干擾lncRNA SNHG22抑制EPHA3基因對結直腸癌LoVo細胞周期與凋亡的影響

姜進平 朱鐘鐘 黃耿 程凱 羅海平

1鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）胃腸肛腸外科 435000；2鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）泌尿外科 435000

結直腸癌在大多數國家和地區的病例數呈現逐年增加的趨勢，是腫瘤相關死亡的主要原因之一［1］。對于中晚期結直腸癌患者，其預后較差，5 年生存率非常低［2］。探究結直腸癌發生的調控機制，有助于開發新的診斷標志物和治療靶標。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類新型小分子非編碼RNA，因為不具有編碼蛋白潛力，曾被認定為轉錄的“噪音”［3］。最近研究發現，lncRNA在染色質重塑、染色體失活、轉錄激活等生物過程中發揮重要功能［4］。lncRNA 已被證實作為抑癌基因或癌基因影響包括結直腸癌在內的很多腫瘤的發生、發展［5］。據報道，SNHG22 在甲狀腺癌、卵巢癌、胃癌等腫瘤中高表達，是惡性腫瘤進展的重要因素［6-8］。SNHG22 在結直腸癌中的生物學功能和潛在分子機制尚不清楚。本研究探討了干擾SNHG22表達對結直腸癌LoVo細胞周期和凋亡的影響，探討其在結直腸癌細胞中可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 結直腸癌LoVo 細胞購于美國典型培養物保藏中心；針對SNHG22 的小干擾RNA（si-SNHG22）、小干擾RNA 陰性對照（si-NC）購于上海GenePharma 公司；DMEM 培養基購于美國Gibco 公司；細胞周期試劑盒購于美國Sigma公司；Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen 公司；細胞凋亡試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司；實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）試劑盒購于日本TaKaRa公司；抗體GAPDH、Cyclin H、Caspase6、CDK3、促紅細胞生成素產生肝細胞A 型受體3（erythropoietin-producing hepatocellular receptor A3，EPHA3）購于美國CST公司。

1.2 細胞培養和感染 將LoVo 細胞在含10%胎牛血清的DMEM 培養基培養，保持在37 ℃、5%CO2環境下生長。轉染前一天，接種LoVo 細胞在12 孔板，使用Lipofectamine 3000 將si-SNHG22 或si-NC 轉染到LoVo 細胞，即si-SNHG22 組和si-NC 組。轉染5 h 后，替換為完全DMEM培養基。

1.3 qRT-PCR 檢測SNHG22 和EPHA3 信 使RNA（mRNA）的表達 采用TRIzol試劑從轉染后的LoVo 細胞中提取總RNA，采用PrimeScript RT 試劑盒逆轉錄為cDNA。qRT-PCR 擴增以GAPDH 為內源性對照。引物序列如下：SNHG22 正向引物5’-AGGAGAGCTGCTCTTCACAGG-3’，反向引物5’-TCCTAGGCTGAGTGTGTCTCC-3’；EPHA3 正向引物5’-ACTCTACGAGACTGCAATAGCA-3’，反向引物5’-TCCCCAAGATCCATTTGAGTGA-3’。采用2-ΔΔCt方法進行SNHG22和EPHA3 mRNA表達的計算。

1.4 流式細胞術評估LoVo 細胞周期 收集轉染后的LoVo細胞，70%體積分數的乙醇重懸固定5 h。采用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，加入PI試劑和RNA酶試劑，在培養箱內避光染色35 min。通過流式細胞儀分析LoVo細胞周期分布。

1.5 流式細胞術評估LoVo 細胞的凋亡 收集轉染后的LoVo 細胞，采用磷酸鹽緩沖液洗滌3 次，Annexin V-FITC試劑重懸細胞，加入PI 染液，4 ℃下避光染色35 min，補充Annexin V-FITC 試劑，使用流式細胞儀檢測LoVo 細胞早期凋亡和晚期凋亡，兩者之和即為細胞凋亡率。

1.6 Western blot 檢測蛋白表達 通過RIPA 緩沖液提取轉染后的LoVo 細胞總蛋白，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離40 μg 蛋白裂解物，轉移至聚偏二氟乙烯膜。10%脫脂牛奶將膜進行封閉。與一抗在4 ℃下孵育過夜（GAPDH、EPHA3、Cyclin H、Caspase6、CDK3 抗體均按1∶1 000 稀釋），然后與辣根過氧化物酶標記的二抗孵育4 h。采用ECL試劑顯影目標蛋白條帶。

1.7 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件分析實驗數據，計量資料符合正態分布，均以均數±標準差（±s）表示，每個獨立實驗均重復3 次，組間數據之間統計分析應用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SNHG22 在LoVo 細胞中的干擾情況 si-NC組 和si-SNHG22 組SNHG22 的表達分別為（1.07±0.15）和（0.22±0.04），si-NC 組SNHG22 表達是si-SNHG22 組的4.86 倍（P＜0.01），提示干擾SNHG22 明顯降低LoVo 細胞中SNHG22的表達水平。

2.2 干擾SNHG22 阻滯LoVo 細胞周期 細胞周期結果（圖1）顯示，與si-NC 組相比，干擾SNHG22 明顯增加LoVo 細胞的G0～G1 期細胞比例（P＜0.01），明顯減少S 期細胞比例（P＜0.05）。

圖1 干擾SNHG22對LoVo細胞周期的影響

2.3 干擾SNHG22 促進LoVo 細胞的凋亡 細胞凋亡結果（圖2）顯示，si-NC組和si-SNHG22組LoVo細胞凋亡率分別為（10.84±3.22）%和（40.61±5.96）%。與si-NC 組相比，干擾SNHG22后，LoVo細胞的凋亡率明顯增加（P＜0.01）。

圖2 干擾SNHG22對LoVo細胞凋亡的影響

2.4 干擾SNHG22 抑制LoVo 細胞中EPHA3 mRNA 表達 si-NC 組和si-SNHG22 組LoVo 細胞中EPHA3 mRNA的表達分別為（1.31±0.12）和（0.31±0.06），與si-NC 組相比，干擾SNHG22 顯著降低LoVo 細胞EPHA3 mRNA 表達（P＜0.01）。

2.5 EPHA3 蛋白和凋亡及周期相關蛋白的表達Western blot 結果（圖3）表明，與si-NC 組相比，干擾SNHG22 明顯降低LoVo 細胞EPHA3 蛋白水平，顯著提高細胞凋亡蛋白Caspase6 表達水平，顯著降低細胞周期蛋白Cyclin H、CDK3表達水平。

圖3 干擾SNHG22對LoVo細胞EPHA3蛋白和凋亡、周期相關蛋白表達的影響

3 討 論

迄今為止，lncRNA 如SNHG6［9］、miR4435-2HG［10］、NEAT1［11］、CCAL［12］等被發現在結直腸癌組織或細胞株重表達失調，參與調節細胞周期、細胞凋亡、細胞轉移等各種生物過程。作為一種新型腫瘤促進因子，SNHG22在卵巢癌組織中表達顯著增加，并且與卵巢癌的低分化水平顯著相關，SNHG22 可以促進卵巢癌細胞的化療耐藥性，而敲低SNHG22 表達可以增強卵巢癌細胞對順鉑和紫杉醇的敏感性［6］。在甲狀腺乳頭狀癌組織和細胞株中觀察到高表達的SNHG22，其高表達水平與甲狀腺乳頭狀癌患者不利的臨床病理特征和較差的總生存率密切相關，敲低SNHG22 通過調節miR-429表達在體外有效抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖、遷移和侵襲，加速細胞凋亡［8］。SNHG22 在胃癌組織中高表達，SNHG22通過結合miR-361-3p促進胃癌細胞增殖、遷移、侵襲、細胞周期，抑制胃癌細胞凋亡［7］。以上的研究表明，SNHG22 是一個致癌lncRNA。SNHG22 對結直腸癌進展的影響尚需進一步研究。

為了確定SNHG22 在結直腸癌細胞中的詳細功能，本研究利用RNA 干擾技術下調LoVo 細胞中SNHG22 的表達水平，隨后在對LoVo 細胞周期和凋亡檢測中發現，干擾SNHG22表達顯著提高了LoVo細胞G0～G1期的細胞比例，減少了S 期的細胞比例，并且增加了LoVo 細胞的凋亡率。同時，Western blot 結果表明干擾SNHG22 可提高LoVo 細胞凋亡蛋白Caspase6 表達水平，降低細胞周期蛋白Cyclin H、CDK3 表達水平。這意味著干擾SNHG22 表達能夠顯著抑制結直腸癌的發生和發展。EPHA3基因定位于人類染色體3p11.2，EPHA3 蛋白首次被發現在B 淋巴白血病細胞表面，其結構高度保守。正常組織中EPHA3 蛋白呈微量表達，但其在多種實體瘤如胃癌、乳腺癌、膠質母細胞瘤等過度表達，其陽性表達率與腫瘤的血管形成、大小、分級、侵襲以及患者的生存率顯著相關［13-14］。EPHA3高表達水平與結直腸癌的分化程度、淋巴結轉移密切相關，過表達EPHA3 可促進結直腸上皮細胞的惡性轉化，在結直腸上皮細胞中發揮促癌功能［15］。本研究在qRT-PCR和Western blot測定中，檢測到干擾SNHG22 表達后，LoVo 細胞中EPHA3 基因表達水平顯著降低，提示干擾SNHG22 抗結直腸癌的功能可能是通過下調EPHA3基因的表達實現。

綜上所述，干擾SNHG22 表達通過下調EPHA3 基因表達，抑制結直腸癌LoVo 細胞周期進展，誘導LoVo 細胞的凋亡，SNHG22 可能成為結直腸癌的診斷標志物和分子治療靶點。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突。