與FoxA2啟動子的結合，解除了PcG蛋白對FoxA2基因轉錄的抑制作用，使FoxA2表達水平增加[47]。類似的研究發現，RHOC基因啟動子區DNA未甲基化時，轉錄因子KLF4與RHOC啟動子不結合，RHOC啟動子處于高度濃縮狀態，RHOC基因的轉錄受到抑制；當RHOC基因啟動子區DNA發生甲基化后，KLF4可以與之結合，引起RHOC啟動子區的染色質發生重塑，染色質由原來高度濃縮的狀態變為疏松且開放的狀態，從而激活RHOC基因的表達[48]。因此，推測高脂系肉雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動子R2和R3區域的高甲基化可能改變了某些轉錄因子與該區域的結合，影響了該區域組蛋白的修飾水平，增強了染色質可及性，進而促進了TCF21基因的表達，但具體機制有待進一步研究。

本研究在分析雞前脂肪細胞中DNA甲基化是否影響TCF21基因啟動子的轉錄活性時發現，雞TCF21基因啟動子R2區域和R2+R3區域的DNA高甲基化導致了報告基因活性的顯著降低，而雞TCF21基因啟動子R3區域的DNA高甲基化沒有改變報告基因活性(圖7B)。這一結果與雞腹部脂肪組織中TCF21基因啟動子R2、R3、R2+R3區域的DNA甲基化水平與TCF21基因mRNA表達水平呈顯著正相關的結果并不一致，分析其原因可能有4個：1)兩個試驗所用的試驗材料不同。檢測TCF21基因啟動子區DNA甲基化水平及mRNA表達水平時所用的試驗材料為雞脂肪組織，而檢測DNA甲基化對TCF21基因啟動子的轉錄活性的影響時所用的試驗材料為雞前脂肪細胞(ICP1細胞)。脂肪組織除了包含成熟脂肪細胞和前脂肪細胞外，還含有成纖維細胞、血管內皮細胞和多種免疫細胞[49]，而ICP1細胞是單純的前脂肪細胞。2)兩個試驗中，TCF21基因啟動子DNA所處環境不同。脂肪組織中TCF21基因的啟動子是由組蛋白包裹的DNA片段，而在熒光素酶報告基因載體中，TCF21基因的啟動子是裸露的DNA片段。3)TCF21基因在雞脂肪組織中可能受增強子的調控，而本研究在構建熒光素酶報告基因時只是連接了雞TCF21基因的啟動子，并沒有連接增強子到報告基因載體中。4)兩個試驗中，TCF21基因啟動子的DNA甲基化模式不同。體內脂肪組織中TCF21啟動子區CpG位點的甲基化狀態受DNA甲基轉移酶、DNA去甲基化酶等表觀修飾因子的動態調控，而體外DNA甲基轉移酶處理報告基因質粒是對TCF21啟動子區的CpG位點進行強行甲基化，這與體內脂肪組織中TCF21基因的甲基化模式是不一樣的。

有研究表明，CpG位點的甲基化會影響DNA序列與轉錄因子的結合狀態，進而影響基因的表達[50-52]。本項研究報告基因結果顯示，雞TCF21基因啟動子R2區域及R2+R3區域的DNA甲基化會抑制其轉錄活性，而無論是R3區域單獨存在還是與R2區域共同存在，R3區域的DNA甲基化均不會影響其轉錄活性(圖7B、7C)。因此，本研究將目光聚焦在了TCF21基因啟動子的R2區域。將R2區域內潛在的轉錄因子(Pax2、Sox10、FOS、SPIB與FOXP3)與該區域內的與TCF21基因表達顯著相關的CpG位點(CpG_7和CpG_10)進行聯合分析發現CpG_7位于Pax2的結合位點內，提示CpG_7位點的甲基化可能通過改變轉錄因子Pax2與TCF21基因啟動子R2區域的結合來影響TCF21基因的轉錄。

綜上所述，組織水平的研究結果顯示TCF21基因啟動子R2和R3區域的DNA甲基化水平與其mRNA表達水平顯著相關；細胞水平的研究結果顯示TCF21基因啟動子R2區域的DNA甲基化會影響其轉錄活性，但R3區域的DNA甲基化對其轉錄活性沒有影響。

4 結 論

結合組織水平、細胞水平的研究結果，本研究表明：TCF21基因在7周齡高、低脂系肉雞腹部脂肪組織中的差異表達主要與其啟動子R2區域的DNA甲基化水平有關，但具體調控機制有待進一步深入的研究。