李果斑病病原菌生物學(xué)特性及室內(nèi)毒力測定

舒 然，龍海江，龍友華，顧桂飛,3，楊敬之，尹顯慧*

（1.貴州大學(xué)獼猴桃工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽50025；2.貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所，貴州 貴陽550025；3.畢節(jié)市周驛茶場，貴州 畢節(jié)551700）

0 引言

【研究意義】李（Prunus salicinaLindl.）是薔薇科（Roaceae）李屬（Prunus）植物，原產(chǎn)于我國，經(jīng)濟(jì)價值高[1]。李是我國分布最廣的果樹之一，幾乎各省區(qū)均有野生種或栽培種[2]。在我國保存、栽培的品種主要有中國李（P. salicina）、杏李（P. simonii）、櫻桃李（P.cerasifera）和歐洲李（P.domestica）等[3]，在貴州省栽培的主要地方品種為蜂糖李、脆紅李和酥李等。李子具有豐富的營養(yǎng)，富含多種氨基酸和維生素[4]，廣受人們喜愛。近年來，貴州省李種植面積的不斷擴(kuò)大，各種病蟲害發(fā)生日益嚴(yán)重，嚴(yán)重影響李產(chǎn)業(yè)發(fā)展[5]。【前人研究進(jìn)展】李樹主要病害有李紅點(diǎn)病[6]、細(xì)菌性穿孔病[7]和褐腐病[8]等。筆者團(tuán)隊于2020年調(diào)查發(fā)現(xiàn)貴州安順市李種植基地受果斑病危害嚴(yán)重，果實發(fā)病后向內(nèi)凹陷，呈不規(guī)則的灰白色病斑，通過形態(tài)觀察結(jié)合ITS、EF-1α和RPB2序列分析明確其致病菌為藤倉鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）。研究表明，藤倉鐮刀菌可引起水稻惡苗病[9]、玉米莖腐病[10]、小麥赤霉病[11]等多種病害，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。此外，鐮刀菌屬真菌還會產(chǎn)生多種高毒性、低分子量的代謝產(chǎn)物，如玉米赤霉烯酮[12]、嘔吐毒素[13]、T-2毒素等多種次級代謝物，食用被其污染的食品會引發(fā)嚴(yán)重的食品安全問題[14]。【本研究切入點(diǎn)】李果斑病為李樹上新報道的病害，主要危害果實，其病原菌生物學(xué)特性及室內(nèi)毒力研究尚待深入探討。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究旨在明確李果斑病病原菌生物學(xué)特性，篩選有效控制該病害的殺菌劑，為探明該病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律及防控該病害奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株及培養(yǎng)基：李果斑病病原菌藤倉鐮刀菌（F. fujikuroi，菌株編號HJGF1），由貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所提供。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨（Beef extract peptone，BEP）培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂（Potato sucrose agar，PSA）培養(yǎng)基、察氏（Czapek）培養(yǎng)基、胡蘿卜（Carrot agar，CA）培養(yǎng)基和燕麥瓊脂（Oatmeal agar，OA）培養(yǎng)基，各培養(yǎng)基參考宋莉莎等[15]的配方進(jìn)行配制。

供試藥劑：0.3%丁子香酚SL，南通神雨綠色藥業(yè)有限公司；20%吡噻菌胺SC，日本三井化學(xué)AGRO株式會社；30%丙硫菌唑OD，安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司；45%苯菌酮SC，巴斯夫（中國）有限公司；25%嘧菌酯SC，先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司；50%嘧菌環(huán)胺WDG，江西正邦作物保護(hù)有限公司。

1.2 李果斑病病原菌生物學(xué)特性測定

1.2.1 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響 將直徑5.0 mm

菌餅接于上述6種培養(yǎng)基（PDA、BEP、PSA、Czapek、CA和OA）平板中央，28℃恒溫培養(yǎng)，每個處理3次重復(fù)。7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑，下同。

1.2.2 李果斑病病原菌對碳、氮源的利用參照高晉等[16]的方法測定病原菌對不同碳、氮源的利用特性，以Czapek為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用含有等量的不同碳源、氮源置換Czapek培養(yǎng)基中的蔗糖、硝酸鈉，隨后采用5.0 mm無菌打孔器打取HJGF1病原菌邊緣菌餅，接種至含有不同碳氮源的培養(yǎng)基正中央，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d后，觀察病原菌生長狀況，測量菌落直徑，每個處理3次重復(fù)。

1.2.3 不同溫度對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

將培養(yǎng)5 d的HJGF1菌餅接種至PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d后，觀察病原菌生長狀況并測量菌落直徑，每個處理3次重復(fù)。

1.2.4 不同pH值對李果斑病病原菌菌絲生長的影響采用1 mol·L?1HCl和1mol·L?1NaOH分別將PDA

培養(yǎng)基pH調(diào)至4、5、6、7、8、9、10共7個處理，將培養(yǎng)5 d的HJGF1菌餅接種至PDA培養(yǎng)基平板中央，于28℃下恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)7 d后，觀察病原菌生長狀況并測量菌落直徑，每個處理3次重復(fù)。

1.2.5 光照對李果斑病病原菌菌絲生長的影響取菌餅移至滅菌處理后的PDA培養(yǎng)基平板上，分別于24 h黑暗、12 h明暗交替和24 h光照下28℃恒溫培養(yǎng)，每個處理3次重復(fù)。

1.3 李果斑病病原菌室內(nèi)藥劑篩選

藥劑篩選采用生長速率法[17]。依據(jù)初篩試驗結(jié)果，各藥劑分別設(shè)置5個質(zhì)量濃度梯度（表1），PDA培養(yǎng)基中加入一定劑量的供試藥劑，制成不同質(zhì)量濃度梯度的含藥平板，以加入等量無菌水的PDA平板為對照。將菌餅接種至不同質(zhì)量濃度梯度含藥PDA平板中央，置于28℃培養(yǎng)7 d，每個處理3次重復(fù)。測定方法同1.2.1，計算抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)并繪制圖表，運(yùn)用DPS7.05軟件并采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

如圖1所示，不同培養(yǎng)基對李果斑病病原菌生長速度的影響存在顯著差異。其中，病原菌在Czapek培養(yǎng)基上菌絲生長最快，培養(yǎng)7 d時，菌落直徑 為54.17 mm，生 長 速 率達(dá)7.74 mm·d?1；在PDA培養(yǎng)基上次之，生長速率為7.45mm·d?1，與Czapek培養(yǎng)基處理無顯著差異。致病菌在BEP、PSA、CA和OA培養(yǎng)基上也能生長，但速率較慢且菌絲較稀疏，在CA培養(yǎng)基上最慢，生長速率僅為5.40mm·d?1。

圖1 不同培養(yǎng)基對李果斑病菌菌絲生長的影響Fig.1 Effect of culture m edia onm ycelial grow th of F. fujikuroi

表1供試藥劑Table1 Fungicides evaluated

2.2 碳源對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

如圖2所示，李果斑病病原菌在不同碳源培養(yǎng)基上生長速率存在顯著差異，在以可溶性淀粉為碳源時最快，培養(yǎng)7 d菌落直徑為68.67mm，生長速率達(dá)9.81 mm·d?1；在以麥芽糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上次之，生長速率分別為8.76 mm·d?1、8.26 mm·d?1，在以蔗糖為碳源時，其菌絲生長量相對較少；以乳糖為碳源時菌絲生長緩慢，生長速率僅為6.14mm·d?1。

圖2 不同碳源對李果斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.2 Effect of nitrogen sources on m ycelial grow th of F.fujikuroi

2.3 氮源對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

如圖3所示，李果斑病病原菌在不同氮源培養(yǎng)基上均能生長。其中在以硝酸鈉為氮源時，其菌絲生長最快，菌落直徑為50.83 mm，生長速率為7.26 mm·d?1；以蛋白胨為氮源時次之，生長速率為7.14 mm·d?1；在尿素培養(yǎng)基上最慢，生長速率僅為6.10 mm·d?1，致病菌在不同氮源培養(yǎng)基上菌絲豐度差異不大，而在不含氮源培養(yǎng)基（CK）上菌絲稀疏，生長緩慢。

圖3 不同氮源對李果斑病菌病原菌絲生長的影響Fig.3 Effect of carbon sources on mycelial grow th of F.fujikuroi

2.4 不同溫度對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

如圖4所示，不同溫度對李果斑病病原菌菌絲生長具有顯著影響，該病菌在15～35℃內(nèi)均可生長，培養(yǎng)7 d時菌落直徑為15.33～53.67mm，其中最適生長溫度為25℃，菌落直徑為53.67mm，生長速率為7.67mm·d?1；培養(yǎng)溫度在15℃以下或35℃以上時菌絲生長受到明顯抑制。

圖4 不同溫度對李果斑病菌菌絲生長的影響Fig.4 Effect of culture tem perature on m ycelial grow th of F.fujikuroi

2.5 不同pH對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

如圖5所示，李果斑病病原菌在pH 4～10范圍內(nèi)均可生長，且病原菌菌絲生長速度隨pH值升高呈先增加后降低趨勢。適宜病原菌生長的pH為7～8，菌絲生長速率為5.83～6.33mm·d?1，說明該致病菌對堿性環(huán)境具有一定耐受力，在酸性環(huán)境中生長速度相對較慢。

圖5 不同pH對李果斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.5 Effect of pH on mycelial grow th of F. fujikuroi

2.6 不同光照對李果斑病病原菌菌絲生長的影響

由圖6可知，病原菌在24 h持續(xù)黑暗、24 h持續(xù)光照和12 h光暗交替條件下均能生長。培養(yǎng)7 d時，菌落生長速率分別為7.55mm·d?1、7.45 mm·d?1、7.40mm·d?1，處理間差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 不同光照條件對李果斑病病原菌菌絲生長的影響Fig.6 Effect of light exposure on m ycelial grow th of F. fujikuroi

2.7 不同殺菌劑對李果斑病病原菌室內(nèi)毒力

如表2所示，不同殺菌劑對李果斑病病原菌的室內(nèi)毒力存在顯著差異。其中，45%咪鮮胺EW對李果斑病病原菌抑制效果最佳，EC50為0.891 4μg·m L?1；其次分別為20%吡噻菌胺SC和30%丙硫菌唑OD，EC50分別為0.943 6μg·m L?1和1.022 0μg·m L?1；45%苯菌酮SC對該病菌的抑制效果最差，其EC50值為19.640 3μg·m L?1。

表2 7種殺菌劑對李果斑病病原菌的室內(nèi)毒力測定Table 2 Indoor toxicity test results of 7 fungicides on F.fujikuroi

3 討論

鐮刀菌屬（Fusariumspp.）分布廣泛，種類繁多，可致多種植物病害從而造成作物大量減產(chǎn)，已有研究發(fā)現(xiàn)，鐮刀菌屬能引起蔬菜[18,19]、中藥材[20]、果樹[21]和綠肥[22]等作物根腐病及薯類[23]和油料作物干腐病等[24]，給我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。藤倉鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）是引起水稻惡苗病的重要致病菌[25]，該致病菌還可引起百香果葉部病害[26]、大豆種腐病[27]、玉米莖腐病[28]等多種病害。目前，關(guān)于李果實致病菌藤倉鐮刀菌生物學(xué)特性及其防治藥劑的篩選鮮有報道，本研究初步明確李果斑病致病菌生物學(xué)特性，并篩選有效防治該病害的藥劑，可為生產(chǎn)上防控李果實病害奠定基礎(chǔ)。試驗結(jié)果表明，藤倉鐮刀菌在Czapek和PDA培養(yǎng)基上生長狀況最好，菌絲量大，這與前人[27]研究結(jié)果不同，可能與種間差異及寄主不同有關(guān)；藤倉鐮刀菌適宜生長溫度范圍為20～35℃，最適生長溫度為25℃，這與王燕等[29]報道的鐮刀菌屬的甜瓜果腐病菌最適生長溫度相符；病原菌能有效利用供試6種碳源及5種碳源，其中最佳氮源為硝酸鈉和蛋白胨，最佳碳源為可溶性淀粉，與侯恩慶[30]結(jié)果基本一致。不同光照條件對該病原菌菌絲生長速度無顯著影響，與姜蘇月等[31]研究結(jié)果一致。李果斑病病原菌在pH為4～10均可生長，最適生長pH為8，在弱堿性或中性條件下生長力較強(qiáng)，與侯恩慶[30]報道的相一致。

化學(xué)藥劑是防治植物病害最主要的手段，李果斑病為在李樹上新報道的病害，其防治藥劑有待深入研究。陳宏州等[25]研究表明，95.2%咪鮮胺原藥能有效抑制藤倉鐮刀菌的生長，EC50為0.01μg·m L?1；朱廣啟等[32]試驗表明，5%嘧菌酯SC能抑制引起黃芩根腐病的茄病鐮刀菌生長；周鑫鈺[33]研究發(fā)現(xiàn)，40%咪鮮胺EW和50%多菌靈WP對藍(lán)莓根腐病菌毒力 較 強(qiáng)，其EC50分 別 為0.071 59 mg·L?1和2.832 9 mg·L?1。彭昀等[34]研究幾種殺菌劑對橡膠樹枯萎病菌尖孢鐮刀菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，97.3%咪鮮胺、96%吡唑醚菌酯和97.2%多菌靈原藥對尖孢鐮刀菌的毒力較好，EC50值分別為0.73、1.71、1.01 mg·L?1。本試驗測定7種殺菌劑對藤倉鐮刀菌的室內(nèi)毒力，結(jié)果表明，45%咪鮮胺EW、20%吡噻菌胺SC和30%丙硫菌唑OD對該致病菌室內(nèi)毒力較強(qiáng)，其EC50值 分 別 為0.8914、0.9436、1.0220μg·m L?1。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，化學(xué)藥劑對病害的實際防治效果易受多種因素影響，因此還需進(jìn)一步開展田間試驗以明確本試驗中化學(xué)藥劑的實際防效。

4 結(jié)論

李果斑病病原菌適宜在Czapek和PDA培養(yǎng)基上生長，最適pH值為7～8，最適生長溫度為25℃，以淀粉和葡糖糖為碳源、蛋白胨和硝酸鈉為氮源時生長較好；室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示，45%咪鮮胺WDG和20%吡噻菌胺SC對李果斑病病原菌抑制作用最強(qiáng)。