miR-612 通過調控TMPRSS4 表達抑制IL-17 對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的機制

譚真 邱曉麗 孫建

（1 臨沂市經濟開發區人民醫院病理科,山東 臨沂 276023;2 臨沂市人民醫院;3 臨沂市河東區人民醫院）

研究表明腫瘤環境中炎癥因子對胃癌細胞遷移及侵襲具有一定促進作用，但關于其具體作用機制尚未完全闡明〔1〕。研究報道指出白細胞介素（IL）-17 可促進肝癌細胞遷移、侵襲〔2〕，但IL-17 對胃癌細胞遷移及侵襲的作用機制尚未闡明。微小RNA-612（miR-612）在非小細胞肺癌組織及細胞中呈低表達，過表達miR-612 可抑制細胞增殖、遷移及侵襲，促進細胞凋亡〔3〕。miR-612 在結直腸癌組織及細胞中表達水平降低，上調miR-612 可抑制癌細胞增殖及遷移〔4〕。相關研究發現抑制miR-612 表達可促進膽管癌發生及發展進程〔5〕。但miR-612 在胃癌發生及發展過程中的作用機制尚未可知，通過Targetscan預測顯示Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶（TMPRSS）4 可能是miR-612 的靶基因，TMPRSS4 在胃癌組織中高表達，抑制TMPRSS4 表達可抑制胃癌細胞遷移及侵襲〔6〕。TMPRSS4 可促進上皮間質轉化（EMT）進程而促進乳腺癌細胞增殖、侵襲及轉移〔7〕。TMPRSS4過表達可增強肝癌細胞遷移及侵襲能力〔8〕。但miR-612 是否可通過調控TMPRSS4 表達而抑制IL-17 對胃癌細胞遷移、侵襲的促進作用尚未可知。因此，本研究采用IL-17 作用于胃癌MKN-45 細胞，觀察IL-17 對胃癌細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，探究miR-612、TMPRSS4 與IL-17 在胃癌細胞增殖、遷移及侵襲過程中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 胃癌細胞株MKN-45 購自中國科學院上海細胞庫。DMEM 培養基購自美國Gibco 公司；胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素均購自美國Hyclone 公司；重組人IL-17 購自美國PEPROTECH 公司；MTT 購自美國Sigma 公司；Transwell 小室購自美國Corning 公司；反轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher 公司；基質膠購自美國BD 公司；Trizol、實時熒光定量PCR 試劑盒均購自北京天根生化科技有限公司；蛋白提取試劑盒、電化學發光（ECL）試劑盒均購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；兔抗TMPRSS4 抗體購自美國Abcam 公司；兔抗細胞周期蛋白（Cyclin）D1、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、p21 抗體購自美國Santa Cruz 公司；miR-612 mimic 及陰性轉染質粒、miR-612 抑制劑（anti-miR-612）及其對照（anti-miRNC）購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞轉染及分組 胃癌MKN-45 細胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM 培養基（100 U/ml青霉素、100 U/ml 鏈霉素），放入37℃、5%CO2體積分數培養箱內培養，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養，選取對數生長期細胞進行后續研究。收集對數生長期MKN-45 細胞，制備單細胞懸液（3 ×104個/ml），按照200 μl/孔的密度接種于6 孔板，細胞隨機分為Con 組（未經任何處理的細胞）、IL-17組（50 ng/ml 的重組人IL-17 作用于細胞48 h）〔9〕、anti-miR-NC 組（轉染anti-miR-NC）、anti-miR-612 組（anti-miR-612 轉染入MKN-45 細胞）、pcDNA 組（空質粒轉染入MKN-45 細胞）、pcDNA-TMPRSS4 組（TMPRSS4 過表達質粒轉染入MKN-45 細胞）、IL-17+miR-NC 組（miR-NC 轉染入MKN-45 細胞48 h，用50 ng/ml 的重組人IL-17 作用于細胞48 h）、IL-17+miR-612 組（miR-612 mimics 轉染入MKN-45 細胞48 h，用50 ng/ml 的重組人IL-17 作用于細胞48 h）。

1.2.2 qRT-PCR 檢測細胞中miR-612、TMPRSS4 mRNA 表達水平 用PBS 清洗MKN-45 細胞，加入Trizol，按照Trizol 法提取細胞總RNA，應用紫外分光光度計檢測RNA 濃度，取200 ng RNA 進行反轉錄合成cDNA，反應條件:37℃60 min，85℃5 s，反應結束后將cDNA 稀釋至100 μl，取1 μl cDNA、miR-612、TMPRSS4 上下游引物各1 μl，SYBR 熒光染料混合物12.5 μl，ddH2O 補足體系至20 μl，充分混合，轉移至8 聯PCR 管，每個樣本設置3 個復孔，應用熒光定量PCR 儀檢測，反應程序:95℃2 min（循環1 次），95℃30 s，60℃30 s，72℃30 s（循環40 次）。miR-612U6 為內參，TMPRSS4 以GAPDH為內參，采用2-ΔΔCt法計算胃癌細胞中miR-612、TMPRSS4 mRNA 的相對表達量。

1.2.3 MTT 檢測細胞增殖 收集對數生長期MKN-45 細胞，胰蛋白酶消化，調整濃度為5 ×104個/ml，以每孔體積100 μl 接種于96 孔板，置于37℃、體積分數5%CO2培養箱內培養，棄培養液，IL-17 組、IL-17+miR-NC 組、IL-17+miR-612 組分別在IL-17 作用24 h、48 h、72 h 時每孔加入20 μl MTT溶液，同時anti-miR-NC 組、anti-miR-612 組、pcDNA組、pcDNA-TMPRSS4 組分別在轉染24 h、48 h、72 h時每孔加入20 μl MTT 溶液，繼續培養4 h，每孔中加入150 μl 二甲基亞砜（DMSO），振蕩混勻，利用酶標儀檢測波長為490 nm 處各孔吸光度（OD）值。

1.2.4 Transwell 實驗檢測細胞遷移及侵襲 取各組對數生長期MKN-45 細胞，按照每孔1×105個細胞的密度接種于上層未鋪設基質膠的Transwell 小室以檢測細胞遷移能力，同時MKN-45 細胞按照每孔2×105個細胞的密度種植于上層平鋪基質膠的Transwell 小室以檢測細胞侵襲能力，Transwell 小室的上室使用不含血清的DMEM 培養基，Transwell 小室的下室使用含有10%胎牛血清的DMEM 培養基，常規培養24 h，用濕棉簽擦去未轉移及侵襲的細胞，多聚甲醛固定15 min，結晶紫溶液染色5 min，顯微鏡下觀察遷移及侵襲細胞數量。

1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測miR-612 靶基因 用Targetscan 預測軟件對miR-612 的靶基因進行預測，采用雙熒光素酶報告進一步確認Targetscan軟件預測結果，將胃癌細胞分成4 組，分別轉染miR-612 mimics+野生型WT-TMPRSS4、miR-NC+野生型WT-TMPRSS4、miR-612 mimics+突變型WTTMPRSS4、miR-NC+突變型WT-TMPRSS4，各組轉染后的細胞按照每孔1×104個細胞的密度種植于96孔板，繼續培養48 h，每孔加入100 μl 細胞裂解液，收集上清液，取上清液加入40 μl 螢火蟲熒光素底物，充分混合后測定熒光強度，取剩余上清液加入40 μl 海腎熒光素酶底物，充分混合后測定熒光強度，計算相對熒光素酶活性（螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值）。

1.2.6 蛋白免疫Western 印跡檢測TMPRSS4、CyclinD1、MMP-2、MMP-9、p21 蛋白表達 分別收集各組轉染胃癌細胞，利用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，吸取上清，采用BCA 法檢測蛋白濃度，取30 μg 蛋白進行10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），將蛋白轉印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，室溫條件下用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入蛋白一抗（稀釋比1 ∶1 000），一抗置于4℃振蕩孵育24 h，TBST 洗滌3 次，每次5 min，加入二抗（稀釋比1 ∶2 000），室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 次，每次5 min，加入ECL 試劑，應用凝膠成像系統及Quantityone 軟件檢測條帶灰度值。

1.3 統計學處理 采用SPSS21.0 軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結果

2.1 IL-17 對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響 IL-17 組48 h、72 h 胃癌細胞活力顯著高于Con 組（P＜0.05），遷移及侵襲細胞數均顯著增加（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），而p21 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖1、圖2、表1。

圖1 增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

圖2 胃癌細胞的遷移、侵襲(結晶紫染色,×200)

表1 IL-17 對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=9)

表1 IL-17 對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=9)

2.2 IL-17 對胃癌細胞中miR-612 和TMPRSS4 表達的影響 IL-17 組胃癌細胞中miR-612 表達水平與Con 組相比顯著降低（P＜0.05），TMPRSS4 mRNA 及蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖3、表2。

圖3 TMPRSS4 免疫印跡

表2 IL-17 對胃癌細胞中miR-612 和TMPRSS4 表達的影響(,n=9)

表2 IL-17 對胃癌細胞中miR-612 和TMPRSS4 表達的影響(,n=9)

2.3 miR-612 靶向調控TMPRSS4 的表達 Targetscan 軟件預測miR-612 的靶基因，結果顯示miR-612 與TMPRSS4 的3＇UTR 區存在結合位點，見圖4。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與WT-TMPRSS4、miR-NC 共轉染組相比，WT-TMPRSS4、miR-612 mimics 共轉染組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；而MUT-TMPRSS4、miR-NC 共轉染組與MUT-TMPRSS4、miR-612 mimics 共轉染組熒光素酶活性比較差異不顯著，見表3。表明miR-612 可靶向結合TMPRSS4。Western 印跡檢測結果顯示，相對于miR-NC 組（0.43±0.04），miR-612 組胃癌細胞內TMPRSS4 蛋白表達水平顯著降低（0.21±0.02；P＜0.05）；與anti-miR-NC 組（0.40±0.04）比較，antimiR-612 組胃癌細胞內TMPRSS4 蛋白表達水平顯著升高（0.84±0.08；P＜0.05），見圖5。

圖4 TMPRSS4 的3′UTR 中含有與miR-612 互補的核苷酸序列

表3 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)

表3 雙熒光素酶報告實驗(,n=9)

圖5 Western 印跡檢測TMPRSS4 蛋白表達

2.4 抑制miR-612 表達對48 h、72 h 胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響 相較于anti-miR-NC 組，antimiR-612 組胃癌細胞活力顯著增強（P＜0.05），遷移及侵襲細胞數均顯著增加（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），p21 蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖6、表4。

表4 抑制miR-612 表達對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=9)

表4 抑制miR-612 表達對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=9)

圖6 增殖、遷移侵襲相關蛋白免疫印跡圖

2.5 TMPRSS4 過表達對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與pcDNA 組比較，pcDNA-TMPRSS4 組48 h、72 h 胃癌細胞活力顯著增強（P＜0.05），遷移及侵襲細胞數顯著增加（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達上調（P＜0.05），p21 蛋白表達下調（P＜0.05），見表5、圖7。

圖7 TMPRSS4 和增殖、遷移侵襲相關Western 印跡

表5 TMPRSS4 過表達對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=9)

表5 TMPRSS4 過表達對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響(,n=9)

2.6 miR-612 過表達逆轉了IL-17 對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的作用 相較于IL-17+miR-NC 組，IL-17+miR-612 組胃癌細胞活力顯著降低（P＜0.05），遷移及侵襲細胞數均顯著減少（P＜0.05），CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），p21 蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），見圖8、表6。

圖8 TMPRSS4 和增殖、遷移侵襲相關蛋白表達

表6 miR-612 過表達逆轉了IL-17 對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的作用(,n=9)

表6 miR-612 過表達逆轉了IL-17 對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的作用(,n=9)

與Con 組比較:1）P＜0.05；與IL-17+miR-NC 組比較:2）P＜0.05

3 討論

胃癌轉移及侵襲與多種基因異常表達有關，腫瘤炎癥微環境可促進腫瘤細胞遷移及侵襲〔10〕。IL-17 是一種促炎細胞因子，其主要由Th17 細胞亞群及中性粒細胞分泌產生，研究表明IL-17 高表達量與胃癌患者預后不良相關，但關于其促進胃癌遷移及侵襲的機制研究尚未完全闡明〔11〕。IL-17 在乙型肝炎病毒（HBV）感染或炎癥性腸病等多種炎癥相關性腫瘤中均呈高表達〔12〕。本研究結果顯示IL-17作用胃癌細胞后，細胞增殖、遷移及侵襲能力明顯增強，與相關文獻報道相似〔13〕。提示IL-17 可促進胃癌細胞增殖、遷移及侵襲。

本研究進一步研究顯示，IL-17 干預胃癌細胞后，細胞中CyclinD1、MMP-2、MMP-9 蛋白表達水平明顯升高，而p21 蛋白表達水平顯著降低，已有研究報道指出p21 蛋白表達水平升高可抑制CyclinD1與CDK2 結合，抑制胃癌細胞增殖，MMP-2、MMP-9與胃癌細胞遷移及侵襲密切相關，其表達水平升高可增強胃癌細胞遷移及侵襲能力〔14〕。提示IL-17 可抑制p21 表達及促進CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達進而促進胃癌細胞增殖、遷移及侵襲。同時本研究結果顯示，IL-17 能夠抑制胃癌細胞中miR-612 表達，提示IL-17 增強胃癌細胞增殖、遷移及侵襲能力可能與miR-612 表達水平降低有關。研究表明miR-612 在卵巢癌中呈低表達，LncRNA LUCAT1 通過調節miR-612/HOXA13 而促進卵巢癌的惡性進展〔15〕。LncRNA H19 通過競爭性結合miR-612 而調控靶基因HOXA10 表達進而促進子宮內膜癌發生及發展〔16〕。miR-612 過表達可通過靶向抑制Espin表達而抑制黑素瘤細胞增殖、侵襲〔17〕。本研究結果表明抑制miR-612 表達后，胃癌細胞增殖、遷移及侵襲能力明顯增強，提示miR-612 過表達可能成為胃癌新的分子干預靶點。

生物信息學軟件預測miR-612 的靶基因，結果顯示TMPRSS4 可能是miR-612 的靶基因，雙熒光素酶報告實驗及Western 印跡實驗證實miR-612 可靶向負性調控TMPRSS4 的表達，進一步研究發現TMPRSS4 過表達可促進胃癌細胞增殖、遷移及侵襲，研究表明TMPRSS4 在非小細胞肺癌組織中呈高表達，其高表達量與患者臨床病理特征及預后不良密切相關〔18〕。TMPRSS4 在胃癌組織中表達水平升高，其表達水平與胃癌遠處轉移灶呈正相關，提示TMPRSS4 可能參與胃癌轉移過程〔19〕。干擾TMPRSS4表達可抑制肝癌細胞浸潤及遷移能力，TMPRSS4 過表達可增強癌細胞遷移及侵襲能力〔20〕。本研究結果提示IL-17 可能通過抑制miR-612 表達及促進TMPRSS4 表達從而增強胃癌細胞增殖、遷移及侵襲能力。本研究深入分析發現，miR-612 過表達可通過抑制TMPRSS4 表達而逆轉IL-17 對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的促進作用。提示miR-612 過表達可減弱IL-17 介導的胃癌細胞增殖、遷移、侵襲能力，其主要通過抑制TMPRSS4 表達而實現目的。

綜上所述，IL-17 可促進胃癌細胞增殖、遷移及侵襲，miR-612 過表達可通過調控TMPRSS4 表達而抑制IL-17 對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲的促進作用，為揭示炎癥與胃癌發生發展的關系提供實驗依據，可為胃癌分子靶向治療奠定理論基礎。