細菌抗噬菌體感染主動免疫機制的研究進展

朱 丹，王 英，文 豪，邢 坤，林思楊

（四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041）

1 概述

噬菌體（Phage）作為病毒的一種，可特異性“捕食”細菌。根據噬菌體是否導致細菌死亡，可分為溫和性噬菌體和烈性噬菌體。噬菌體作為抗生素的替代品之一，具有制備工藝簡單、高特異性和不受細菌耐藥性影響等優點［1］。目前噬菌體已廣泛應用于畜禽養殖中，特別是在家禽養殖中用于預防和控制大腸桿菌、沙門氏菌和空腸彎曲桿菌等細菌感染。但細菌會針對噬菌體的感染進化出自我防御機制，自我防御機制可以分為兩大類，分別為被動免疫及主動免疫。被動免疫主要是通過細菌的莢膜、生物膜等外部結構或者次級代謝產物來抵御噬菌體的侵蝕，而主動免疫機制較為復雜，本文就細菌抗噬菌體感染的主動免疫機制進行介紹，為今后開發和應用噬菌體制劑提供理論參考。

2 主動免疫機制

2.1 阻止噬菌體吸附 在噬菌體侵染過程中，噬菌體的受體結合蛋白通過特異性識別細菌的脂多糖、莢膜多糖以及外膜蛋白等受體完成吸附，而細菌通過改變表面受體的結構或構象等方式，有效限制噬菌體的吸附。如鼠疫耶爾森菌的合成脂多糖相關基因會自發突變，導致該菌產生對多種噬菌體的抗性。還有一些細菌可利用產生的“柵欄”來干擾噬菌體對受體的辨別，如大腸桿菌K1的莢膜能有效阻止噬菌體T7 吸附脂多糖。此外，細菌還能通過結合外環境中的小分子封閉噬菌體結合位點來阻止噬菌體吸附。

2.2 抑制噬菌體DNA 侵入 超感染排除系統（Sie）是細菌防止噬菌體DNA 入侵菌體的“首道屏障”。以大腸桿菌的Sie系統為例，Sie系統是由Imm 和Sp 蛋白的Imm 系統和Sp 系統組成。Imm系統和Sp 系統能阻止DNA 侵入細菌，防止噬菌體的進一步感染。其中，Imm 系統中兩個位于細胞膜的特殊跨膜區域可在噬菌體DNA 侵入時發生構象改變，但Imm系統須在其他膜蛋白的協同作用下發揮對噬菌體的抑制作用。噬菌體T4 溶菌酶通過降解細胞壁肽聚糖形成空洞，讓噬菌體DNA 侵入細菌［2］，而Sp 蛋白可通過抑制T4 溶菌酶的活性來防止肽聚糖層的降解。

2.3 阻斷或干擾噬菌體DNA復制

2.3.1 限制-修飾系統 限制-修飾系統（RM）存在于75%的原核生物基因組中，許多DNA甲基化轉移酶是一些限制性-修飾基因系統的成分［3］。RM 系統可阻止噬菌體DNA 進入，從而使細菌能夠抵抗噬菌體感染。此功能主要取決于噬菌體是否含有RM 系統基因編碼產物的識別序列，與噬菌體的類別沒有絕對的聯系。EcoRII 甲基轉移酶（M.EcoRII）屬于Ⅱ型限制-修飾系統，可以對DNA序列甲基化，并抑制EcoRII核酸內切酶對該DNA 序列進行切割。當EcoRII RM 基因復合體受到擾亂以后，其甲基化轉移酶不能發揮正常的修飾作用，從而導致限制酶對自身DNA 序列酶切，最終基因組被破壞，導致細菌死亡。

天藍色鏈霉菌中還存在另外一種RM 系統，噬菌體生長限制（Pgl）系統。該系統主要針對類似φC31 噬菌體等溫和性噬菌體，由DNA 甲基轉移酶PglX、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PglW、ATPase酶PglY、堿性磷酸酶家族PglZ 4 種蛋白組成［4］。在未被噬菌體感染的細菌中，PglX與PglZ類似于毒素/抗毒素系統，PglZ 能夠抑制PglX 的活性［5］。Pgl＋鏈霉菌被噬菌體φC31 感染時，PglW 通過磷酸化作用將信號傳遞給其他Pgl 蛋白，激活PglX DNA甲基化酶作用［6］。

2.3.2 CRISPR-Cas 系統 細菌CRISPR-Cas 系統由具有典型間隔短回文重復單元（CRISPR）和分布在操縱子區域的多種Cas 基因組成。CRISPR 單元主要位于細菌染色質上，由富含AT的前導序列（Leader sequence）、高度保守的重復序列（repeats，21-48 bp）和間隔序列（Spacer）組成。在CRISPR 位點附近，存在4～10 個保守的CRISPR 相 關（CRISPR-associated，Cas）基 因。CRISPR-Cas 系統作為細菌特有的主動免疫系統，可特異性抵抗外源基因的入侵［7］。CRISPRCas 系統作為細菌的主動免疫系統，不但具有可遺傳性，還具有與真核免疫細胞類似的特異性和記憶性。

2.3.3 BREX 系統 噬菌體排除系統（BREX）首次發現于蠟樣芽孢桿菌中，約10%細菌基因中具有該系統，該系統位于基因組的防御島上。BREX 系統一般在噬菌體感染后期發揮作用，具有與Pgl系統中相同的同源物——甲基化酶PglX和堿性磷酸酶PglZ。與Pgl系統不同，BREX系統通過m6A DNA腺嘌呤甲基化酶使細菌基因組中的非回文TAGGAG 序列甲基化，而噬菌體DNA不會甲基化［8］。BREX系統僅抑制噬菌體DNA復制和繁殖，不會降解噬菌體DNA。

2.3.4 DISARM 系統 DISARM 系統是一種新型抗噬菌體防御系統，它能預防來自有尾雙鏈DNA噬菌體的感染。構成DISARM系統的核心基因是解旋酶基因（drmA）、DUF1998（pfam0939）結構域基因（drmB）和PLD（磷脂酶D）結構域編碼基因（drmC）。DISARM 系統分為I 型和II 型。除3 個核心基因外，I 型包括2 個基因，分別為腺嘌呤甲基化酶基因（drmMI）、SNF2 家族解旋酶基因（drmD）；而II 型也包含2 個基因，分別為胞嘧啶甲基化酶基因（drmII）、某個功能未知的基因。Ofir 等［9］在不含II 型DISARM 系統的枯草芽孢桿菌中導入該系統后，發現導入該系統的枯草芽孢桿菌具備了抗多種雙鏈DNA 噬菌體的能力。進一步研究發現，該系統不僅能限制性切割噬菌體DNA，還可以甲基化修飾細菌DNA 的CCWGG（W＝A/T）序列。

2.4 流產感染機制 流產感染（Abi），也被叫做噬菌體排斥，一般發生在噬菌體DNA侵入細菌之后，細菌通過自身死亡的方式阻止噬菌體的進一步繁殖與釋放。毒素-抗毒素機制是一種典型的流產感染機制，毒素-抗毒素系統（TA）位于質粒、整合性結合元件、轉座子等可移動遺傳元件上。按照抗毒素的生化特征，TA 主要分為兩種：I 型TA 系統抗毒素是小RNA，可以干擾毒素基因的表達［10］；II型TA系統抗毒素是小的且穩定性較差的蛋白質，可以與毒素蛋白形成復合體，使毒素蛋白處于非活性狀態。該系統與大量的細胞功能有關，包括程序化細胞死亡、可移動遺傳元件、抗生素耐藥性等［11］。細菌具有多種TA 系統，但不同菌株分布的種類有很大差異，可能是通過水平轉移方式進行轉移。其之所以可以進化成功，很可能是因為質粒編碼TA 系統具有“分離后致死效應”［12］。近幾十年來，隨著TA 位點越來越多的發現，調控細菌生存和適應的策略將被揭示。

除了TA系統外，研究還發現環狀GMP-AMP合酶（cGAS）防御系統也屬于流產感染機制的一種。cGAS-STING途徑是動物細胞自主先天免疫系統的核心組成部分。cGAS 蛋白是細胞質病毒DNA 的傳感器，在檢測到DNA 時，產生環狀GMP-AMP 信號分子，該分子結合STING 蛋白并激活免疫應答［13］。

3 展望和分析

在細菌免疫系統中，不同免疫機制相互協調，共同維持細菌穩態。RM 系統、CRISPR-Cas系統、BREX 系統、DISARM 系統構成了防御噬菌體感染的胞內第一道防線，限制了噬菌體DNA和質粒等移動遺傳元件的有效性，阻止噬菌體的繁殖，保護單個細菌不被感染。若噬菌體突破了宿主防御的第一道防線，細菌也可通過Abi 系統誘發死亡，中斷噬菌體繁殖過程，限制噬菌體擴散，以“犧牲小我”的形式保護群體不被滅絕。除了上述機制之外，在細菌的防御島上還發現多個抗噬菌體系統相關基因，但其具體的作用機制仍然不清楚。細菌利用不同免疫機制抵御噬菌體感染，一旦了解細菌免疫噬菌體的機制，臨床上就可以通過人工改造或修飾噬菌體的關鍵分子或蛋白，達到免疫逃逸的目的，有助于噬菌體制劑的開發和應用。