克氏原螯蝦受鯰愛德華氏菌刺激后Pc-crustin 6基因的表達分析

楊兵兵，魏 哲，藺思函，李倩倩，李 博，王春丹，沈秀麗，杜志強*

（1.內蒙古科技大學生命科學與技術學院，內蒙古自治區 包頭014010；2.內蒙古科技大學圖書館，內蒙古自治區 包頭014010）

0 引言

【研究意義】小龍蝦是一種淡水甲殼類無脊椎動物，學名克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），原產于墨西哥北部與美國南部。目前，它在我國已經成為了一種重要的經濟水產養殖動物。養殖過程中，由于養殖密度的增加、病原菌引起的蝦病頻繁爆發，給小龍蝦養殖業造成了嚴重損失。因此，研究小龍蝦抗細菌先天免疫，對于蝦病防治策略的制定具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】無脊椎動物為了保護機體免受外界病原侵染，進化出了一套先天免疫防御機制[1]。作為甲殼類模式動物，小龍蝦主要依靠自身的先天免疫系統抵御病原微生物的入侵[2]，該系統包括物理屏障、體液免疫與細胞免疫三部分[3]。對于體液免疫而言，主要的效應分子是抗菌肽，包括對蝦素、溶菌酶、甲殼肽、抗脂多糖因子等，相關研究結果顯示：此類分子對細菌、真菌具有廣泛的抑菌活性，因而在分子生物學研究領域被廣泛關注[4,5]。近些年，在紅螯蝦（Pacifastacus leniusculus）、凡納繽對蝦（Litopenaeus vannamei）、中華絨螯蝦（Eriocheir sinensis）、擬穴青蟹（Scylla paramamosain）的抗菌先天免疫相關研究中，相繼發現了具有抗菌活性的甲殼肽分子[6?9]。在分子結構方面，抗菌肽分子的N末端極性氨基酸的殘基促使其分子具有活化劑的活性性質[10]。在作用機理方面，抗菌肽分子能夠與病原菌細胞壁表面的正負電荷進行結合，使其表面產生穿孔，內溶物釋放，從而造成病原菌的死亡[11,12]，發揮抑菌活性。張財亮等利用LPS、Poly I:C刺激擬穴青蟹，并且通過對鰓組織中crustin基因進行抗細菌的研究[13]?！颈狙芯康那腥朦c】小龍蝦在鯰愛德華氏菌刺激后組織甲殼肽基因表達模式有待深入研究?！緮M解決的關鍵問題】本研究通過qRT-PCR技術分析小龍蝦在鯰愛德華氏菌刺激后的血細胞、肝胰腺、鰓、腸組織基因相對表達量。通過對小龍蝦crustin6甲殼肽基因的研究以及初步解決后續基因重組表達、抗體制備、功能研究的技術問題，為深入無脊椎動物抗細菌先天免疫基礎理論研究提供理論依據，同時也為水生生物養殖實踐環節中免疫策略的制定提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

健康的小龍蝦（15～20 g），購買自包頭市友誼瑞福海鮮市場；PCR產物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、T載體PCR產物克隆試劑盒，賽默飛世爾科技公司；動物總RNA提取試劑盒（TRIzol）、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光染料TB Green Prem ix，寶生物（大連）有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取無菌條件下采集小龍蝦的血細胞、肝胰腺、鰓、腸組織、肌肉50～100 mg置于玻璃勻漿器中，加入1m L預冷的TRIzol試劑進行勻漿，使用動物總RNA提取試劑盒提取上述各組織的總RNA，利用NANO Drop2000儀進行濃度測定，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行質量鑒定。

1.2.2 cDNA合成提取的總RNA按照反轉錄試劑盒的使用說明進行cDNA合成，利用1%瓊脂糖凝膠電泳進行質量驗證并且?80℃保存備用。

1.2.3 基因序列的PCR擴增根據前期轉錄組測序結果分析而獲得的一段小龍蝦甲殼肽基因的中心序列，設計目的基因序列擴增引物Pc-crustin-F（5′-GCT CCA GCG TAC ACG CAA-3′）與Pc-crustin-R（5′-ATG GCT CCC GGT GAT GGC-3′），以制備的小龍蝦肝胰腺cDNA作為模板進行PCR反應，擴增目的基因序列片段。PCR反應條件：①95℃，預 變 性3min；②95℃，變性30 s；③55℃，退火30 s；④72℃，延伸45 s（35個循環）；⑤72℃，后延伸5m in。

1.2.4 重組載體的構建與序列測定以制備的小龍蝦肝胰腺cDNA為模板，以上述Pc-crustin-F、Pccrustin-R為引物進行PCR擴增，利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒分離、純化目的基因擴增片段，根據T載體PCR產物克隆試劑盒的使用方法，將目的基因擴增片段與pUCm-T載體連接，構建重組載體并進行陽性重組子篩選，之后委托上海生工生物工程股份有限公司進行測序分析。

1.3 生物信息學分析

1.3.1 氨基酸序列比對將測序獲得的目的基因序列在NCBI在線網站的BLASTx模塊中進行序列比對，選擇相似度較高的crustin基因序列，利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對分析。

1.3.2 系統進化樹分析根據BLASTx序列比對結果，將物種親緣關系較近、基因序列相似度較高的crustin基因核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，利用MEGA 7.0軟件進行系統進化樹分析。

1.4 多組織表達譜分析

在小龍蝦第二腹節處注射鯰愛德華氏菌（2×107CFU）進行刺激（鯰愛德華氏菌本實驗室?80℃冰箱保存），對照組注射PBS，并在0、2、6、12、24、36、48 h解剖取樣（血細胞、肝胰腺、鰓、腸），每個時間點平均取3只樣，提總RNA，反轉錄成cDNA。然后利用實時熒光定量PCR技術檢測小龍蝦crustin基因mRNA的正常組織分布與鯰愛德華氏菌刺激后的基因表達模式。其中，目的基因特異性擴增引物為Pc-crustin-RT-F（5′-CAC TAT GGC TTC TAC GGTC-3′）與Pc-crustin-RT-R（5′-CTG GAG GCT GTG CAG GAA G-3′），18S RNA內參基因的擴增引物為18S RNA-RT-F（5′-TCT TCT TAG AGG GAT TAG CGG-3′）和18S RNA-RT-R（5′-AAG GGG ATT GAA CGG GTTA-3′）。PCR擴 增 程 序 如 下：95℃，30 s循環1次；95℃，5 s，60℃，34 s循環40次。從刺激開始進行3次重復之后，采用2?ΔCT算法統計分析目的基因的正常組織分布，利用2?ΔΔCT算法統計分析鯰愛德華氏菌刺激后的基因表達模式。

2 結果與分析

2.1 目的基因的PCR擴增結果

PCR擴增之后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。結果顯示：在DNA標準分子量250-500 bp之間有一條明亮的條帶，與理論值465 bp相符合，表明PCR擴增結果正確（圖1）。

圖1 Pc-crustin 6基因PCR擴增后的電泳結果Fig. 1 Electrophoresis of Pc-crustin 6 after PCR am p lification

2.2 序列分析結果

測序結果經過BLASTx比對，并且根據已有小龍蝦crustin甲殼肽基因的同源序列數目，將其命名為Pc-crustin6甲殼肽基因。序列分析結果顯示：Pccrustin6的cDNA序列全長為465 bp，開 放 閱 讀 框（ORF）包括384 bp，編碼127個氨基酸殘基；其中，N末端25個氨基酸是信號肽序列，C末端的47個氨基酸形成了一個抗菌肽分子特有的WAP結構域，其中存在8個保守的Cys殘基（圖2）。

圖2 Pc-crustin 6的cDNA序列以及編碼的氨基酸序列Fig.2 cDNA and encoded am ino acidssequencesof Pc-crustin 6

2.3 氨基酸序列比對結果

利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對，結果顯示：小龍蝦Pc-Crustin 6甲殼肽分子與巴西美對蝦Fb-Crustin分子的同源性為28.49%，與圣保羅對蝦Fp-Crustin分子的同源性為28.33%，與南美藍對蝦Ls-Crustin分子的同源性為28.81%，與日本對蝦Pj-Crustin 3分子的同源性為26.53%，與小褐美對蝦Fs-Crustin分子具有最高同源性，為29.19%（圖3）。

圖3 Pc-crustin 6與其他物種crustin基因的氨基酸序列比對結果Fig.3 Am ino acids sequence alignment between Pc-crustin 6 and other crustin s

2.4 系統進化樹分析

利用MEGA 7.0軟件進行系統進化樹分析，結果顯示：小龍蝦Pc-Crustin 6分子與小褐美對蝦Fs-Crustin分子、南美藍對蝦Ls-Crustin分子、巴西美對蝦Fb-Crustin分子、圣保羅對蝦Fp-Crustin分子、斑節對蝦Pm-Crustin 1分子分布在進化樹的同一分支（圖4），表明它們之間的親緣關系較近。

圖4 Pc-Crustin 6分子與其他Crustin分子親緣關系的進化樹分析Fig.4 Phylogenetic analysis on relationshipsbetween Pc-Crustin 6 and other Crustin s

2.5 分子結構預測的結果

利用EXPASY軟件預測目的蛋白質分子的初級結構，結果顯示：該分子中包括一個完整的WAP結構域，是一個典型的Crustin甲殼肽分子。

2.6 目的基因的組織分布分析

利 用qRT-PCR技 術 檢 測Pc-crustin6在 小 龍蝦5個組織中的表達水平，并且以18S RNA作為內參基因。圖5結果顯示：Pc-crustin6在血細胞、肝胰腺、鰓、腸和肌肉中均有表達，并且，在鰓組織中的表達量最高，其次是血細胞與腸組織，其他組織中的表達量較低。

圖5 Pc-crustin 6基因的多組織表達譜分析Fig.5 Expressionsof Pc-crustin 6 in various tissuesof P. clarkia

2.7 細菌刺激后Pc-crustin 6的表達模式

利用qRT-PCR技術檢測Pc-crustin6在鯰愛德華氏菌刺激后的表達模式，以18S RNA作為內參基因。結果顯示：圖6中A、B、C、D分別代表血細胞、肝胰腺、鰓和腸組織中Pc-crustin6在鯰愛德華氏菌刺激后的表達模式，可以看出：細菌刺激后，Pc-crustin6在上述4個組織中的表達量均呈現出了明顯的上調趨勢，說明其與對抗細菌刺激有關。

圖6 鯰愛德華氏菌刺激后Pc-crustin 6的表達模式Fig.6 Pc-crustin 6 expressions after E. ictaluri stimu lation

3 討論

近幾年的相關研究結果表明抗菌肽是甲殼類動物先天免疫系統中的重要效應分子。例如，賈文明對獲得的Crustin 1-4甲殼肽分子的序列進行分析，發現其N端均具有一個信號肽序列[14]，這是此類分子的典型特征之一。王一麗對日本沼蝦中的Crustin 1-13甲殼肽分子進行序列分析，發現這13個甲殼肽分子也具有典型的Crustins家族的分子結構特征[15]，在分子C末端存在至少8個保守的Cys殘基。孫晨[16]對中國明對蝦的Crustin 2與Crustin 3分子的研究發現WAP結構域是甲殼肽分子的功能結構域。王慧[17]從擬穴青蟹中克隆得到的Crustin 2分子的N端含有信號肽序列，C端具有Cys殘基富集區形成的結構域，并且是典型的Ⅱ型甲殼肽分子。因此，N末端的信號肽序列與C末端的WAP結構域是Crustin家族分子的基本結構特征。

本研究克隆得到了克氏原螯蝦一個新的crustin基因，根據目前其同源基因的發現順序，將其命名為Pc-crustin6基因。生物信息學分析結果顯示Pc-Crustin 6分子具有甲殼肽家族分子的典型特征，包括N端的信號肽序列，C端的WAP結構域，并且與Sm ith等[18]關于Crustin分子結構特征的描述相一致?，F有結果顯示，crustin基因會在無脊椎動物的鰓組織中高表達，例如，孫保貞[19]通過實時熒光定量PCR發現日本對蝦crustin-like基因在鰓組織中高表達；王慧[17]在擬穴青蟹中發現crustin2主要在鰓組織中表達。同樣，本研究中的Pc-crustin6基因在鰓組織中表達量最高，與以上結論一致，推測其可能與鰓組織的抗細菌作用相關。此外，SUN等[20]利用白斑病毒與弧菌分別刺激日本囊對蝦，在血細胞中檢測到crustin-like基因的上調表達，揭示了其在對蝦先天免疫中的潛在免疫作用。同時，李朝政利用LPS和副溶血性弧菌以及白斑病毒分別對凡納濱對蝦進行刺激之后，發現crustin基因在血細胞中的相對表達量顯著上調，說明Lv-Crustin在凡納濱對蝦的先天免疫中發揮著重要作用，可能作為一種抗菌效應分子在體內發揮作用[21]。本研究利用鯰愛德華氏菌刺激小龍蝦之后，Pc-crustin6的表達量在2 h呈現急劇上升趨勢，表明鯰愛德華氏菌刺激后，crustin6表達發生改變，推測其在蝦抗鯰愛德華氏菌過程中發揮了作用。在小龍蝦鰓組織中，Pc-crustin6的表達量在2 h后出現持續降低趨勢，因為鰓組織是蝦類重要的呼吸器官，起著過濾水體的作用，而本試驗采用小龍蝦第二腹節注射細菌的方式模擬細菌感染時的情況，并非在水體中摻入細菌，因此鰓組織受到的細菌刺激就相對弱一些，激發起的免疫反應隨之較弱。根據細菌刺激后表達模式的分析結果可以得出：細菌刺激早期，血細胞、肝胰腺、鰓、腸組織中Pc-crustin6表達上調；細菌刺激后期，鰓組織除外，其他組織中Pc-crustin6又被高表達對細菌入侵作出應答。

4 結論

在前期轉錄組測序的基礎上，通過對目的基因的克隆與功能分析，發現了一個小龍蝦新的crustin基因，命名為Pc-crustin6，利用實時熒光定量PCR檢測Pc-crustin6在不同組織中的mRNA表達量，以及細菌刺激后的血細胞、肝胰腺、鰓和腸組織中的表達情況。為后續基因重組表達、抗體制備、功能研究提供一定的理論依據，對抗菌肽家族分子的進一步完善做出重要補充。近些年，針對小龍蝦等甲殼類動物的抗細菌先天免疫的相關研究結果較為豐富，先天免疫的基礎理論得到逐步完善；其中，甲殼肽作為重要的免疫效應分子在小龍蝦中發揮著一系列抗菌作用，針對Pc-crustin6基因的深入研究對無脊椎動物抗細菌先天免疫基礎理論的進一步完善以及水生生物養殖實踐環節免疫策略的制定都有重要意義。