右歸丸干預相關疾病的分子信號通路研究進展

魯莎 譚從娥

右歸丸源自于中醫經典《景岳全書》中的補腎名方，以“益火之源”培右腎元陽為制方根本，以“陰中求陽”為立方理論[1]。該方由熟地黃、山藥、山茱萸、枸杞子、鹿角膠、菟絲子、杜仲、當歸、肉桂、制附子十味中藥組成，方中肉桂、附子與鹿角膠合用溫補腎陽、填精益髓，熟地黃、山茱萸、山藥、菟絲子、枸杞子、杜仲合用滋腎陰、補肝脾，當歸養肝補血，十藥合用溫補腎陽，補血填精[2]。現代藥理研究發現右歸丸具有調節免疫功能、骨代謝、神經系統等多方面作用，在臨床上治療膝骨關節炎、卵巢早衰、骨質疏松等疾病效果顯著[3]。右歸丸的臨床療效雖已得到證實，然其療效機制目前仍未完全闡明。信號通路是細胞信息傳遞及其功能發揮的基本途徑，研究證明右歸丸可能通過調控某些特定功能的分子通路而發揮治療作用。因此，本文對近年來右歸丸具有調控作用的主要分子信號通路進行綜述。

1 核轉錄因子相關通路

核轉錄因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)是在B淋巴細胞中發現的核轉錄因子，因為它與免疫球蛋白κ輕鏈的增強子B序列特異性結合并促進表達而得名。NF-κB通常與抑制蛋白IKB結合成三聚體復合物，存在于未受刺激的細胞質中，可以迅速釋放進人細胞核而不需要重新合成蛋白。該轉錄因子由Rel蛋白家族不同成員組成，如p65蛋白 (RelA)、p50蛋白、p52蛋白、c-Rel蛋白和RelB蛋白等，可激活參與應激反應、炎癥和程序性細胞死亡(凋亡)的多種基因。NF-κB/IKB復合體被磷酸化和泛素化后，NF-κB暴露出其核定位序列并從細胞質中進入到細胞核中，與核內DNA上的特異性序列相結合，繼而啟動或增強相關基因的轉錄[4]。NF-κB轉錄因子控制著影響免疫反應的基因表達[5]。研究發現，右歸丸對腎陽虛證的調控與NF-κB信號通路相關。譚從娥等[6]研究發現腎陽虛證引起的免疫紊亂狀態患者服用右歸丸治療后，其在Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)介導的髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)/NF-κB信號通路中，MyD88,NF-κB的mRNA表達明顯上調，證明右歸丸通過該通路糾正腎陽虛證免疫紊亂狀態。

NF-κB通路同時也是一種促炎通路，主要基于NF-κB在促炎基因表達中的作用，包括細胞因子、趨化因子、黏附分子[7]。白細胞介素-6(interleukin-6 ，IL-6)和基質金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinase，MMPs)在磷脂酰肌醇激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinases B,PKB/Akt)/NF-κB信號通路中可能作為該通路的下游調控分子，與炎癥反應有關[8]。動物實驗表明，右歸丸可抑制膝骨關節炎大鼠炎癥反應，表現為降低PI3K/Akt/NF-κB信號通路中的PI3K和pAkt及MMP-14蛋白和IL-6的表達，從而改善膝骨關節炎病變[9]。右歸丸還可通過干預NF-κB/SREBPs通路減少炎癥因子釋放，表現為抑制血清中白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的炎性因子含量，使主動脈組織 TLR4、NF-κB p65、膽固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding protein，SREBP)-1c和三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)mRNA的表達下降[10]。此外，在右歸丸含藥血清干預經脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的單核細胞(THP-1)源性泡沫細胞制備的高膽固醇模型中，發現右歸丸可能通過抑制NF-κB通路中NF-κB 、p65和SREBP-1c的表達調節血脂，并且通過降低炎癥因子的釋放預防動脈粥樣硬化[11]。

上述研究表明右歸丸通過增強NF-κB通路免疫基因的轉錄調控腎陽虛證免疫功能，抑制該通路的促炎基因表達減少炎癥因子釋放緩解炎癥反應。表明右歸丸在NF-κB通路存在雙向調節作用，且在緩解炎癥反應方面是通過多條通道發揮療效，展現了右歸丸多靶點、多通道的特點，提示右歸丸可能對NF-κB通路相關免疫類、炎癥類的疾病發揮治療作用。

2 WNT/β-Catenin經典信號通路

WNT是一類高度不溶蛋白，其通過與細胞膜上的受體結合繼而引發下游一系列信號轉導。WNT通路分為β-Catenin蛋白依賴性經典通路和非依賴性通路(本文主要介紹經典通路)[12]。該通路控制著大量與生長和代謝相關的基因表達，同時，WNT通路與小腸組織穩定性、毛囊發生、骨密度、造血干細胞分化等生理功能有密切關系[13]。

在WNT/β-Catenin經典通路中，WNT蛋白與受體結合，膜上信號通過Dsh蛋白解體APC蛋白，β-Catenin的濃度不斷升高，進入細胞核，啟動下游基因轉錄[14]。經典的 WNT/β-Catenin通路被認為與成骨細胞的形成有關[13]，成骨細胞功能下降是導致骨質疏松癥的主要病理基礎[15]。近年研究發現，右歸丸通過干預WNT/β-Catenin通路提高成骨細胞功能達到治療骨質疏松癥的作用。如章建華[16]等對腎陽虛證骨質疏松癥大鼠服用右歸丸藥液，發現右歸丸含藥血清組相較空白血清組可增強細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)1/2、WNT/β-catenin信號通路相關因子β-catenin、ERK1蛋白、ERK2蛋白的表達進而促進成骨細胞增殖；李玲慧等[17]研究發現右歸丸可以使糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3β)表達水平降低、β-Catenin表達水平升高，激活WNT/β-Catenin通路，提高成骨細胞分泌ALP蛋白的能力；付小衛等[18]研究表明右歸丸可以激活WNT/β-Catenin通路調控成骨細胞發育、分化和增值。但目前對右歸丸干預WNT/β-Catenin通路治療骨質疏松癥發揮的作用認識尚淺，與之相關的具體下游機制尚未闡明，今后需加強WNT/β-Catenin通路的右歸丸基礎和臨床研究。

此外，有研究發現WNT經典通路異常激活有可能是導致膝骨關節炎滑膜損傷、軟骨破壞的主要原因，而右歸丸可以抑制WNT經典通路中的WNT1-誘導信號通路蛋白-1 (WNT1-inducible signaling pathway protein 1,WISP1)、WNT1、β-catenin和低密度脂蛋白受體相關蛋白5(lowdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein5，LRP5)mRNA的蛋白質表達從而緩解減輕膝骨關節炎的病變[19]。有文獻報道，WNT/β-Catenin通路具有抗炎和促炎功能，該功能是由于抑制或增強NF-κB通路[20]。研究人員在膝骨關節炎模型鼠軟骨組織中發現信號傳導及轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)和IL-6表達明顯上升，經右歸丸干預后STAT3和IL-6的表達明顯降低[21]。而IL-6為NF-κB的下游調控分子并與炎癥反應有關[8]。本篇第一節已詳細闡述右歸丸通過干預NF-κB通路減少炎癥反應，結合上述兩項研究表明右歸丸治療膝骨關節炎是通過WNT/β-Catenin通路和NF-κB通路共同發揮作用，但二者的關聯研究目前尚無進展。

3 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶相關通路

3.1 絲裂原活化蛋白激酶信號通路

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一類能被不同細胞外信號如神經遞質、細胞因子、激素等刺激的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，MAPK的激活是以三級激酶的形式進行，MAPKKK、MAPkk、和MAPK依次磷酸化激活，MAPK進而進入核內參與介導細胞生長、發育、分裂和分化等多種生理病理過程[22]。 JNK蛋白和P38蛋白同屬于MAPK家族，但來自于不同的激活途徑，JNK/P38通路與許多病理條件相關，包括癌癥、中風和炎癥性疾病等，所以抑制JNK/P38的藥物可能對治療有積極作用[23]。近年研究中發現，右歸丸對于MAPK通路的調控存在雙向調節的作用，并且主要集中在JNK/P38途徑。NADPH氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4,NOX4)是腎臟活性氧(reactive oxygen species,ROS)的關鍵調節因子之一，受NOX4調控的ROS、P38/MAPK在激素抵抗型腎病綜合征(steroid-resistant nephrotic syndrome,SRNS)患者腎小球中的表達水平較高[24]。王新斌[25]等建立SRNS大鼠給予右歸丸治療發現大鼠腎組織中JNK、P38蛋白磷酸化水平明顯降低，而模型組大鼠腎組織的JNK、P38蛋白磷酸化水平明顯升高，提示右歸丸通過抑制JNK/P38信號通路達到治療SRNS作用。此外，在對右歸丸干預慢性腎功能大鼠的實驗中發現，右歸丸可降低P38磷酸化水平，抑制細胞凋亡保護腎功能；同時可使MAPkk磷酸化水平升高，激活迷走神經，使交感神經活性相對降低繼而抑制左心室肥厚[26]。綜上右歸丸在MAPK通路中的雙向調節作用可能是由于增強或抑制MAPK家族不同亞族，并為JNK/P38途徑相關的疾病治療提供新選擇，其具體機制有待進一步研究。

3.2 雷帕霉素靶蛋白信號通路

雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于P13K激酶家族，參與mTORC1和mTORC2兩種多亞基蛋白復合物。mTOR是該通路的重要細胞信號中樞，其上游有多條通路匯聚到mTOR調控下游分子，包括生長控制、蛋白質合成、基因表達和代謝平衡[27-28]。收集近年文獻研究發現右歸丸干預mTOR通路主要表現在兩個方面，一是激活mTOR蛋白發揮抗抑郁效應和促進成骨細胞形成；二是抑制mTOR蛋白治療慢性關節退行性疾病。孕酮是mTOR通路在海馬體的重要調節因子[29]，而抑郁癥與海馬體的減少有關[30]。研究發現通過對抑郁模型大鼠海馬腦區自噬水平觀察、選用糖水偏好率作為指標，發現右歸丸給藥組的糖水偏好率較模型組顯著升高且海馬CA3區LC3蛋白免疫熒光強度較模型組減弱[31]。這是由于右歸丸可以增強AKT、mTOR1蛋白磷酸化水平激活mTOR通路，從而對抑郁癥模型大鼠發揮抗抑郁效應有積極作用[32]。另有研究發現腺苷酸活化蛋白激酶(AMPactivated proteinkinase，AMPK)/mTOR信號通路中AMPK蛋白異常激活導致mTOR蛋白異常抑制，是絕經后骨質疏松癥大鼠的機制之一；右歸丸通過減少AMPKα基因與磷酸化的p-AMPKα蛋白表達、增加mTOR基因和磷酸化的p-mTOR蛋白表達干預AMPK/mTOR信號通路促進成骨細胞形成[33-34]。此外，骨關節炎是一種常見的慢性關節退行性疾病，其特征是關節破壞和關節炎癥[35]。IL-1β是促進骨關節炎軟骨降解的主要炎癥細胞因子，IL-1β的產生是通過P13/AKT/mTOR通路的激活[36]。研究表明右歸丸治療慢性關節退行性疾病是通過抑制該通路P13K、AKT、mTOR的蛋白磷酸化水平表達[37]。

4 轉化生長因子-β相關通路

轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGf-β)是TGF蛋白家族中的一員，它是一種雙功能調節因子，既可以刺激細胞增殖，也可以抑制細胞增殖[38]。并且TGF-β是一個細胞因子超家族，包括TGF-(β1、β2,和β3)、激活素、抑制素、抗髓質激素、骨形態發生蛋白、生長分化因子、結節和膠質源性神經營養因子，TGF-β信號通路在調節細胞生長、分化、凋亡、血管生成和免疫反應等重要細胞活動中發揮重要作用[39-40]。骨髓間充質干細胞主要分化方向為成骨細胞和脂肪細胞，但骨髓間充質干細胞會隨著年齡的增長而逐漸老化，導致成骨細胞生成減少[41]，而TGF家族中的骨形態發生蛋白是成骨細胞形成所必須的信號[42]。有研究表明右歸丸含藥血清可以上調TGF-β通路中的TGF-β、BMP-7、血清骨鈣素的蛋白濃度，促進骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，對于骨質疏松癥的防治有積極意義[43]。另有實驗結果同樣表明右歸丸通過TGF-β1/Smad2/3/4通路促進骨髓基質干細胞向成骨細胞誘導分化[44-45]。

5 分析與展望

綜上，右歸丸通過調控NF-κB信號通路、WNT/β-Catenin經典信號通路、MAPK信號通路、mTOR信號通路和TGF-β信號通路發揮治療作用，這些成果有助于解釋右歸丸的療效機制，也為臨床應用提供更多的參考。但筆者也發現，目前右歸丸調控信號通路的基礎研究較少，并且右歸丸藥物成分十分復雜，治療靶點多、途徑多。近年來，生物信息學的分析方法和高通量檢測技術已應用于中醫藥復雜問題的研究中，可為明確右歸丸的靶點提供依據，有助于更深入地研究右歸丸發揮療效的具體途徑。此外，進一步深入研究右歸丸的作用機制，將有助于擴大右歸丸臨床使用范圍。