短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX對龍眼焦腐病菌的生物防治作用

車建美，劉國紅，陳倩倩，劉 波

（福建省農業科學院農業生物資源研究所，福建 福州350003）

0 引言

【研究意義】龍眼焦腐病菌[Lasiodiplodiatheobromae（Pat.）Griffon&Maubl.]是龍眼采后病害的主要病原菌之一，采前以潛伏狀態存在，果實采收后，遇到合適的溫度和濕度，其菌絲穿透龍眼內果皮，侵染果肉，破壞果肉細胞組織結構，引起龍眼果實大量腐爛[1]，從而縮短龍眼果實的貨架期，給龍眼的采后儲運造成巨大的病害威脅[2]。因此，探尋安全有效的龍眼焦腐病菌生物防治技術，可為解決龍眼采后儲運問題奠定基礎。【前人研究進展】短短芽胞桿菌（Brevibacillus brevis）可形成抗逆性強的芽孢，具有很強的環境適應力，這些優點為其應用提供便利[3?5]。短短芽胞桿菌應用廣泛，主要包括生物防治[6]、水質凈化[7]和表達載體[8]等。從美國黃石國家公園土樣分離到一株短短芽胞桿菌菌株S1039，其產生的抑菌物質粗提物具有良好的抑菌活性，并且耐高溫、耐堿性物質，對胰蛋白酶、胃蛋白酶不敏感，能夠抑制革蘭氏陰性菌及陽性菌的生長[9]。從紫花苜蓿根際土中分離出的短短芽孢桿菌CY-42，其發酵液可以導致尖孢鐮刀菌菌絲及孢子生長異常，出現菌絲扭曲、斷裂、破碎，孢子數量明顯減少等現象，對由尖孢鐮刀菌引起的紫花苜蓿根腐病的相對防效為64.03%[10]。【本研究切入點】短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX為本實驗室分離得到的一株生防菌株[11?12]，該菌株對革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌和不同的真菌均具有較好的抑制效果[12]，對枇杷、龍眼等果實具有較好的保鮮效果[13?14]。短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX可以抑制龍眼采后腐生細菌和真菌的生長，處理后的龍眼好果率明顯高于對照處理，并且可以減少脫粒率[13]。然而關于短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX對龍眼焦腐病菌生物防治有待深入研究。【擬解決的關鍵問題】分析短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX對龍眼焦腐病菌的生長和形態的影響，并研究其發酵液的生防效果及對龍眼果實防御酶活性的影響，以期為短短芽胞桿菌在龍眼焦腐病菌的采后生物防治應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

短短芽胞桿菌（Brevibacillus brevis）FJAT-0809-GLX和龍眼焦腐病菌[Lasiodiplodia theobromae（Pat.）Griffon&Maubl.]FJAT-3586由本實驗室分離并保存。細菌培養采用NA培養基。龍眼焦腐病菌FJAT-3586培養采用PDA培養基。

1.2 離體條件下對龍眼焦腐病菌生長的影響

1.2.1 發酵上清液和菌體對龍眼焦腐病菌生長的影響挑取短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX單菌落于NA液體培養基中，30℃、180 r·min?1培養12 h后，按1%接種量接入NA液體培養基中，30℃、180 r·m in?1培養48 h后，13 000 r·m in?1離心2m in，取上清液備用。采用無菌水將菌體含量調至1×106個·m L?1。龍眼焦腐病病原菌FJAT-3586于PDA培養基培養5 d，取5 m L無菌水輕輕沖洗病原菌，制備病原菌孢子懸浮液（1×106個·m L?1）。取2m L龍眼焦腐病菌孢子懸浮液與20 m L PDA培養基混勻涂板，待其凝固后，采用打孔器打孔，孔徑為6mm，分別向不同孔中加入50μL拮抗菌菌體、發酵上清液和無菌水，30℃培養48 h后，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。試驗重復3次。

1.2.2 不同培養時間發酵上清液對龍眼焦腐病菌生長的影響分別取培養2、8、16、24、32、48、72 h的短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發酵液，13 000 r·m in?1離心2m in，取上清液進行抑菌圈測定，測定方法同上，試驗重復3次。

1.2.3 不同添加量發酵上清液對龍眼焦腐病菌生長的影響分別添加1、5、10、20、50 m L的短短芽胞桿 菌FJAT-0809-GLX發 酵 上 清 液于200 m L PDA培養基中，制備平板，取6mm龍眼焦腐病菌菌餅于該平板上，以等量的無菌水為對照，28℃培養3 d，測定菌餅直徑并計算抑菌率。試驗重復3次。

式中，Φ對照為對照處理的菌落直徑，Φ處理為不同處理的菌落直徑，Φ菌餅為菌餅直徑。

1.2.4 對龍眼焦腐病菌菌絲形態影響的觀察將活化的龍眼焦腐病菌FJAT-3586在PDA培養基上培養5 d，取6 mm菌餅置于PDA平板中央，在距離菌餅3 cm左右劃線短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX，并以無菌水作為對照，30℃培養4 d。挑取少量靠近短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX處理的菌絲于載玻片上，滴加少量無菌水，蓋上蓋玻片，置于倒置顯微鏡觀察。

1.3 離體果實接種的防治效果

將短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發酵上清液用NB培養液稀釋20倍，備用；焦腐病菌FJAT-3586孢子液用無菌水稀釋至1×106個·m L?1。用蘸有75%酒精的酒精棉輕輕擦拭龍眼表面，晾干。將龍眼果實用短短芽胞桿菌發酵上清液浸泡30 s，晾干后再采用病原菌浸泡30 s。對照采用無菌水浸泡30 s，再采用病原菌浸泡30 s。每個處理30個，室溫放置3 d，統計龍眼果實的好果數量，計算好果率[好果率/%=（好果數量/全部數量）×100]。試驗重復3次。

1.4 對果皮防御酶活性的影響

取以上不同處理龍眼果皮組織1 g，加入10m L 0.05 mol·L?1磷酸緩沖液，研磨后于3 000 r·m in?1離心10 m in，取上清，用5 m L磷酸緩沖液提取沉淀2次，合并上清液定容至25m L作為粗酶液，4℃保存備用。參照王薇等[15]的方法進行SOD和CAT活性測定。

1.5 數據處理

采用M icrosoft Excel2010和SPSS 17.0進行數據統計分析，Duncan's法進行多重比較，結果用平均值±標準差表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 離體條件下對龍眼焦腐病菌生長的影響

2.1.1 發酵上清液和菌體對龍眼焦腐病菌生長的影響短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發酵上清液和菌體對龍眼焦腐病菌生長影響不同。如圖1所示，發酵上清液對龍眼焦腐病菌生長具有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑為15.77mm；菌體具有微弱的抑制效果，抑菌圈直徑為3.84 mm；對照無菌水則無抑菌效果。

圖1 發酵上清液和菌體對龍眼焦腐病菌的抑菌圈Fig.1 L. theobrom ae inhibition zone shown on m edium by ferm entation supernatant or bacteria cells

2.1.2 不同培養時間發酵上清液對龍眼焦腐病菌生長的影響將不同培養時間的短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發酵上清液進行抑菌測定，結果表明，隨著培養時間的延長，發酵上清液對龍眼焦腐病菌生長的抑制作用逐漸增強（圖2）。培養2 h和8 h的發酵上清液對龍眼焦腐病菌的生長無抑制作用，培養16 h、48 h和72 h的抑菌圈直徑逐漸增大，分別為9.34、13.18、14.93 mm。

圖2 不同培養時間發酵上清液對龍眼焦腐病菌的抑菌圈Fig. 2 L. theobromae inhibition zonesonmedium treated w ith supernatantsof varied fermentation time

2.1.3 不同添加量發酵上清液對龍眼焦腐病菌生長的影響培養基中添加不同量短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發酵上清液對龍眼焦腐病菌生長的影響有所不同（圖3）。添加1 m L的發酵上清液對該病原菌的生長無抑制作用。隨著添加量的增多，抑制效果逐漸增強。添加5m L和10m L發酵上清液的抑菌率分別為28.30%和59.54%，添加50m L時，抑菌率可達74.17%。

圖3 不同添加量上清液對龍眼焦腐病菌生長的抑制效果Fig.3 Inhibition of fermentation supernatant in varied dosages on grow th of L. theobromae

2.1.4 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX對龍眼焦腐病菌菌絲形態的影響短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX對龍眼焦腐病菌菌絲生長形態具有一定的影響。對照組菌絲細長，頂端無膨大，分叉少；處理組菌絲較粗，顏色較對照組略微加深，頂端膨大明顯（圖4）。

圖4 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX對龍眼焦腐病菌菌絲形態的影響Fig.4 L. theobromae m ycelial grow th on medium w ith B. brevis FJAT-0809-GLX

2.2 離體果實接種的防治效果

不同處理后龍眼果實好果率有所不同。將龍眼果實用發酵上清液浸泡后，再采用病原菌浸泡，其好果率為68.33%，明顯高于采用病原菌浸泡龍眼果實的好果率（圖5）。果實的外觀也明顯不同，病原菌浸泡后，果實表面會長出病原菌菌絲，隨后果實出現水漬，直至全部腐爛。短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX處理后的果實表面菌絲生長較少，腐爛果實數量也較少。

圖5 不同處理龍眼果實好果率Fig. 5 Ratesof healthy longan fruit under various treatments

2.3 對果皮防御酶活性的影響

不同處理龍眼果皮防御酶SOD和CAT活性有所不同（圖6）。病原菌處理的龍眼果皮SOD和CAT活性分別為71.09、31.65 U·g?1·min?1。生防菌處理后再用病原菌處理，果皮SOD和CAT活性均升高，顯著高于病原菌處理的SOD和CAT活性（P＜0.05），分別為139.43、54.54U·g?1·min?1。

圖6 不同處理對龍眼果皮SOD和CAT酶活性的影響Fig.6 Effect of various treatm ents on SOD and CAT activities in longan fruits

3 討論與結論

短短芽胞桿菌對香蕉炭疽病[16]、草莓灰霉病[17]和蓮霧黑腐病[18]等不同病害具有較好的抑制作用，近幾年來越來越多地應用于植物病害的生物防治。付崗等[16]研究結果表明短短芽胞桿菌對香蕉炭疽病的防效為50.06%~65.74%。短短芽胞桿菌QGJ-6對番茄青枯病的生防效果達到82.4%[19]。本實驗室篩選得到的短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX處理后的龍眼果實好果率明顯高于病原菌單獨處理的好果率，可達68.33%，說明其對龍眼焦腐病菌具有較好的抑制作用，從而擴大了短短芽胞桿菌在植物病害生物防治的應用范圍。

短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發酵上清液、菌體對龍眼焦腐病菌生長的抑制效果不同，發酵上清液對龍眼焦腐病菌生長具有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑為15.77 mm。這與張平等[20]的研究結果類似，芽胞桿菌DLSB-1、DLSB-4和DLSB-13無菌發酵上清液均能抑制油茶炭疽病病原菌絲的生長，抑菌率最高可達81.14%。隨著培養時間的延長和添加量的增多，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發酵上清液抑菌效果也逐漸增強。貝萊斯芽胞桿菌SZAD1不同培養時間發酵液抑菌效果也不同，隨著培養時間延長，其抑菌圈直徑也逐漸增大，72 h上清液的抑菌圈直徑為48 h的抑菌圈直徑的3倍[21]。因此推測，隨著培養時間的延長，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發酵上清液中抑菌活性物質的累積也逐漸增多。

前人研究表明，大多數生防芽胞桿菌對病原菌菌絲形態具有一定的影響[22,23]。本研究也發現短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX處理后的焦腐病菌菌絲較粗，顏色較對照組略微加深，菌絲體分叉明顯增多、增長，頂端膨大明顯。暹羅芽孢桿菌（Bacillus siamensis）LZ88對煙草褐斑病菌菌絲的形態也具有一定的影響，并且會抑制孢子的萌發[24]。短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX可以抑制菌絲在果皮表面生長，病原菌處理的龍眼果實表面長滿菌絲，而短短芽胞桿菌處理后果實表面菌絲則較少。

植物免疫抗性酶SOD、CAT、PPO等均參與了刺激植物細胞過敏反應和防御反應，當遭遇不良環境時，植物通過調節體內多種抗性酶的活性，降低逆境對其造成的傷害[25]。枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）SSR2I處理后，番茄根、莖和葉片的SOD活性明顯提高[26]。本研究結果與之相似，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX處理后龍眼果實SOD和CAT活性均顯著高于病原菌處理。李君等[27]也發現，芽胞桿菌B3處理后，在第5天，核桃葉片中CAT、POD、PPO、活性比對照分別升高了3.60、1.60、4.56倍。因而推測，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX可以作為微生物誘導抗性劑進行植物病害防治，后續研究中，將就該菌株對相關酶基因表達影響進行深入研究，為其在龍眼焦腐病生物防治提供一定的理論依據。