基于靶向代謝組學研究環形泰勒蟲對宿主細胞能量代謝的影響

李 霞，李 志，曹天行，殷 宏,3，羅建勛，關貴全,劉軍龍，趙洪喜*

(1.寧夏大學農學院，銀川 750021；2.中國農業科學院蘭州獸醫研究所/家畜疫病病原生物學國家重點實驗室/甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室，蘭州 730046)

環形泰勒蟲(Theileriaannulata)是由硬蜱傳播的、能夠感染牛科動物引發泰勒蟲病的一種血液原蟲，其裂殖體感染的宿主細胞可獲得類似腫瘤細胞樣的無限增殖能力，即細胞的永生化狀態[1-2]?？固├障x藥物布帕伐醌(BW720c)作用于轉化的細胞時，可終止細胞的永生化狀態并使細胞重新進入正常的凋亡程序。環形泰勒蟲通過劫持宿主信號通路、調節表觀遺傳因子和轉錄程序來誘導白細胞的Warburg效應幫助細胞轉化，但宿主細胞轉化的分子機制仍不清楚。Warburg效應主要與宿主的能量代謝相關。因此，研究BW720c對環形泰勒蟲轉化細胞能量代謝的影響，對于揭示細胞發生轉化的分子機制具有顯著意義。能量代謝與生物體的存活息息相關，通過基因組測序發現頂復門寄生蟲缺少參與三羧酸循環和β-氧化代途徑所需酶的基因序列[3]。因為缺少這些代謝酶，頂復門寄生蟲的能量代謝主要來源于糖酵解，在至少10個酶的作用下寄生蟲將從宿主獲得的己糖催化成丙酮酸。丙酮酸在后續的酶促反應下生成乙酰輔酶A或乳酸，脂肪酸的合成需要乙酰輔酶A作為原料。頂復門寄生蟲不但利用宿主細胞的脂肪酸，自身也存在脂肪酸的合成，但是不同種屬之間存在差異[4]。除了糖酵解外，頂質體也是頂復門寄生蟲能量來源的途徑。頂質體是除隱孢子蟲外的頂復門寄生蟲特有細胞器，參與蟲體新陳代謝[5]。目前的研究證明，頂質體是合成代謝的中樞，參與3條重要代謝途徑：2C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑、脂肪酸從頭合成途徑(FAS2)和血紅素合成途徑[7]。在瘧原蟲的研究中發現，膦胺霉素靶向MEP途徑的1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構酶(DXR)可使瘧原蟲死亡[6]。在剛地弓形蟲中，頂質體存在磷酸甘油酸酯變位酶(PGAM)、丙酮酸脫氫酶復合體[7]。在剛地弓形蟲入侵宿主時，其能量獲得依賴于糖酵解過程并且葡萄糖異生和糖酵解過程中PGAM是重要的催化酶，該酶也在弓形蟲能量代謝中參與碳水化合物轉運、新陳代謝調節[8]。靶向代謝組學通過對小分子代謝物的絕對定量，直觀反映藥物處理后細胞的能量代謝，有利于鑒定特征性代謝物，判斷感染細胞在藥物處理下的代謝狀態，闡明轉化發生的機制。本研究擬從靶向代謝組學的角度出發，以環形泰勒蟲感染細胞為模型，研究轉化細胞在BW720c處理下的代謝產物的變化，尋找環形泰勒蟲與宿主細胞相互作用的分子及其能量代謝變化，闡明環形泰勒蟲引起宿主細胞轉化的機制，為預防環形泰勒蟲感染提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

1.1.1 試驗材料 第17代環形泰勒蟲裂殖體感染的牛淋巴細胞系(由中國農業科學院蘭州獸醫研究所平臺-TDRC-22資助提供)。

1.1.2 主要試劑 BW720c和DMSO由中國農業科學院蘭州獸醫研究所提供。rI1640(Biological Industries)、硫酸慶大霉素注射液(8萬單位)、dimethyl sulfoxide(SIGMA)、Phosphate Buffered Saline(Biological Industries)、Foetal Bovine Serum(Biological Industries)、甲醇(Merck)、乙醇(Merck)、乙腈(Merck)、蒸餾水、牛谷氨酰胺(Gln)定量檢測試劑盒、乳酸(LA)含量檢測試劑盒及丙酮酸(PA)含量檢測試劑盒，均購自河南寶格生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器 細胞培養箱(Thermo)、湘儀離心機(Xiangyi Yi Centrifuge Instrument Co.,Ltd)、高速離心機(Eppendorf)、-80 ℃冰箱、可調式移液器、烘箱、酶標儀、Countstar自動細胞計數儀(上海睿鈺生物科技有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉化細胞系的復蘇和培養 將第17代環形泰勒蟲感染淋巴細胞放入37 ℃水中，1 000 r·min-1離心5 min。沉淀轉入10%胎牛血清、16 ng·μL-1慶大霉素的RPMI1640培養瓶，置于37 ℃含5% CO2的培養箱中培養。

1.2.2 BW720c作用細胞生長曲線的繪制及細胞處理[9-10]將培養好的轉化細胞設為DMSO對照組、處理組及空白對照組。細胞濃度設為1×105cells·mL-1,處理組加入DMSO配制的200 ng·mL-1的BW720c;在DMSO對照組中加入相同體積的DMSO;空白對照組加入相同體積的RPMI1640完全培養基。細胞放回培養箱中繼續培養，在12、24、36、48、60、72 h收集細胞，利用CountStar IC 1000軟件計算各個時間點的活細胞數，繪制細胞的生長曲線。在72 h收集DMSO對照組與藥物組細胞樣品，每組均有6個生物學重復。收集細胞之前進行細胞計數，保證細胞數量在1×107個細胞左右(數量相差控制在±2倍內)。從培養瓶中取出細胞懸液，裝入50 mL離心管；1 200 r·min-14 ℃離心5 min，去除上清；向細胞沉淀中加入1 mL PBS洗滌去除殘余培養液成分，混勻后轉入1.5 mL離心管，900 r·min-14 ℃離心3 min，離心后去除上清，重復3遍；將細胞沉淀立即放入液氮中浸泡，淬滅24 h后轉入-80 ℃冰箱保存備用。代謝組學檢測：-80 ℃冰箱中取出細胞樣本，冰上解凍后加入500 μL預冷的提取劑(80%的甲醇水溶液，含內標)，渦旋2 min；放入液氮中速凍5 min，冰上解凍5 min，渦旋2 min混勻，循環3次；12 000 r·min-14 ℃離心20 min；取上清液進行LC-MS/MS分析。

1.2.3 代謝物分析 利用軟件Analyst 1.6.3處理質譜數據，通過三重四極桿篩選特征離子得到離子信號強度(CPS)，MuLtiQuant軟件進行積分和校正，area代表物質相對含量。

1.2.4 多元統計分析及差異代謝物篩選及驗證 將歸一化后的數據矩陣導入R軟件(https://www.r-project.org/)，先采用無監督的主成分分析(principal component analysis，PCA)然后采用有監督的正交偏最小二乘判別分析使組間區分最大化，尋找差異代謝物。選取fold change≥2和fold change≤0.5，VIP≥1的代謝物為差異代謝物。

1.2.5 部分差異代謝物的驗證 應用購自河南寶格生物技術有限公司的試劑盒進行代謝物檢測。首先制備試劑盒的標準品，根據各個標準品濃度和吸光度制備標準曲線，并將細胞含量調到1×106個，后按照試劑盒操作步驟測量吸光度，根據標準曲線方式計算相應的含量。并用PraghPad Prism 8軟件繪制標準曲線及含量。

2 結 果

2.1 BW720c處理后細胞生長曲線的繪制

CountStar IC 1000軟件計算活細胞數獲得轉化細胞生長曲線(圖1)；發現，試驗組與對照組相比，24 h內細胞數沒有明顯差異，36 h以后試驗組的細胞生長速度明顯低于對照組，72 h組間的差異最大。表明BW720c對轉化細胞的增殖有顯著抑制，這為后續能量代謝檢測提供了依據。

圖1 BW720c作用后環形泰勒蟲(TA)轉化細胞生長曲線Fig.1 Growth curve of T. annulta (TA)transformed cells treated with BW720c

2.2 代謝物總離子圖分析與代謝物鑒定

對兩組細胞樣品的總離子流圖(TIC圖)進行可視化檢查(圖2)，樣品儀器分析信號強、峰容積大且保留時間重復性好。將檢測到的質譜結果與MWDB(metware database)對比，共鑒定出49種代謝物。為了進一步篩選2組間的差異代謝物，采用多元統計方法獲得能量代謝的特征性代謝物。

A.MRM代謝物檢測多峰圖；B.混樣樣品質譜分析總離子流圖A.MRM metabolite detection multi-peak diagram；B.Total ion flow diagram of mixed sample quality spectrum analysis圖2 基于MRM分析獲得的細胞總離子流圖Fig.2 A total ion chromatograms(TIC)of cells analyzed by MRM

2.3 多元統計分析

2.3.1 PCA分析 本研究通過對2種細胞樣品進行PCA分析，獲得擬合較好的PCA模型。兩個主成分占總方差的80.79%，其中第一主成分(PC1)的解釋率為61.91%；第二主成分(PC2)的解釋率為18.88%?？刂平M細胞(Tacon)6個樣品均在第一主成分原點的左側，處理組細胞(BW720c)6個樣品在第一主成分原點的右側，說明2種細胞樣品在能量代謝方面的代謝物組成上有明顯差異(圖3)。

Tacon.控制組；BW720c.藥物處理組；PC1.第一主成分；PC2.第一主成分；百分比表示所占的解釋率Tacon.Control group;BW720c.Treatment group;PC1.The first principal component；PC2.The second principal component;Percentage represents explained rate圖3 2組樣品PCA得分Fig.3 PCA score plot of the two groups

2.3.2 OPLS-DA分析 為了消除不相關的噪音信息，建立了OPLS-DA模型進一步分析空白對照組與處理細胞代謝模式的變化。OPLS-DA模型中BW720c組主要分布在原點的左邊部分，Tacon組分布在原點的右側部分，2組樣品在坐標軸上離散度較好(圖4)。

圖4 2組樣品OPLS-DA得分圖Fig.4 OPLS-DA scores plot for two groups

置換檢驗結果發現(圖5)，OPLS-DA模型有兩個主成分，其中R2X=0.837，R2Y=0.998,Q2=0.994，R2X表示變量X的總變異，目的是為了分析模型的優化程度；R2Y和Q2分別表示模型的解釋率和預測的準確度，值越是接近1表明該模型越理想，對樣本具有很好的解釋率和預測率。參數>0.5顯示模型擬合較好，Q2和R2Y的P值均<0.005，表明置換檢驗(permutation test)中沒有隨機分組模型強于此次模型，因此本研究建立的OPLS-DA模型可以說明對照組與處理組之間差異變化。

圖5 2組樣品的OPLS-DA驗證Fig.5 Permutation test of OPLS-DA model for two groups

2.3.3 差異代謝物篩選 以“1.2.4”的標準篩選差異代謝物。2組樣品共篩出21種差異代謝物(表1)，選出的差異代謝物即是組間分離的標志變量。處理組與對照組相比，有13個差異代謝物下調，8個上調(圖6)。主要包括氨基酸、核苷酸、有機酸以及酶類等能量代謝物質。BW720c處理可降低感染細胞L-乳酸、果糖1,6二磷酸、丙酮酸、異檸檬酸、乙酰輔酶A等成分的含量，并上調L-絲氨酸、L-天冬酰胺、谷氨酰胺、IMP、L-天冬氨酸等。糖酵解及三羧酸循環相關的差異代謝物見圖7。

Down.下調的代謝物；Up.上調的代謝物;Insignificant.沒有變化的代謝物Down.Down-regulated metabolites；Up:Up-regulated metabolites；Insignificant.Metabolites without change圖6 差異代謝物火山圖Fig.6 Volcano map of differential metabolites

1)己糖激酶或葡萄糖激酶；2)磷酸果糖激酶；3)磷酸甘油酸變位酶；4)丙酮酸激酶；5)丙酮酸脫氫酶系1)Hexokinase/glucokinase;2)Phosphofructokinase;3)Phosphoglyceromutase:4)Pyruvate kinase:5)Pyruvate dehydrogenase complex圖7 糖酵解及三羧酸循環的差異代謝物Fig.7 Differential metabolites in glycolysis and tricarboxylic acid cycle

表1 Tacon與BW720c組間的差異代謝物Table 1 Differential metabolites between Tacon group and BW720c group

2.3.4 部分差異代謝物的驗證 對篩選到的谷氨酰胺、丙酮酸及乳酸進行驗證。首先收集藥物處理組細胞及對照組細胞，細胞的含量要達到1×106cells·mL-1。收集的細胞用預冷的PBS洗滌3次，然后分別按照試劑盒說明書進行代謝物的含量測定。依據檢測時的標準品濃度及吸光度值(OD)，用Graphad Prim 8軟件，采用四參數Logistic曲線擬合(4-p1)繪制標準曲線方程(圖8)。然后根據各自的標準曲線計算對照組、藥物處理組細胞中谷氨酰胺、丙酮酸、乳酸的含量。谷氨酰胺的標準曲線方程為Y=691.0X-192.3，相關系數R2為0.999 5；丙酮酸的標準曲線為Y=0.019 60X+0.020 10，相關系數為R2為0.999 8；乳酸的標準曲線為Y=0.331 9X+0.014 41，相關系數為0.997 2。所建標準曲線的相關系數均大于0.99，表明線性關系良好。根據標準曲線及試劑盒的含量計算公式可知每1×104個處理組細胞的谷氨酰胺含量為66.85 μmol·L-1，對照組中的含量為4.36 μmol·L-1；每1×106個處理組細胞的乳酸含量為0.4 μmol·mL-1，對照組中的含量為1.2 μmol·mL-1；處理組細胞的丙酮酸含量為44 μg·104cells-1，對照組的丙酮酸含量為74 μg·104cells-1。驗證的代謝物含量處理組與對照細組的變化趨勢與靶向代謝組學檢測是一致的。

圖8 差異代謝物含量及標準曲線Fig.8 Differential metabolites content and standard curve

3 討 論

3.1 BW720c處理對感染細胞氨基酸代謝的影響

環形泰勒蟲感染可造成細胞的無限增殖，代謝重編程是其重要特征。腫瘤細胞發生代謝重編程是細胞無限增殖和侵襲的先決條件[11]。代謝重編程可滿足細胞異常增殖和高能量需求。甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝以及天冬氨酸和谷氨酸代謝通路在感染細胞中是異常的，藥物處理組(BW720c)L-絲氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、谷氨酰胺及賴氨酸是上調的。谷氨酰胺與葡萄糖都是癌細胞使用的主要營養物質[12]，谷氨酰胺作為氮供體是核苷酸生物合成所必需的。此外谷氨酰胺作為碳源支持癌細胞能量代謝，一旦缺乏會造成癌細胞的死亡，在各類癌癥中均觀察到此現象[13,16]。環形泰勒蟲感染細胞的代謝模式類似于腫瘤細胞，根據代謝組數據分析結果，環形泰勒蟲轉化細胞也是以谷氨酰胺作為能量來源的，轉化細胞的代謝重編程實現了對谷氨酰胺的有效利用。谷氨酰胺酶是癌癥治療的有效靶點[17-18]，谷氨酰胺酶將谷氨酰胺轉化為谷氨酸，谷氨酸進一步轉變為α-酮戊二酸進入三羧酸循環，在藥物處理后三羧酸循環受到抑制谷氨酰胺消耗減少，相對于對照組(Tacon)其含量上升，因此懷疑BW720c的有效靶點之一是谷氨酰胺酶。并用谷氨酰胺試劑盒檢測時也發現在藥物處理組中谷氨酰胺也是上調的，因此也驗證了把谷氨酰胺酶作為進一步的研究對象的猜想。Zhang等[19]發現膠質母細胞瘤中天冬酰胺的生成途徑可以挽救谷氨酰胺缺乏下的細胞生存。天冬酰胺在藥物處理之后上調，也說明感染細胞中天冬酰胺可能因谷氨酰胺減少而加速自身合成速度來挽救細胞凋亡。癌細胞中的谷氨酰胺還可以維持氧化還原狀態，調控糖脂代謝。谷氨酰胺通過谷氨酰胺轉運體進入細胞內，LAT2是溶質載體家族成員，Feng等[20]發現，LAT2能調節谷氨酰胺依賴的回補調節，因此說明LAT2參與轉化細胞的能量代謝，可以作為研究轉化機制的新靶點。

3.2 BW720c處理對感染細胞糖酵解代謝的影響

Warburg[21]指出腫瘤細胞的能量代謝來源是糖酵解，糖酵解產生大量的乳酸。糖酵解途徑的異?；钴S使得葡萄糖代謝改變以及利用率增加，與正常細胞相比，有氧條件下腫瘤細胞的糖酵解途徑可提供的ATP占總量的50%～60%[22]。核酸、脂質及蛋白質的合成與葡萄糖代謝有關，葡萄糖的攝取依靠細胞膜葡萄糖轉運蛋白。Duan等[23]研究表明，葡萄糖向天冬氨酸轉化是腫瘤生長的限制性代謝途徑。天冬氨酸是線粒體呼吸的關鍵產物，葡萄糖轉運蛋白的失活或抑制可阻止天冬氨酸的產生。在藥物處理組中天冬氨酸是上調的，推測環形泰勒蟲感染細胞可能有額外的調控機制控制天冬氨酸的生成，如果BW720c的作用也是抑制葡萄糖轉運蛋白或使其失活，那么天冬氨酸在藥物處理組中應該是下調的，而不是上升，這與研究結果不相符合。糖酵解途徑的最后一步磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的催化下生成丙酮酸，Marsolier等[24]研究發現，環形泰勒蟲分泌的Pin1異構酶可以穩定宿主的2型丙酮酸激酶(PKM2)，使宿主細胞代謝重編程。PKM2在哺乳動物中高度保守，與細胞合成代謝相關，在腫瘤細胞中有表達[25]，表達PKM2的腫瘤細胞在組織培養和作為異種移植物在小鼠中具備更快的增殖速度[26]。本研究中，丙酮酸與乳酸是下調的，而磷酸烯醇式丙酮酸沒有變化，因此推測PKM2的活性被抑制，這也與Marsolier的研究結果一致。在用試劑盒驗證時發現在藥物處理組中丙酮酸也是下調的，但是Pin1異構酶怎樣引起宿主細胞代謝通路改變尚不清楚。Luo等[27]發現PKM2通過結合癌細胞和活化的巨噬細胞中的HIF-1α轉錄因子，從而反式激活基因表達。HIF-1α、PKM2及脯氨酰羥化酶結構域3(PHD3)結合可以使PKM2正向調節葡萄糖轉運蛋白1(GLUT1)、PHD3和LDHA等HIF-1α的靶基因表達。Metheni等[28]提出HIF-1α誘導促進了泰勒蟲轉化細胞的致瘤特性。本研究中如果GLUT1活性抑制，藥物處理細胞對葡萄糖的利用率降低，轉化細胞失去能量來源細胞凋亡。宿主細胞中PKM2的變化仍然不清楚，上下游通路中分子機制也不清楚,還有待進一步的研究來闡明作用機制。

3.3 BW720c處理對感染細胞三羧酸代謝的影響

Warburg[21]認為腫瘤細胞從線粒體呼吸到有氧糖酵解的改變，可能是線粒體受損的結果。然而，Weinhouse[29]通過同位素標記發現線粒體氧化磷酸化產生的二氧化碳的數量在癌細胞中與正常細胞的一樣，現在人們也發現Warburg效應伴隨葡萄糖轉化為乳酸含量增加碳進入三羧酸循環速度減慢。本研究中，藥物處理組三羧酸循環中的蘋果酸、異檸檬酸和延胡索酸是下調的，但這些代謝物是在藥物作用下通過何種途徑下調，機制還不清楚。SIRT3參與線粒體參與氧化應激與能量代謝并調節癌癥發病過程，通過調節線粒體穩態防止細胞轉化和細胞衰老[30]。在各種惡性腫瘤中SIRT3是低表達的，其作為腫瘤抑制基因發揮作用。延胡索酸可參與SIRT3對HIF-1α信號通路的調節。因此，作者推測BW720c與隱丹參酮一樣使SIRT3的表達降低。在藥物處理轉化細胞中低表達量的延胡索酸影響SIRT3的表達量，最終使HIF-1α信號通路抑制，但是延胡索酸與SIRT3是如何協調發揮作用的還有待進一步研究。馮儉等[31]也報道了丹參能增加缺氧細胞的氧分壓從而抑制HIF-1α表達以阻止腫瘤血管生成和腫瘤細胞的增殖，因此，可以設計靶向SIRT3的分子，探索轉化發生機制。

4 結 論

環形泰勒蟲轉化細胞在BW720C藥物處理下代謝狀態發生顯著變化，基于LC-MS/MS代謝組學方法可以全面地篩選出藥物處理后影響轉化的差異代謝；通過分析這些差異代謝物的代謝途徑，可以初步分析轉化發生的機制，同時也為人類癌癥的治療提供新方法。