自身免疫性肝炎患者肝內組織駐留記憶性CD8+ T細胞的活化機制研究

劉巧燕 尤征瑞 馬 雄 唐茹琦

記憶性T細胞通常包括中樞記憶性T細胞(TCM)和效應記憶性T細胞(TEM)，前者主要在外周血和次級淋巴器官中循環遷移，而后者在外周組織、次級淋巴組織和外周血中富集[1]。近年來研究人員發現了一群新的記憶性T細胞亞群，不同于TCM和TEM的是，其不參與外周循環，長期駐留于特定的器官組織內，如皮膚、肺和胃腸道等，被稱為組織駐留記憶性T細胞(TRM)，可在再次接觸相同抗原時迅速擴增而進行免疫防御[2]。TRM具有特定的表面標志物和相關轉錄因子，CD69和CD103是相對特異的TRM細胞表面分子。TRM細胞的產生和駐留受到局部組織微環境中特定信號分子的調控，研究顯示IL-15對于TRM細胞在組織中的長期存活至關重要[3-4]。TRM在免疫應答中發揮著積極的作用，但自身抗原特異性TRM可對機體組織造成持續的損傷，與自身免疫性疾病的發生密切相關。研究顯示TRM參與炎癥性腸病、牛皮癬和多發性硬化癥等疾病的發生、發展[5-7]。

自身免疫性肝炎(AIH)是一種自身免疫反應介導的針對肝細胞的肝臟炎性疾病，主要特點為肝細胞損傷、免疫球蛋白G(IgG)升高、血清自身抗體陽性等，病理表現為界面性肝炎、玫瑰花結形成等。大多數AIH患者對糖皮質激素標準治療的應答良好，但少數患者的預后欠佳，可進展至肝硬化或終末期肝病階段，需行肝移植治療[8]。一項2021年的研究發現，AIH患者的肝臟中TRM數量顯著增多，且與疾病嚴重程度相關；對糖皮質激素治療應答患者的CD69+CD103+CD8+TRM細胞比例較非應答患者高[9]，因此尋找靶向TRM的新的治療方法對于這類患者尤為重要。本研究探討了AIH患者肝內富集的TRM擴增活化的分子機制，以期為通過靶向TRM治療AIH提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

Ficoll-Paque淋巴細胞分離液(美國GE公司)；RPMI1640培養基和熱滅活胎牛血清(美國Gibico公司)；重組人IL-2、轉化生長因子-β(TGF-β)(美國Peprotech公司)；重組人IL-15(美國R&D Systems公司)；雷帕霉素(美國MedChemExpress公司)；流式抗體(APC-CY7鼠抗人Live/Dead抗體、BV605鼠抗人CD8 抗體、BB700鼠抗人CD4抗體、BV510鼠抗人CD3抗體、PE-CY7鼠抗人CD69抗體、BB515鼠抗人CD103抗體和BV421-pAkt S473抗體)及Transcription Factor Phospho Buffer Set(美國BD Bioscience公司)；PE-Phospho-S6 Ribosomal Protein(Ser235/236)流式抗體(美國Cell signaling technology公司)；流式細胞儀(LSR Fortessa Ⅱ，美國BD公司)；CO2細胞培養箱(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1 體外誘導人CD69+CD103+CD8+T細胞 使用Ficoll-Paque淋巴細胞分離液無菌分離健康人外周血單個核細胞(PBMC)，用完全培養基(RPMI1640+10%熱滅活胎牛血清+10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素+50 mmol/L β-巰基乙醇+20 IU/mL IL-2)重懸PBMC，將5×105/mL重懸細胞加入24孔板中，每孔加1 mL。實驗組：向完全培養基中加入IL-15(50 ng/mL)，37 ℃、5% CO2培養箱中培養3 d，第3天收集細胞后全量換液，向完全培養基中添加TGF-β(50 ng/mL)，培養箱中再培養3 d，第6天收集懸浮細胞。空白對照組：除完全培養基中未加入IL-15和TGF-β外，其余處理與實驗組相同。10 nmol/L、100 nmol/L雷帕霉素處理組：完全培養基中加入不同濃度雷帕霉素(10 nmol/L、100 nmol/L)，其余處理與實驗組相同。

1.2.2 細胞表面標志物染色 用流式染色緩沖液清洗細胞，再加入染色緩沖液，調整細胞濃度為1～2×106/100 μL，使用抗體(APC-CY7鼠抗人Live/Dead抗體、BV605 鼠抗人 CD8 抗體，BB700 鼠抗人 抗體，BV510 鼠抗人 CD3抗體，PE-CY7 鼠抗人 CD69 抗體，BB515 鼠抗人 CD103 抗體)進行表面標志物染色。設立空白對照及單染對照組以調整電壓和補償。

1.2.3 流式細胞術檢測IL-15刺激后S6和Akt的磷酸化水平 PBMC加入IL-15(50 ng/mL)誘導3 d，第3天收集懸浮細胞，離心制備單細胞懸液，先進行上述細胞表面標志物染色，流式緩沖液洗滌后重懸細胞，然后采用Transcription Factor Phospho Buffer Set進行磷酸化檢測，細胞破膜重懸后，加入磷酸化蛋白流式抗體PE-Phospho-S6核蛋白(Ser235/236)和BV421-pAkt S473進行磷酸化染色，緩沖液清洗細胞后重懸細胞，流式細胞儀檢測磷酸化蛋白的表達情況。1.3 統計學分析

采用Graphpad Prism 6.0軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，數據組間比較采用Studentt檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-15聯合TGF-β對CD69+ CD103+ CD8+ TRM細胞擴增能力的影響

TRM的標志物較多，根據不同的表面標志物可以定義不同的細胞亞群。本課題組的既往研究表明AIH患者肝內CD8+細胞中大部分為CD69+CD103+TRM，因此本研究中關注CD69+CD103+CD8+T細胞(CD8+TRM)；既往研究還發現IL-15和TGF-β在AIH患者肝內表達顯著升高，并與肝內CD8+TRM數量呈正相關；IL-15提供TRM的活化及長期存活信號，TGF-β可誘導CD103表達，促進其在肝臟組織中駐留，IL-15聯合TGF-β可在體外誘導CD69+CD103+CD8+TRM[9]。本研究利用健康人PBMC成功驗證了這一擴增體系：使用流式細胞術對IL-15聯合TGF-β誘導擴增出的CD8+T細胞進行免疫表型分析，結果顯示其中約12%為CD69+CD103+的CD8+T細胞，且細胞分群明顯，而空白對照組幾乎不存在CD69+CD103+的CD8+T細胞，實驗組和空白對照組的CD69+CD103+/CD8+細胞比例分別為(10.37±1.25)%、(0.49±0.09)%(P<0.000 1)，結果提示IL-15聯合TGF-β可誘導CD69+CD103+CD8+TRM細胞擴增。見圖1。

圖1 兩組CD69+ CD103+ CD8+ TRM誘導分化情況 A 流式細胞術檢測兩組的CD69+ CD103+ CD8+ TRM細胞比例 B 兩組的CD69+ CD103+ CD8+ TRM細胞比例柱形圖

2.2 IL-15對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1/S6激酶信號通路的影響

既往研究顯示，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路激活可抑制次級淋巴組織中TEM的形成，但可促進非淋巴組織中TRM的擴增和激活[10]。另有研究表明IL-15可激活mTOR信號通路，繼而促進NK細胞的形成和活化[11]，然而，目前對于IL-15是否通過mTOR信號通路的介導誘導肝臟TRM形成仍不清楚。mTOR可以形成哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mTORC1)和mTORC2，繼而啟動不同的下游級聯反應。mTORC1活化后主要通過S6激酶(S6K)磷酸化S6轉導下游信號。本研究探討了IL-15對TRM的誘導擴增作用是否通過mTORC1信號通路的介導。采用流式細胞術檢測IL-15處理3 d后對體外CD8+T細胞S6磷酸化水平的影響，結果表明體外使用IL-15刺激健康人PBMC可促進S6磷酸化，表現為磷酸化S6(pS6)的平均熒光強度(MFI)顯著增強，實驗組和空白對照組的MFI分別為2 233.00±195.30、839.20±79.07，P<0.000 1)，結果提示IL-15對于肝臟TRM的誘導擴增作用可通過mTORC1/S6K信號通路介導。見圖2。

注：與空白對照組比較，****P<0.000 1

2.3 IL-15對mTORC2/Akt信號通路的影響

mTORC2信號通路激活可促進Th2細胞和濾泡輔助性 T細胞(Tfh)分化，但尚無研究報道mTORC2在肝臟CD69+CD103+CD8+TRM中的作用[12]。mTORC2可磷酸化下游蛋白激酶B(Akt)，因此磷酸化蛋白激酶B(pAkt)水平及其相對變化可以反映mTORC2通路的活化程度。本研究采用流式細胞術檢測IL-15對肝臟TRM中Akt磷酸化的影響，結果表明體外使用IL-15刺激健康人PBMC對Akt磷酸化水平無影響，表現為pAkt的MFI無變化，實驗組和空白對照組的MFI分別為1 832.00±83.86、1 790.00±272.20，P>0.05，結果提示IL-15對mTORC2/Akt通路無影響，mTORC2/Akt通路未參與肝臟TRM的體外誘導及擴增。見圖3。

2.4 雷帕霉素對CD8+ TRM擴增的影響

上述結果表明肝臟TRM的產生需要mTORC1/S6K信號通路的激活，本研究隨后探討了阻斷該通路是否可有效抑制CD8+TRM的產生。在IL-15聯合TGF-β誘導CD8+TRM的體外擴增體系中用不同濃度(10 nmol/L和100 nmol/L)的mTORC1特異性抑制劑雷帕霉素預處理，采用流式細胞術檢測CD8+細胞中CD69+CD103+細胞的比例，結果表明雷帕霉素可有效阻斷IL-15聯合TGF-β對肝臟TRM的誘導擴增作用，且該抑制作用呈濃度依賴性，實驗組、10 nmol/L雷帕霉素處理組、100 nmol/L雷帕霉素處理組的比例分別為(10.37±1.25)%、(3.52±0.48)%、(2.14±0.24)%，實驗組與10 nmol/L雷帕霉素處理組之間、實驗組與100 nmol/L雷帕霉素處理組之間、10 nmol/L雷帕霉素處理組與100 nmol/L雷帕霉素處理組之間細胞比例的差異均有統計學意義(P<0.000 1，P<0.000 1，P<0.01)。見圖4。

注：與空白對照組比較，ns為P>0.05

注：與實驗組比較，****P<0.000 1；10 nmol/L雷帕霉素處理組與100 nmol/L雷帕霉素處理組比較，**P<0.01

3 討論

TRM可發揮快速免疫應答功能，其臨床應用價值一直是研究熱點。對腫瘤或感染患者，抗原特異性的TRM為有利因素，可幫助機體清除惡變細胞或病原體。研究表明卵巢癌、乳腺癌和肺癌等腫瘤患者，其病變部位CD103+CD8+T細胞的浸潤數量增加提示較長的生存期和較好的預后[13-15]。因此，許多研究關注直接上調TRM以提高機體的免疫防御功能。例如編碼卵清蛋白的牛痘病毒可通過促進TRM的產生以延緩表達乳清蛋白的黑色素瘤的生長[16]。一種新的布魯氏菌疫苗可通過誘導黏膜產生CD8+TRM而發揮抵御肺部和全身感染的功效[17]。然而，TRM可引起自身免疫性疾病特別是AIH患者肝臟的持續性損傷，因此聚焦于直接靶向TRM的藥物以減少AIH患者肝內TRM數量，進而可促進炎性反應緩解。由于TRM的亞群較多且功能復雜，目前缺乏下調肝內TRM數量或功能的相關機制研究。

TRM在基因表達和功能表型等方面與循環記憶性T細胞存在諸多差異，TRM可局部分化以適應組織微環境。研究發現IL-15高表達于AIH患者的肝臟，且與疾病嚴重程度呈正相關。本研究發現IL-15/mTORC1/S6K信號通路的激活是CD69+CD103+CD8+TRM增殖分化的重要環節，而mTORC2/Akt通路則不參與這一過程。Li等[18]的研究發現IL-15可激活mTOR信號通路，從而促進CD8+T細胞記憶性免疫應答的產生，這與上述結相符。mTOR信號通路可整合細胞內外多種信號，包括營養、能量及細胞因子、生長因子等，參與調控基因表達、表觀遺傳及代謝重塑等過程，與免疫細胞的增殖、分化密切相關[12]。此外，有研究指出許多自身免疫性疾病涉及mTOR信號通路的激活，其可促進促炎性免疫細胞的分化發育及炎性因子的產生，靶向mTOR信號通路為常規治療不應答的患者提供了新的治療方法[19]。

本研究進一步發現，使用mTORC1信號通路的特異性抑制劑雷帕霉素可顯著抑制肝臟TRM的產生，這與此前研究發現相一致，Sowell等[10]的小鼠模型研究發現，雷帕霉素可阻斷黏膜組織中CD103+CD8+TRM的形成，對CD8+T細胞介導的腸道自身免疫性炎性反應具有保護作用。因此，通過靶向mTORC1信號通路抑制CD69+CD103+CD8+TRM的形成對AIH的治療具有重要意義，值得深入研究。本研究尚存在不足之處，未進一步驗證IL-15擴增的CD69+C103+CD8+TRM相應轉錄因子的表達，未明確雷帕霉素處理對CD69+C103+CD8+TRM的細胞因子的影響，今后將進一步闡明IL-15影響mTORC1信號通路的具體機制，以及阻斷mTOC1信號通路對于細胞代謝的影響。