貴州地方高粱抗炭疽病資源的田間鑒定

陳滿靜，曹紹書，譚金玉，阮仁超，李青風，高 杰，彭 秋，鄭常祥，鄧小鋒*

（1.貴州省農業科學院旱糧研究所，貴州 貴陽550006；2.貴州省農業科學院農作物品種資源研究所，貴州 貴陽550006；3.貴州省農業科學院園藝所，貴州 貴陽550006）

0 引言

【研究意義】高粱[Sorghum bicolor（L.）Moench]是繼玉米、小麥、水稻和大麥之后的世界第五大旱生作物，具有多種用途，可作為食品、飼料和釀酒的原料[1]。高粱炭疽病是發生在高粱生產中最為嚴重的病害，由于高粱炭疽病菌病原體種群在遺傳上高度多樣化，因此開展高粱種質資源炭疽病抗性鑒定，可為選育高粱抗炭疽病品種穩定抗病，同時為抗病基因的進一步研究奠定基礎。【前人研究進展】高粱炭疽病最早發現于西非，是由禾生炭疽菌（Colletotrichum sublineoiumP.Henn.，Kabát and Bubák）侵染所致，該病菌屬于無性態真菌炭疽病屬[2]。近年來，該病害在中國大部分高粱種植區域均有發現，特別是在四川、云南、貴州、甘肅等地區，是造成我國高粱生產較重大經濟損失的病害之一[3?4]。該病害嚴重降低籽粒品質及產量，導致感病品種減產36%的籽粒產量及67%的生物產量，在中國北方減產甚至達78%[5?6]。禾生炭疽菌可侵染高粱的所有地上部分組織，葉片侵染部位癥狀尤為明顯。典型病癥是葉片出現紅褐色（或紫色）細小病斑，逐漸發展為橢圓形或者細長的褐色斑點，病斑中間出現黑色的分生孢子盤。隨著病情發展，葉片組織逐漸死亡形成壞疽并連成片，因無法進行光合作用及營養物質缺失，植株最終枯萎死亡。許多研究結果顯示高粱宿主防御炭疽菌侵染的機理包括侵染位點的細胞及鄰近細胞合成3-脫氧花色素、H2O2、HRGP（Hydroxyproline-rich glycoproteins，富 羥 脯 氨酸糖蛋白）蛋白、黃酮類物質，細胞形成乳突、胼胝質沉積和蛋白質交聯結構[7?12]。抗性材料的侵染位點細胞及鄰近細胞釋放囊泡內含物中的3-脫氧花色素，殺死炭疽菌的侵染囊泡和宿主細胞本身，阻止其向周圍細胞侵染[9?10]，葉片上因此顯示出紅褐色或紫色的細小斑點。由于禾生炭疽菌種群具有豐富的遺傳多樣性[13]，因此篩選與鑒定穩定抗性的高粱遺傳資源是抗病研究與育種的基礎。印度國際半干旱熱帶作物研究所、美國農業部熱帶農業研究站及南方平原農業研究中心、德州農工大學（Texas A&M University）及中國遼寧省農業科學院植物保護研究所等機構使用各高粱遺傳資源基礎庫，已經篩選和鑒定了一批適應各生態區域的高抗、穩抗的遺傳資源[4,14?22]。【本研究切入點】貴州地方高粱資源具有穗密度合適、產量較高，適應西南地區栽種等特點，且資源相關研究也顯示其中的糯高粱資源具有較豐富的wx基因型[23]。在貴州，廣泛栽種的糯高粱主要作為醬香型白酒的釀造原料，2018年貴州全省共種植約8.67萬hm2糯高粱，其中4萬余 hm2是按照有機原料的標準進行生產[24]，需盡量避免農藥的使用，因此有關貴州高粱抗性資源的篩選有待深入探討。【擬解決的關鍵問題】本課題組于2011—2014年收集了一批貴州省的地方高粱資源，包括地方品種、農家種及野生高粱。本研究對其中283份貴州地方高粱資源進行為期兩年的炭疽病抗性鑒定，得到一批新的高粱抗原材料，以期為后續研究和品種選育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

283份高粱遺傳資源材料從貴州省各地收集，包括地方品種和農家種。資源分布信息如表1所示。

表1 炭疽病抗性鑒定地方高粱材料Table 1 Sources of sorghum cultivars for anthracnose-resistance identification

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗地設計 試驗于2016年、2019年在貴州省黔南州惠水縣好花紅鄉（26°0′39.29″N, 106°34′25.80″E）進行，該區域常年高溫、雨水充沛，適合真菌病害試驗。2015年在該試驗地已經進行了少部分高粱資源的炭疽病抗性鑒定和產量測定[25]。本試驗采用隨機區組設計，小區長3 m，行間距0.5 m，每行約20個單株，每個材料種植一個小區并設3次重復。按照常規方法對試驗地進行田間管理和施肥。

1.2.2 抗性鑒定2016年采用帶病的秸稈碎片作為侵染源，播種前將粉碎后的秸稈混旋于泥土中，讓種植的材料在田間自然感病；2019年除使用粉碎的帶病秸稈作侵染源之外，待幼苗長至6片葉時，還將收集的感病葉子均勻放置在整個試驗地的行間空地進行誘導發病。兩年均在灌漿中期鑒定材料感炭疽病的程度和確定抗性等級，根據材料葉部感病程度記錄等級數值，等級數值從1到7，根據Perumal和Burrell的方法[26,27]，略做改動，具體評價標準如表2所示。

表2高粱抗炭疽病害等級評價標準Table2 Evaluation criteria for grading sorghum anthracnoseresistance

1.2.3 等級數值的排列因為每個小區（重復）中所有的高粱單株感病程度都要觀察與記錄，因此許多小區內觀察到的等級數值有多個。為了反映材料的主要抗性等級數值，數值按照以下方法排列：如果一個資源的等級數值至少出現在兩個小區（重復）中，就排在抗性結果表的數值①列中，如果數值只出現在一個小區（重復）中，就排在數值②列中。如果資源有多個等級數值，數值的排序按照鑒定時該性狀單株的大致數量由多到少的順序進行。評估資源的抗性時，由數值①列中的鑒定數值進行評估。

2 結果與分析

2.1 兩年田間發病情況

2016年、2019年試驗地炭疽病害發病充分。灌漿的前中期病害發展處于最高峰，從葉片感病程度能完全分辨資源間的抗病性差異。在田間試驗過程中，因有6份抽穗期極晚的高粱資源，其抗性可能是假陽性[28]，為不影響結果分析，其鑒定數值不列入結果中。通過統計分析剩余的277份高粱資源的感病狀態，結果顯示，多份資源在2019年的發病程度要大于2016年，說明誘導發病方法上，將粉碎秸稈和感病病葉作為接種劑的方法比只有粉碎秸稈的方法能帶來更大的篩選壓力。

2.2 高粱資源的抗性等級

抗性鑒定結果顯示，2份高粱資源B39-2、F41兩年的抗性等級數值均為2，葉片有3′-脫氧花色素抗性反應形成的細小紫斑（B39-2）或紅斑（F41），但無分生孢子盤形成，表現為高度抗炭疽病。7份材料（表3中標記α）C22、C34、D1、F2、F10、F4、F15有分生孢子盤形成，但壞疽葉片面積較小，根據抗性等級標準，在2016年試驗的等級數值為3或者4，F15等級數值為5，表現為中抗。篩選出的這9份抗性材料具體等級數值如表3所示。

7份中抗材料在2019年試驗中有部分單株等級數值范圍從4到5-1，表現為中抗；有部分單株等級數值范圍從5-2到7，表現為感病，而且感病單株數要多于中抗單株數。分析此結果的原因有：⑴這些資源含有異質基因型；⑵試驗地小區間病害壓力并不均勻，在病害壓力特別大的區域超過資源承受能力后，表現為感病。⑶試驗地炭疽菌有不同生理小種，產生了不同程度的侵染現象。

鑒定結果顯示兩份材料E36、F4在2016年和2019年的抗性鑒定中等級數值存在極端等級的現象，反映出兩份資源含有異質基因型，其中的部分材料對炭疽病有較高抗性，具體鑒定結果如表4所示。277份高粱資源中剩余的266份均為感病材料，占所有鑒定資源的96%，其中有148份高粱資源在兩年的等級數值均為7，炭疽病害侵染程度特重，表現為高度感病。

表4 E36、F4抗性鑒定等級數值Tab le 4 Data on E36 and F4 graded for anthracnose-resistance

2.3 資源的其他特征

15份代表性高粱資源（表5中標記β）在2016抗性鑒定中表現為中抗，但在2019年鑒定中表現為高度感病。說明這些資源在較低病害環境中有一定抗病能力，但在高強度的病害壓力下會完全喪失抗病性。此外，結果分析中發現共有十幾份高粱資源，在2019年鑒定試驗里有多于2個的等級數值，說明這些資源含有異質基因型。

表5 15份地方高粱資源的2016、2019年抗性鑒定等級數值Tab le 5 Data on grading 15 sorghum specimens for anthracnose-resistance in 2016 and 2019

3 討論

3.1 試驗與分析方法的有效性

在開展炭疽病抗性資源鑒定研究中，大部分研究使用的侵染源是帶菌的種子或者孢子懸浮液，該方法的優點是炭疽菌有明確的生理小種，前期試驗條件均勻，但同時也需要在田間病害充分發展后進行鑒定與評估。在本次鑒定試驗中，2016年使用粉碎的秸稈作為侵染源，2019年同時使用粉碎的秸稈和保留于室內的感病病葉作為侵染源，進行田間發病后，依據資源的感病程度評估其對炭疽病的抗性。試驗結果顯示2019年的方法比2016年的方法帶來更大的病害壓力和選擇力度，該方法對高抗資源的選擇非常有利。經過兩年鑒定，2個高抗資源表現出了穩定的抗性。同時其他田間試驗也表明，鑒定的材料中如果沒有較大比例的高感材料隨機分布，只有抗性材料和部分抗性材料的存在，2019年采用的侵染源方法就不能發揮作用。

本研究中2016年采用的侵染源方法也有其科學意義，該方法能完全鑒定出高感資源。但該方法無法單獨區分結果中的中抗資源（標識為α類）與β類資源。結果分析中利用了兩年的比較結果，分析不同篩選環境下的等級數值，才鑒定出了α類與β類不同類別的資源類型。兩類資源對炭疽病都具有一定的抗性，但兩類資源都受病害強度的影響，中抗資源抗性的穩定性要大于后者。

研究中采用至少出現在兩個重復中的等級數值作為該資源每年的抗性評估依據，同時在結果表中也保留了只出現在一個重復中的等級數值。通過對后者的觀察與分析，推測這些數值的出現是由于以下原因：⑴試驗地病害壓力有小區域的差異導致侵染程度不同而形成的試驗誤差，⑵這些資源有異質基因型，⑶試驗地有不同生理小種，⑷種子污染。比較兩年的試驗結果，發現2019年數值②列中的數量明顯少于2016年，說明2019年的田間誘導方法所產生的更大鑒選壓力能減少試驗誤差。但同時也可能掩蓋部分資源有異質基因型的事實，特別是這些基因顯現出微效數量性狀的現象。

3.2 鑒定出的資源及后續研究

研究中鑒定的兩份高抗資源B39-2、F41在田間的表現是葉片有細小紫斑或者壞死紅褐色小點，沒有含分生孢子盤的炭疽菌斑。田間試驗中的炭疽菌群是混雜的，沒有明確的生理小種區分。因此后續試驗中需要收集和分離生理小種，對兩份資源進一步鑒定，以提高抗性評估的準確性及評估其適應性。

在進一步研究的基礎上，試驗中鑒選出的7份中抗資源也可以用于后續的品種選育等工作中。一般情況下，成熟耕地中炭疽病害壓力要遠遠小于研究中2016年試驗的鑒選壓力。由于中抗資源的抗性依賴于病害壓力的大小，其抗性承受有一定的范圍，因此對此類資源的后續研究需要重新設計試驗方案并結合炭疽生理小種來進行。

從277份地方資源中發現至少十幾份資源含有不同的等級數值，包括中抗資源類型、E36、F4等材料。特別是E36、F4材料，有著3、7和2、5-1這樣極端分布的等級數值，說明這批資源中有一些確實含有雜合基因型，特別是收集的農家種材料。在對這批資源進行wx基因型分析時也發現了此特征[24]。后續工作中，需對該類資源進一步篩選和純化。

3.3 使用中抗資源創制新抗性資源

兩年鑒定試驗表明貴州當地高粱材料中，對炭疽病的穩定抗性資源非常少。現有研究結果顯示炭疽菌對宿主防御反應的抑制或宿主防御相關基因的無義突變導致高粱宿主抵御炭疽菌侵染的無效性[5,8,12,29?31]。推斷這種抑 制是發生在宿主細 胞防御的信號轉導階段，而無義突變可發生在參與信號轉導的基因與下游被調控的功能基因序列中。鑒定的高抗資源F41，推斷其防御系統的上下游都能正常發揮功能；而鑒定的中抗資源，其防御系統的某部分受到了削弱。基于以上的推斷，后續工作中可對本研究中已經鑒定的中抗資源進行相互雜交，如果資源間基因位點能夠互補，可能從F2/F3分離群體中能鑒選出對炭疽病高抗的單株重組體，即新抗性資源。