番茄細菌性髓部壞死病病原細菌的鑒定

陳梅春，肖榮鳳，陳燕萍，鄭雪芳，朱育菁，王階平，劉 波

（福建省農業科學院農業生物資源研究所，福建 福州350003）

0 引言

【研究意義】番茄是世界主要經濟作物之一，但其極易受到病害威脅，而且番茄病害種類多、為害嚴重，極大地制約了番茄產業的發展。開展番茄病害病原分離鑒定研究，可為番茄病害發生規律探究和病害防治提供參考。【前人研究進展】目前已發現的番茄病害包括真菌病害、細菌病害、病毒病、線蟲病害和生理病害等，其中細菌性病害主要危害植株的葉片和莖[1?3]。細菌病害發生后，一般減產10%～30%，嚴重時甚至造成絕收。番茄細菌性病害主要包括青枯病[4]、潰瘍病[5]、髓部壞死病[6]、瘡痂病[7]、葉斑病[8]，這些病害的病原菌都可以通過傷口入侵和雨水傳播，尤其在田間或棚內濕度大時極易擴展蔓延。其中，引起番茄髓部壞死病的病原菌包括假單胞菌屬和果膠桿菌屬的8種病菌，如菊苣假單胞菌（Pseudomonas cichorii）[9]、皺紋假單胞菌（P. corrugata）[10]、熒光假單胞菌（P. fluorescens）[11]、果膠桿菌（Pectobacterium atrosepticum）[12]等。番茄細菌性髓部壞死呈現癥狀包括植物莖表面出現黃色、棕色或黑色的病斑，莖髓部出現水浸狀、褪色、空心或軟腐，維管束組織呈黃化或褐變[13]。目前已報道的番茄髓部壞死病主要發生在我國山東、浙江、湖北、內蒙古、廣東、江蘇及河北等地[6]。2017–2019年，福建泉州、浙江瑞安等地大棚番茄出現一種病害，該病發生于花期和果期，大棚內濕度高，打杈抹枝后容易發病，且發病速度很快，從發病到整株死亡大概20 d，發病率達15%～30%，給種植戶帶來嚴重的經濟損失。【本研究切入點】發病的番茄植株莖部表面病斑為褐色長條形水漬狀；橫剖發現病莖維管束褐變，莖桿髓部壞死；因維管束受阻，葉片失水后萎蔫，但仍保持綠色；地上部癥狀與青枯病類似，但地下根部無癥狀。上述癥狀顯示該病可能為番茄上的一種新病害，病原種類未知，亟待探明。【擬解決的關鍵問題】通過病原菌分離、致病性測定、形態學、16S rDNA測序、生理生化及質譜等方法以期對上述病害病原類型進行鑒定，為該病害的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

番茄發病植株于2017–2019年采集于福建泉州、浙江瑞安等地番茄大棚的發病田塊。

1.2 病原菌的分離與培養

番茄發病植株莖部用自來水清洗后，用75%的酒精表面消毒，剝去外層表皮，切取莖桿病健交界處的病組織，大小約3mm3，不同樣品各切取10片，置于75%酒精中浸泡2～5 s，再放入1%次氯酸鈉溶液中消毒5 m in，取出用無菌蒸餾水沖洗3次，置于3m L無菌蒸餾水浸泡1 h以上。取0.1μL浸泡液涂布于NA固體培養基（3 g·L?1牛肉膏、5 g·L?1蛋白胨、17 g·L?1瓊脂）上，30℃培養48 h后，挑選單菌落，連續純化2次后，用20%甘油于?80℃凍存備用。

1.3 病原菌的致病力測定

采用1月齡（20～30 cm高）番茄盆栽苗檢測病原菌致病力。接種病原菌于LB液體培養基（牛肉膏5 g·L?1、蛋白胨5 g·L?1）中，30℃搖瓶培養48 h后，用無菌水稀釋為1×107CFU·m L?1的菌體懸浮液。處理組1：將番茄的第4個分叉枝切除，于傷口處注射接種10 m L的病原菌懸浮液，用無菌水潤濕的紗布覆蓋傷口保濕，并用封口膜包裹，2 d后拆除。每個處理均以接種LB液體培養基為對照，每個處理組共30株苗。處理組2：將番茄植株根部浸泡于病原菌懸浮液中1 h后，取出種于栽培基質中；將盆栽苗置于光照培養箱中（溫度：25～30℃；濕度：70%～80%；光照：16 h·d?1），每天觀察植株發病情況。番茄植株發病后，取病變植株重新分離病原菌，并與接種菌株進行比較。

1.4 病原菌的鑒定

1.4.1 形態學鑒定利用普通光學顯微鏡和透射電鏡觀察菌落/體形態，并測量菌體大小。1.4.2 Biolog分析采用Gen IIIM icrostation微生物鑒定進行Biolog分析，病原菌接種于Biolog專用BUG+B培養基培養48 h后，稀釋菌懸液至OD600值為0.2～0.3，于BiologGN微孔板上加入150μL菌懸液，置于30℃培養48 h后，觀察菌液利用96種碳源的顏色反應。根據Biolog M icrologi數據庫比對確定病原菌種屬。1.4.3 16S rDNA基因序列測定利用W izard基因組DNA純化試劑盒（Promega，Madison，W I）提取病原菌DNA。16SrDNA基因引物為FD1（AGAGTTT GATCCTGGCTCAG）和RD1（AAGGAGGTGATCCA GCC）。利用引物進行PCR擴增，反應體系為50 μL（10×PCR buffer 5μL、dNTP 1μL、FD1 2μL、FD2 2 μL、Tag酶 1 μL、模板DNA 2 μL、dd H2O 37 μL），擴增條件為：94℃5 m in；94℃30 s，55℃1m in，72℃90 s，29個循環；72℃1min；10℃20m in。

將菌株的16S rDNA基因測序結果于NCBI網站上用BLAST軟件進行同源性比對，初步判斷病原菌的種屬歸類，利用MEGA 6.0的鄰接法（Neighborjoining，NJ）分別構建系統發育樹，并將菌株FJAT-46819和FJAT-47134的16S rDNA基 因 序 列 上 傳至NCBI，NCBI號分別為MW 512876和MW 512877。1.4.4 MALDI-TOF-MS測定病原菌于LB培養基上生長48 h后，挑選單個菌落并將其重懸于無菌水中，加入乙醇后，通過乙腈/甲酸法提取蛋白質。利用Bruker Daltonik UltrafleXtreme MALDITOF系統 采集蛋白質質譜數據。取1μL蛋白質提取物點到鋼靶板上，放干后點上1μL的α-氰基-4-羥基肉桂酸基質溶液。利用FlexControl軟件（版本3.4）以自動模式以隨機采樣模式采集光譜數據：采集模式，線性正離子；質量范圍，2～20 kDa；氮激光波長，335 nm；激光頻率，2000 Hz；加速電壓，25 kV。應用BioTyper分析軟件對所獲取的質譜圖進行分析，通過匹配值的大小對細菌種類鑒定結果進行判定。

2 結果與分析

2.1 番茄細菌性病害的田間癥狀

植株發病初期萎蔫，似青枯病癥狀，后期葉片枯死（圖1-a），莖部表面初期黃褐色，后期顏色加深，從發病部位向四周擴散，莖部剖面可見維管束褐變，髓部組織腐爛、空心（圖1-b、c）。根據發病癥狀初步診斷為番茄細菌性病害。

圖1 田間番茄細菌病害癥狀Fig.1 Sym p tom s of tomato bacterial pith necrosisdiseases in the field

2.2 病原菌分離與培養特性

從不同病組織上分離純化出菌落形態一致的菌落，選擇2株代表性菌株FJAT-46819和FJAT-47134進行后續研究。菌落呈橢圓形、平滑均勻，乳白色（圖2）。革蘭氏染色觀察表明2株菌株均呈革蘭氏陰性，菌體在透射電鏡中呈橢圓形至短桿狀，大小為1.42（1.02～1.58）μm×0.81（0.74～0.88）μm，無芽孢。

圖2 病菌形態Fig.2 M orphological characteristics of bacterial isolates

2.3 病原菌致病力測定

將代表性菌株FJAT-46819和FJAT-47134回接到健康番茄盆栽苗上，結果表明：空白對照組番茄植株無發病癥狀；處理組1（采用分叉枝切除傷口接種）番茄植株，接種7 d后接種口周圍組織褐變（圖3-a），接種17～20 d時整株萎蔫枯死，與田間番茄髓部壞死病病癥一致（圖3-b）。處理組2（采用浸根接種病原菌）番茄植株無發病癥狀；從發病植株重新分離病原菌，其形態特征和培養性狀與接種菌株一致。根據柯赫氏法則，初步判斷接種上述2株病原菌對番茄具有較強的致病性，侵染番茄植株后都能引發番茄髓部壞死病。

圖3 室內病菌回接番茄植株的髓壞死病癥狀Fig.3 Sym ptom sof bacterial pith necrosison inocu lated tom ato p lants in greenhouse

2.4 病原菌的Biolog分析

病原菌FJAT-46819和FJAT-47134的biolog鑒定結果和系統參數如表1所示。根據Biolog系統規定[14]，當SIM值＞0.75時，鑒定的種名結果可靠；當SIM值小于0.75或0.5時，鑒定的屬名可靠。本研究中2個菌株FJAT-46819和FJAT-47134的SIM均小于0.75，因此2個菌株FJAT-46819和FJAT-47134均鑒定為腸桿菌屬（Enterobacterspp.）菌株。

表1 Biolog分析結果Table 1 Results of biology analysis

2.5 病原菌的分子鑒定

菌 株FJAT-46819（MW 512876）和FJAT-47134（MW 512877）的16SrDNA序 列 分 別 為1403 bp和1407 bp。經BLAST分析，這2株菌的16S rDNA序列與腸桿菌屬（Enterobacter）的序列同源性較高。圖4為利用MEGA 6.0軟件的NJ法建立的腸桿菌屬系統發育樹，結果顯示，菌株FJAT-46819和FJAT-47134與 阿 氏 腸 桿 菌（Enterobacter asburiaeATCC 35953T）16S rDNA序列聚在一起，它們的同源性最高。

圖4 菌株FJAT-46819和FJAT-47134的16 S rDNA基因進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA gene sequencesof FJAT-46819 and FJAT-47134

2.6 病原菌的質譜鑒定

利 用MALDI-TOF-MS采 集 菌 株FJAT-46819和FJAT-47134的質譜數據，生成肽指紋圖譜，與數據庫中微生物進行檢索匹配，結果如表2所示，菌株FJAT-46819和FJAT-47134與數據庫中的阿氏腸桿菌匹配值分布于2.3～3.0。因此，將這2株菌鑒定為阿氏腸桿菌，該鑒定結果與分子鑒定結果一致，且2株菌的可信度分值差異小于0.1，說明它們的相似度極高。

表2菌株FJAT-46819和FJAT-47134的MALDI-TOF-MS鑒定結果Table 2 Results of MALDI-TOF-MS analysis on FJAT-46819 and FJAT-47134

3 討論與結論

番茄細菌性髓部壞死病是2017–2019年發生于福建和浙江種植的大棚番茄上的病害。通過對發生該病的病株莖部病健交接處病菌分離、16S rDNA分子鑒定、系統發育分析及MALDI-TOF-MS質譜鑒定、致病性測定等系列試驗，確定引起福建和浙江大棚番茄髓部壞死病的病原菌為腸桿菌屬的阿氏腸桿菌（E.asburiae）。這是在番茄上發現的一種新病害，還未見國內外相關報道。

腸桿菌屬包括21個種與2個亞種，廣泛存在于自然界中，在嬰幼兒配方奶、臨床標本、植物等材料中均可檢出。與植物有關的腸桿菌包括阿氏腸桿菌、生癌腸桿菌（E.cancerogenus）、陰溝腸桿菌（E.cloacae）、陰溝腸桿菌溶解亞種（E.cloacae subsp.dissolvens）、溶解腸桿菌（E.dissolvens）、中間 腸 桿 菌（E.intermedius）、超 壓 腸 桿 菌（E.nimipressuralis）、水稻腸桿菌（E.oryzae）、梨形腸桿菌（E. pyrinus）、桑腸桿菌（E.mori）、阪崎腸桿菌（E. sakazakii）、E.radicincitans、E.ludwigii等[15?17]。一些腸桿菌屬菌株則會侵染植物引起寄主發病，但宿主范圍很狹窄，傾向于侵染木本植物。研究報道，可引起植物致病的腸桿菌屬菌株主要有以下8個種：引起白楊樹潰瘍病的生癌腸桿菌，導致玉米稈腐敗病的溶解腸桿菌，引起榆樹濕心病的超壓腸桿菌，引起梨樹葉片褐斑病的梨形腸桿菌，引起木瓜果實黃化病的阪崎腸桿菌，引起多種作物（椰子萎蔫病、榆樹濕心病、番木瓜果肉黃化病、洋蔥腐爛病、生姜莖腐病、夏威夷果灰果仁病、桑樹和辣椒枯萎落葉性病）病害的陰溝腸桿菌，桑樹枯萎落葉性病害的阿氏腸桿菌和桑腸桿菌等[16,18?25]。腸桿菌屬通過分泌一些化學物質使宿主植物發病，但不同的菌株其致病機理不一樣[26]。

阿氏腸桿菌是一類革蘭氏陰性、周生鞭毛、厭氧發酵型桿狀細菌，具有腸桿菌的普遍特征。腸桿菌屬菌株具有豐富的種群和基因遺傳多態性，菌株的多態性與菌株來源有關，但是菌株的遺傳結構和致病力與多態性不存在相關性[25]。目前，由阿氏腸桿菌引起的植物細菌性病害僅在桑樹上被發現[25,27]，該病原菌引起桑樹葉片黃化、枯萎、落葉和枝條頂端壞死，使植株產生枯萎和維管束褐變癥狀。本研究在番茄上發現阿氏腸桿菌會引起番茄細菌性髓部壞死病，其引發番茄發病的機理還不清楚，有待于進一步研究。目前該病只在福建和浙江有發現，其他省區是否發生尚不清楚。因此，應嚴格監控阿氏腸桿菌的動態，控制病害的傳播蔓延，對保證我國番茄安全生產具有重要現實意義。