基于高通量測序分析番茄自然發酵過程中的真菌多樣性

秦宇蒙，周笑犁 ，管慶林，劉云寒，吳承木

（1. 貴陽學院食品與制藥工程學院，貴州 貴陽 550005；2. 貴州省普通高等學校功能食品重點實驗室，貴州 貴陽 550005）

0 引言

【研究意義】番茄（Lycopersicon esculentumM iller）為管狀花目（Tubiflorae）、茄科（Solanaceae）、番茄屬（Lycopersicon）的一種一年生或多年生草本植物，色澤鮮艷，生熟皆宜食用。它含有豐富的番茄紅素、維生素E、維生素C、類胡蘿卜素、類黃酮和酚類等多種活性物質[1]，對人體健康起著非常重要的作用。尤其是其富含的番茄紅素具有抗氧化、降血脂、抗癌、提高機體免疫力等功效[2]。而近些年我國逐漸出現了番茄的滯銷現象，這不僅給果農的收益帶來影響，還造成營養物質的大量浪費，從而困擾了番茄產業的發展，因此加強番茄深加工力度和開辟新的利用途徑對其產業的發展具有一定的現實意義。酵素是以植物、動物、菌類等為原料，由微生物發酵后制得的含有特定生物活性成分的產品[3]，其不僅含有乳酸菌、酵母菌等多種微生物，還有著豐富的生物活性物質，具有抗菌、抗氧化、提高免疫力、保護心血管以及抑制肥胖等作用[4]。目前，大多數酵素產品多以自然發酵為主，但是這種發酵方式易受環境氣候等條件影響，且質量較難控制。因此，解析酵素自然發酵過程中的微生物群落變化規律，可以為篩選發酵優勢菌株奠定理論基礎。【前人研究進展】目前，人們對于酵素的研究大多集中在功效酶活性、代謝產物、抗氧化活性等方面[5?7]以及發酵過程中酵母菌、乳酸桿菌的分離鑒定[3,4,8]。但是基于傳統培養方法分離得到的微生物十分有限，而且耗時耗力，因此為了更加高效、準確地解析發酵過程中微生物的組成及其多樣性變化規律，越來越多的免培養技術被廣泛應用。高通量測序技術因其具有快捷、準確、高效的特點，近年來逐漸成為國內外研究菌群多樣性特征的新手段。丁建才等[9]使用高通量測序分析了河北昌黎產區干紅葡萄酒發酵過程中真菌群落， 共鑒定出128個屬，分布在漢遜酵母屬、釀酒酵母屬、未被鑒定的屬、短梗霉屬、被孢霉屬等。康曉樂等[10]采用宏基因組技術分析得出，蘋果自然發酵過程中優勢細菌屬為乳桿菌屬和葡萄糖酸桿菌屬，優勢真菌屬為接合酵母屬和漢遜酵母屬。張琪等[11]利用高通量測序分析沙棘酵素自然發酵過程中的細菌多樣性，發現藍藻細菌門為發酵過程中的絕對優勢菌門。【本研究切入點】筆者前期研究發現，天然發酵的成熟紅番茄具有良好的抗氧化活性，隨著發酵時間的延長，總酚等生物活性物質在發酵過程中也有所增加[12]，并從發酵液中分離得到了3株畢赤酵母菌[13]，而對自然發酵過程中真菌群落多樣性方面的研究還有待進一步探索。【擬解決的關鍵問題】通過高通量測序技術，進一步分析番茄自然發酵不同時期中真菌的多樣性及其群落動態變化規律，同時對其發酵過程中理化指標進行測定，為后續深入研究番茄酵素中菌落結構及其在自然發酵中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮小番茄、白砂糖購自沃爾瑪超市；E.Z.N.A.?soil試 劑 盒，美 國Omega Bio-tek公 司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，美國Axygen公司；Tris-HCl緩沖液，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硫酸（分析純），太倉滬試劑有限公司；無水乙醇（分析純），天津市富宇精細化工有限公司；蘇丹I色素（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司；甲苯（分析純），重慶川東化工有限公司；重鉻酸鉀（分析純），金山化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

T100PCR擴增儀，美國BIO-RAD公司；YXQLS-50SII立式高壓滅菌鍋，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SW-CJ-1G單人超凈工作臺，上海力辰邦西儀器科技有限公司；高速冷凍離心機，德國艾本德；AUW 120D電子分析天平，日本島津公司；PHS-3C pH計，儀電科學儀器（上海）有限公司；移液槍，興創實驗儀器（北京）有限公司；BSM 120.4分析天平，卓精電子科技（上海）有限公司；JYL-Y5九陽高速破壁調理機，九陽股份有限公司；PAL-BX手持型糖酸一體機，日本Atago公司；UV-2550紫外可見光分光光度計，濟南海能儀器股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的制備 選取大小相近，無病蟲害，外表光澤無破損，顏色鮮紅的新鮮小番茄，去蒂、自來水清洗2次、無菌水清洗3次、無菌風干并切分。將番茄與白砂糖以質量比3∶1的比例放入滅菌發酵瓶中室溫避光發酵90 d，發酵前期每天上下翻轉搖晃玻璃瓶使白砂糖均勻融化，定期排氣防止脹罐，設置兩個批次進行發酵。

1.3.2 樣品采集 于第0、10、20、30、60、90 d從兩批次的番茄發酵瓶中3個位點（底部、中部和上層）取樣50 m L放入滅菌的離心管中，依次編號為G1、G2、G3、G4、G5和G6，置于?80 ℃超低溫冰箱保存，用于后續分析。

1.3.3 理化指標分析檢測

（1） pH：用pH計測定不同時期的番茄發酵液，待數據穩定后記錄數據。

（2） 可溶性固形物：使用手持糖量計測定不同時期的番茄發酵液，讀數并記錄。

（3） 酒精度：參考李嶺卓等[14]的方法稍加改變，取5 m L樣品液依次加入10 m L重鉻酸鉀、5 m L H2SO4混勻并用錫紙封口，使其充分反應10 m in，在波長610 nm下測吸光度。以乙醇標準曲線方程y=1.034 3x+0.008，R2=0.999 7得出酒精度。

（4） 番茄紅素：采用分光光度法[15]檢測不同時期發酵液中番茄紅素的含量，取5 g去除黃色素的番茄發酵渣，向渣中加入少許甲苯，攪拌、過濾，重復多次至濾液無色為止，用25 m L棕色容量瓶收集濾液并用甲苯定容，于485 nm下測吸光度值。番茄紅素含量以蘇丹I色素為標準物，按標準曲線方程y=1.0657x+0.0028，R2=0.9981得出番茄紅素含量。

1.3.4 DNA提 取、PCR擴 增 和 高 通 量 測 序 利用DNA提取試劑盒提取番茄發酵液中微生物基因組DNA，提取步驟根據說明書進行；以基因組DNA為模板，根據真菌ITS區通用引物進行PCR擴增；利用Illum ina M iSeq對擴增成功的產物進行高通量測序和分析。

1.3.5 數據分析 高通量測序數據通過上海生物工程股份有限公司多樣性測序及分析平臺完成。通過barcode區分樣品序列，并對各樣本序列進行質控和過濾；將多條序列根據其序列之間的距離來進行聚類，再通過相似性在97%以上的序列進行OTU聚類和物種分類分析。通過繪制Shannon-W iener曲線、多樣性指數、分類學信息等進行番茄自然發酵液中真菌群落結構分析統計。

理化指標均重復測定3次，數據用平均數值±標準差值表示，采用單因素方差分析（ANOVA）和SPSS 25.0軟件進行單次實驗統計檢驗數據性狀分析，采用Duncan's多重極差法進行統計檢驗，確定各試驗數據性狀的顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 番茄自然發酵過程中理化指標分析

番茄自然發酵過程中理化指標變化見圖1。由圖1可知，隨著發酵的進行，pH值和可溶性固形物均呈現逐漸下降的趨勢（P＜0.05），說明隨著發酵的進行，發酵體系中的碳源逐步被微生物菌群利用產生有機酸等代謝產物，從而使得體系的酸度增大，以致pH逐漸減小，形成良好的相互佐證。而酒精度與番茄紅素呈現的變化趨勢相近，在發酵初期顯著下降（P＜0.05），這可能是由于一般果蔬原料中均帶有大量微生物，包括有害菌等作為初始時的優勢菌群利用了這些物質，且初期產酒精的菌群還未生長等。隨后酒精度和番茄紅素迅速增加后又下降，這可能是由于隨著發酵時間的延長，發酵中期乳桿菌占主導地位，利用蔗糖、葡萄糖、果糖等可發酵糖進行異型發酵，酵母菌也逐步成為優勢真菌，可將番茄中的糖類轉化成乙醇和二氧化碳，以及一些次級代謝產物，如短鏈的醇、脂肪酸和酯類等，使得微生物處于缺氧的環境，同時微生物代謝產生的有機酸使pH逐漸下降，酒精度逐漸上升，在這種不適宜微生物生長的條件下，會抑制絕大部分微生物尤其是初期有害菌的生長繁殖，這也與后續真菌多樣性的測序結果一致。并且，酵母菌代謝產生的醇類與乳酸菌代謝產生的有機酸可反應生成酯類，這可能與發酵果蔬的風味相關。

圖1 發酵過程中理化指標的變化情況Fig. 1 Changes in physiochem ical properties of broth during ferm entation

2.2 番茄自然發酵過程中真菌豐富性和多樣性分析

2.2.1 A lpha多樣性分析 稀釋曲線趨于平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量的OTU，反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU[16]。從6組番茄發酵液樣品中共獲得705 309條有效序列，再依據97%相似性水平下的OTU信息進行聚類分析，共獲得4 499個OTU。從圖2-a、b可以看出，隨著測序量的增大，香農曲線趨于平緩，說明盡管增加測序量樣品微生物的多樣性已經不再隨之發生變化；各個樣品的稀釋曲線接近平臺期達到飽和，說明主要真菌基本能覆蓋，各組樣品中的物種多樣性豐富程度高。

圖2 真菌群落OTU稀疏曲線（a）和Shannon指數稀疏曲線（b）Fig. 2 Rarefaction curves on OTU （a） and Shannon index （b） of fungal community

基于在97%相似度水平的OTU數，各樣品A lpha多樣性指數值如表1所示。Coverage指數表明各樣品文庫的覆蓋率，其數值越高，則樣本中序列沒有被測出的概率越低，反映了測序結果是否代表樣本的真實情況[17]。由表1可知，番茄不同發酵時期每組的Coverage值均在0.998以上，表明測序深度良好，覆蓋率高，可以真實展示樣品中真菌的多樣性。Chao1和Ace指數在生態學中常用來估計物種總數，其數值越大則表明菌群豐富度越高[18]。如表1所示，發酵初始時（0 d）樣品具有較低的真菌豐富度和多樣性；隨著發酵周期的延長，真菌的豐富度呈先上升后下降再上升的趨勢，說明豐富的真菌不僅來自番茄樣品本身，還與發酵環境有著很大的聯系，良好的發酵環境有利于微生物的生長；G3時期的豐富度顯著下降可能是由于此時酒精度迅速升高。如，在大頭菜發酵過程中，隨著食鹽量的逐漸增加，導致不耐鹽真菌逐漸消失，真菌群落的豐富度和多樣性下降[19]。Simpson指數和Shannon指數常用來估算樣品中微生物的多樣性。Shannon指數值越大，說明群落多樣性越高，而Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低[20]。由表1可知，番茄自然發酵過程中真菌多樣性呈動態變化，且各組樣品的Shannon指數與Simpson指數變化趨勢呈反比關系，所反映的發酵過程中真菌群落多樣性變化與Chao1及Ace指數呈現的變化規律基本一致。G4組的Shannon指數最大且Simpson指數最低，說明該組的菌群多樣性最高，而G3時期卻最低；說明在番茄的天然發酵過程中，真菌群落結構發生了較大的波動。本課題組在此之前對番茄自然發酵過程中細菌多樣性的分析發現，其物種數呈現逐漸下降的趨勢，可能是由于優勢發酵菌群的形成、營養物質的消耗、代謝產物的積累，從而抑制其他菌群的生長[21]。

表1 樣本信息和多樣性指數Table 1 In form ation and diversity index on sam p les

2.2.2 Beta多樣性分析 Beta多樣性用于比較不同樣本微生物群落構成的差異。樣本聚類樹圖可以通過樹枝結構直觀反映多個樣品間的相似性和差異關系。如圖3所示，各組番茄發酵液樣品分為兩大支，分別代表發酵前和發酵后，發酵初始聚集在下方，開始發酵后的樣品分為三大組聚集在上方，其中又可分為三大類，其中G2和G3、G4和G5，以及G6樣品組分別聚為一類。由此可以將自然發酵過程大致分為發酵初期、發酵中期和發酵后期3個時期。說明在發酵的相同階段，真菌群落組成結構相似；發酵時期不同，真菌的菌群結構存在一定差異。

圖3 OTU水平上樣本真菌群落聚類分析Fig. 3 Cluster analysis on fungal comm unities of sam p les atOTU level

2.3 番茄自然發酵過程中真菌群落組成分析

2.3.1 Venn 圖 分 析 Venn圖 直觀展 現 出 樣 品OTU數目的組成相似性及重疊情況，前述6組樣品共產生了4 499條OTU，從圖4中可以看出各組樣品共同擁有的OTU數量為87，約占各組樣品OTU數量的19.6%～29.1%，說明各組樣品間均有一定數量的相似真菌。各個組間未重疊的OTU數分別為104、150、138、192、272和283，說明各組樣品含有不同于其他組樣品特有的OTU。隨著發酵周期的延長，各組獨有OTU數量的增加說明自然發酵的環境有利于真菌的增殖，而相似種類較少，這說明番茄自然發酵的不同時期既有相同又存在一定的差異。

圖4 OTU韋恩圖Fig. 4 Venn diagram of OTUs

2.3.2 真菌在門類水平上的分類和比較 番茄自然發酵過程中各組樣品的微生物群落在門分類水平上具有較高的多樣性，由圖5可知，分析番茄發酵液各時期樣品在門水平上的真菌群落組成，去除未分類的真菌后，樣品中真菌群落包含11個門，主要有子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）、隱真菌門（Rozellomycota）、壺 菌 門（Chytridiomycota）等。其中，子囊菌門始終在整個發酵過程中占絕對的主導地位，其次為擔子菌門，它們在不同發酵時期的相對豐度差異較大，占比分別為22.43%～75.27%和0.48%～7.10%；子囊菌門在G1-G3時期呈下降趨勢，而此時擔子菌門逐漸上升，直至G4時期開始，子囊菌門逐漸上升，在發酵后期占絕對優勢，擔子菌門的相對豐度迅速減少，到后期時更低，二者呈現交替消長的現象。研究表明，子囊菌門和擔子菌門中的微生物均為土壤中的優勢菌種，能夠分解大多數有機物質和植物殘骸[22]，這與本研究結果一致；它們中有著多種發酵菌種屬，如酵母菌屬、畢赤酵母菌屬、漢遜酵母屬等，這與屬水平相對含量圖分析相似。說明果蔬原料中帶著大量微生物，包括乳酸菌、酵母菌等，且通過這些真菌和細菌共同參與發酵。這同黑果枸杞發酵液[23]、四川泡菜母水[24]及酸湯[25]等發酵制品中在門水平上發現的優勢菌群相似，說明不同時期的番茄發酵液樣品在門分類水平上群落結構多樣性相近，且分布廣泛，對發酵食品起著極大的作用[26]，代謝產物還能夠起到抗菌、抗腫瘤的作用[27]。而泡菜母水[24]中卻還含有接合菌門（Zygomycota）、黑果枸杞酵素[23]中還有被孢霉菌門（Mortierellomycota）等優勢菌，這說明不同發酵制品中有相同的真菌，也有其特有的菌，不同菌在發酵中的作用還有待深入研究。

圖5 門水平上真菌群落組成分析Fig. 5 Com position of fungal community at phylum level

2.3.3 真菌屬類水平比較 由圖6可知，番茄自然發酵過程中不同時期真菌群落在屬分類水平上共檢測出31種已知的真菌屬。真菌的菌群結構簡單可能由多方面因素造成，如酵母菌發酵產生的酒精會對自身和其他真菌有毒害作用，優勢乳酸菌、酵母菌屬等微生物代謝產生的有機酸也會使真菌的生長環境發生改變，使其不宜生長繁殖。在G1時期樣品中主要優勢真菌為青霉屬（Penicillium），相對豐度為37.51%，其次為雙足囊菌屬（Dipodascus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、輪枝菌屬（Verticillium）；隨后，青霉屬的相對豐度迅速減少，在G2-G5時期，真菌的種類較復雜，輪枝菌屬占據了優勢，相對豐度為6.67%～22.92%，其次為威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、念珠菌屬（Candida）、鐮刀菌屬和曲霉菌屬（Aspergillus）；在G6時期，樣品中漢遜酵母屬（Hanseniaspora）豐度大大提高，其占比為33.55%，成為該時期的優勢菌屬，其次為接合酵母屬（Zygosaccharomyces）。表明在番茄發酵過程中，其表面附著的微生物參與發酵，隨著發酵時間延長，微生態環境變化使得部分真菌的繁殖受到抑制，降低了物種的多樣性，如發酵初期的諸多優勢菌屬不能在高酸度，高乙醇濃度及厭氧環境下生存而逐漸消亡。而后期酵母屬等會消耗體系中的營養物質，產酯、產醇、產有機酸等風味物質，主要起生香作用，并且漢遜酵母屬還會利用部分酒精，這也同前述酒精度在G4期后顯著下降這一結果一致。結合在前期對番茄自然發酵過程中細菌多樣性的分析，由此推斷番茄自然發酵過程存在酵母菌和乳酸菌兩類發酵，它們分別利用發酵環境中的糖產生酒精和有機酸，以及其他風味物質等，并抑制不耐酸菌或雜菌生長。果蔬自然發酵過程中微生物的種類十分豐富，蘋果自然發酵過程中的優勢菌屬有接合酵母屬和漢遜酵母屬[10]；桑葚酵素發酵過程中的優勢真菌為未分類酵母屬（Saccharomycetales）、漢遜酵母屬[28]；這均與本試驗番茄自然發酵末期的優勢真菌屬相似。而高慶超[23]發現黑果枸杞酵素的優勢真菌屬有鏈格孢屬（Alternaria）、球腔菌屬（Mycosphaerella）、黑粉菌屬（Filobasidium）、酵母屬（Saccharomy）和鎖瑚菌屬（Membranomyces）；紅樹莓發酵液中前期優勢菌種屬為釀酒酵母屬（Saccharomyces），中后期優勢菌種屬為漢遜酵母屬、Kazachstania[29]。這說明發酵不同時期以及不同果蔬發酵過程中的優勢真菌存在差異，體現出微生物群落對不同果實營養成分具有一定的偏好，由于不同果實生長環境和氣候不同，導致其原生的真菌群落不盡相同。

圖6 屬水平上真菌群落組成分析Fig. 6 Com position of fungal community at genus level

2.3.4 物種豐度熱圖 Heatmap可以用顏色變化來反映群落分布的豐度信息，可以直觀地將群落分布豐度值用定義的顏色深淺表示。圖中每一列代表一組樣本，行代表群落結構，顏色塊代表相對物種豐度值，顏色越紅表示相對豐度越高，顏色越藍反之[30]。由圖7可見，番茄自然發酵液在不同分類水平上均表現出一定的多樣性，不同時期的發酵液中優勢菌群和相對豐度也各不相同；其中G1與其他組樣品差距較大，G2和G3相似，G4-G6基本接近，說明隨著發酵番茄的成熟，各組樣品之間的微生物差異性減少，物種豐度越來越相似。由于番茄原料原始附著的微生物在發酵初期占據主導地位參與自然發酵，但其中青霉屬等在發酵過程中容易引起腐敗變質，不利于發酵產品的品質；隨著發酵的持續發生，底物中的糖類等營養物質逐步被微生物利用，發酵產生乙醇、二氧化碳及一些次級代謝產物，輪枝菌屬在發酵中期顯示較高的豐度；漢遜酵母屬和接合酵母屬在發酵末期占主導地位，它在發酵過程中能夠利用糖類進行生長代謝，產生或者催化產生酒石酸、氨基酸等[29]，以及代謝產生的醇類與乳酸菌代謝產生的有機酸可反應生成酯類，這與風味物質的形成可能存在一定的關聯。但各菌株之間的相互作用機理及其在不同時期發揮的作用還有待進一步探究。

圖7 屬水平上真菌群落組成熱圖Fig. 7 Heatm ap of fungal comm unities at genus level

3 討論與結論

本研究采用高通量測序技術對番茄自然發酵過程中真菌多樣性和群落結構進行分析，從不同發酵時期的樣品中共獲得705 309條有效序列，再依據97%相似性水平下的OTU信息進行聚類分析，共獲得4 499個OTU。經樣本聚類分析可以將整個發酵過程大致分為發酵初始（0 d）、發酵初期（10～20 d）、發酵中期（30～60 d）和發酵后期（90 d）。隨著發酵時間的延長，真菌群落結構發生了較大的變化，去除未分類的真菌后，各組樣品中真菌群落包含11個門，其優勢真菌門類為子囊菌門（Ascomycota）和擔子菌門（Basidiomycota）；屬分類水平上，共檢測出31個屬，青霉屬（Penicillium）為發酵初期的優勢真菌屬，隨后演替為輪枝菌屬（Verticillium），最后漢遜酵母屬（Hanseniaspora）和接合酵母屬（Zygosaccharomyces）占據了優勢。隨著發酵時間的延長，酵母菌屬逐步成為優勢真菌，可將番茄中的糖類轉化成乙醇以及一些次級代謝產物，使得微生物處于缺氧的環境，同時發酵體系的可溶性固形物逐漸減少，微生物代謝產生的有機酸使pH逐漸下降，酒精度和番茄紅素含量逐漸上升，在這種不適宜微生物生長的條件下，抑制了絕大部分微生物尤其是初期有害菌的生長繁殖。本研究嘗試系統地揭示自然發酵番茄的真菌多樣性和群落組成，為番茄酵素發酵過程中菌群的調控提供方向，也為評價果蔬發酵制品對機體健康的影響奠定基礎，以期開發出高附加值的番茄產品及其發酵制品。