AFP和MKP-1對(duì)無(wú)法切除的肝細(xì)胞癌患者經(jīng)TACE術(shù)治療的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值

蔡越飛 王 凱 冼重楊 馬燕華 柴克斌

肝細(xì)胞癌(HCC)居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，并居全球惡性腫瘤死因的第2位，全球每年新增病例超過(guò)70萬(wàn)例，其中55%以上在中國(guó)[1-2]。目前早期HCC患者的首選治療方法仍為HCC根治性切除術(shù)，而對(duì)于多數(shù)不能行切除手術(shù)的中晚期HCC患者，經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化學(xué)治療栓塞術(shù)(TACE)成為了主要的治療方法，可提高患者的生存率[1-3]。無(wú)法切除的中、晚期HCC患者經(jīng) TACE 術(shù)治療后的短期療效評(píng)價(jià)指標(biāo)為腫瘤的影像學(xué)應(yīng)答和疾病進(jìn)展時(shí)間，主要借助影像學(xué)檢查，長(zhǎng)期療效評(píng)價(jià)指標(biāo)為患者無(wú)進(jìn)展生存率(PFS)和總生存率(OS)，目前尚缺乏對(duì)TACE術(shù)后患者遠(yuǎn)期生存情況的有效預(yù)測(cè)指標(biāo)。

絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)屬絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt)家族成員，可特異性分解MAPK的雙磷酸化位點(diǎn)，使MAPK去磷酸化而失活，從而下調(diào)MAPK/磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(pERK)信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌患者中，低表達(dá)的MKP-1與腫瘤的侵襲性及惡性程度呈正相關(guān)[4-6]。甲胎蛋白(AFP)是HCC 的腫瘤標(biāo)志物，目前AFP預(yù)測(cè)HCC患者的生存期及預(yù)后的相關(guān)研究結(jié)論存在差異。本研究探討了術(shù)前不同的MKP-1基因表達(dá)狀態(tài)及AFP水平對(duì)于無(wú)法切除的HCC患者經(jīng)TACE術(shù)治療后1年P(guān)FS和OS的影響，以期發(fā)現(xiàn)有效的生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)HCC患者采用TACE術(shù)治療的預(yù)后。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2016年1月至2018年12月在東莞東華醫(yī)院介入科首次接受TACE術(shù)治療的197例無(wú)法切除的HCC患者作為研究對(duì)象，收集患者的臨床資料，根據(jù)術(shù)前的MKP-1基因表達(dá)狀態(tài)和AFP水平進(jìn)行分組，分為MKP-1表達(dá)陽(yáng)性組(83例)和MKP-1表達(dá)陰性組(114例)，以及AFP≥400 ng/mL組(131例)和AFP<400 ng/mL組(66例)[AFP的均值分別為(753.4±104.6) ng/mL、(289.6±56.7)ng/mL]。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。首次接受TACE術(shù)治療后隨訪1年，記錄患者的PFS和OS。疾病進(jìn)展的判斷標(biāo)準(zhǔn)為首次TACE術(shù)后影像學(xué)復(fù)查顯示病灶增大或出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡20～72歲；(2)根據(jù)美國(guó)肝病研究學(xué)會(huì)(AASLD)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，經(jīng)臨床、影像學(xué)和病理檢查確診為HCC；(3)肝功能Child-Pugh A～B級(jí)；(4)臨床分期為Ⅰb期～Ⅲb期，無(wú)法行根治性切除術(shù)；(5)如患者術(shù)前檢查提示有腹水，則予抗感染、保肝、利尿等常規(guī)治療使腹水消退后再行TACE術(shù);(6)患者愿意配合且符合TACE術(shù)適應(yīng)證。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)肝功能Child-Pugh C級(jí)；(2)初診發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(3)有其他惡性腫瘤；(4)嚴(yán)重心、肺、腎功能不全；(5)隨訪期間因HCC以外的原因死亡；(6)臨床資料不全及無(wú)法正常隨訪者。

1.2 方法

1.2.1 TACE術(shù)治療方法 本研究采用超液化碘油3 mL(山東魯銀藥業(yè)有限公司，生產(chǎn)批號(hào): H20130012)和多柔比星60～80 mg(浙江瀚暉制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào): H33021980)制成的混懸劑栓塞微球。使用微導(dǎo)管超選至腫瘤供血?jiǎng)用}，先灌注奧沙利鉑100 mg(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào):H20093487)。隨后以1 mL/min的速度緩慢注入混懸劑栓塞微球，至對(duì)比劑流速停滯時(shí)停止。靜待5 min后再次造影，需栓塞至腫瘤染色完全消失，若仍有腫瘤染色則追加栓塞微球。介入過(guò)程中取病灶組織送病理檢查和免疫組織化學(xué)檢查。

1.2.2 MKP-1病理切片制作和免疫組織化學(xué)染色 將介入過(guò)程中獲得的病灶組織制成病理切片，常規(guī)進(jìn)行脫蠟、水化，用PBS洗3次，每次5 min，進(jìn)行抗原修復(fù)，用0.3% H2O2在37 ℃下孵育0～30 min以消除組織中內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，重復(fù)PBS步驟，再用1%牛血清白蛋白在37 ℃下孵育30 min，除去血清，放入1∶100的MKP-1和Santa Cruz(一抗)(上海愛(ài)必信生物科技有限公司)，4 ℃下孵育過(guò)夜，重復(fù)PBS步驟，然后加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)共軛的二抗(上海愛(ài)必信生物科技有限公司)，置于室溫下孵育30 min，重復(fù)PBS步驟，以DAB顯色5～10 min。

切片經(jīng)常規(guī)水洗、脫水、透明、H-E染色、中性樹(shù)膠封片后，在200倍顯微鏡下觀察。MKP-1表達(dá)情況的判定[6]：經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后，細(xì)胞質(zhì)著色者為MPK-1陽(yáng)性細(xì)胞；鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野觀察細(xì)胞質(zhì)著色情況，如有≥5個(gè)視野存在棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞占比≥30%則判定為MKP-1陽(yáng)性，<30%則為MKP-1陰性。

1.2.3 AFP檢測(cè) 應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)患者術(shù)前的血清AFP水平，正常參考值為0～20 ng/mL。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分別根據(jù)患者的術(shù)前MKP-1基因表達(dá)狀態(tài)及AFP水平進(jìn)行分組，采用 LSD-t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)分別比較MKP-1陽(yáng)性組與MKP-1陰性組及AFP≥400 ng/mL組與AFP<400 ng/mL組的臨床病理特征，采用Kaplan-Meier生存分析分別比較MKP-1陽(yáng)性組與MKP-1陰性組及AFP≥400 ng/mL組與AFP<400 ng/mL組在TACE術(shù)后1年的PFS和OS，采用Cox 回歸分析評(píng)價(jià)術(shù)前MKP-1基因表達(dá)狀態(tài)和AFP水平對(duì)無(wú)法切除的HCC患者經(jīng)TACE術(shù)治療后1年的PFS和OS的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同的術(shù)前MKP-1表達(dá)分組及AFP水平分組的臨床病理特征比較

如表1所示，MKP-1陽(yáng)性組與MKP-1陰性組的年齡、性別、感染病毒、肝硬化、Child-Pugh分級(jí)、巴塞羅那分級(jí)(BCLC)、門靜脈癌栓、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量、體力狀況ECOG評(píng)分等臨床病理特征的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。AFP≥400 ng/mL組與AFP<400 ng/mL組的上述臨床病理特征差異也均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)果提示MKP-1陽(yáng)性組與MKP-1陰性組、AFP≥400 ng/mL組與AFP<400 ng/mL組的各項(xiàng)臨床病理特征均具有可比性。

2.2 MKP-1陰性組與MKP-1陽(yáng)性組的TACE術(shù)后1年P(guān)FS和OS比較

Kaplan-Meier生存分析顯示，MKP-1陰性組在TACE術(shù)后6、9、12個(gè)月的PFS和OS均顯著低于MKP-1陽(yáng)性組(80.6%、51.4%、42.3%比100.0%、85.6%、71.6%，90.7%、68.5%、52.9%比100.0%、100.0%、78.7%，P均<0.05)。見(jiàn)圖1A、1B。

2.3 AFP≥400 ng/mL組與AFP<400 ng/mL組的TACE術(shù)后1年P(guān)FS和OS比較

Kaplan-Meier生存分析顯示，AFP≥400 ng/mL組在TACE術(shù)后6、9、12個(gè)月的PFS和OS均顯著低于AFP<400 ng/mL組(84.6%、57.6%、31.5%比100.0%、90.8%、58.4%，80.1%、52.7%、44.1%比100.0%、93.8%、81.9%，P均<0.05)。見(jiàn)圖1C、1D。

圖1 不同的術(shù)前MKP-1表達(dá)分組及AFP水平分組的TACE術(shù)后1年P(guān)FS和OS比較 A MKP-1陰性組與MKP-1陽(yáng)性組的TACE術(shù)后1年P(guān)FS比較 B MKP-1陰性組與MKP-1陽(yáng)性組的TACE術(shù)后1年OS比較 C AFP≥400 ng/mL與AFP<400 ng/mL組的TACE術(shù)后1年P(guān)FS比較 D AFP≥400 ng/mL組與AFP<400 ng/mL組的TACE術(shù)后1年OS比較

2.4 術(shù)前MKP-1表達(dá)對(duì)TACE術(shù)后1年P(guān)FS和 OS 的影響

將TACE術(shù)后1年P(guān)FS和OS作為因變量，MKP-1基因表達(dá)狀態(tài)作為自變量，分別代入單因素Cox回歸模型和多因素 Cox回歸模型，多因素校正的指標(biāo)為表1中所有臨床指標(biāo)，采用最大似然比前進(jìn)法，結(jié)果顯示術(shù)前MKP-1基因表達(dá)是HCC患者TACE術(shù)后1年P(guān)FS(HR=1.62，95%CI：1.12～4.15，P=0.023)和OS(HR=1.82，95%CI：1.44～4.78，P=0.035)的獨(dú)立影響因素。見(jiàn)表2。

表1 不同的術(shù)前 MKP-1表達(dá)分組及AFP水平分組的臨床病理特征比較

表2 術(shù)前MKP-1表達(dá)對(duì)TACE術(shù)后1年P(guān)FS和OS影響的Cox回歸分析

2.5 術(shù)前AFP水平對(duì)TACE術(shù)后1年P(guān)FS 和 OS的影響

將TACE術(shù)后1年P(guān)FS 和OS 作為因變量，術(shù)前AFP水平作為自變量，分別代入單因素 Cox回歸模型和多因素 Cox回歸模型，多因素校正的指標(biāo)為表1中所有臨床指標(biāo)，采用最大似然比前進(jìn)法，結(jié)果顯示術(shù)前AFP水平是HCC患者TACE術(shù)后1年P(guān)FS和OS的獨(dú)立影響因素。術(shù)前AFP水平每升高100 ng/mL，患者TACE術(shù)后1年內(nèi)HCC進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)增加1.23倍(HR=2.23，95%CI：1.59～4.81，P=0.006)，患者TACE術(shù)后1年內(nèi)HCC死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加1.09倍(HR=2.09，95%CI：1.53～4.87，P=0.014)。見(jiàn)表3。

表3 術(shù)前AFP水平對(duì)TACE術(shù)后1年P(guān)FS和OS影響的 Cox 回歸分析

3 討論

細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。細(xì)胞外的細(xì)胞因子通過(guò)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促使細(xì)胞分裂、凋亡、分化或合成腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子等。MAPK是細(xì)胞內(nèi)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，MAPK/pERK信號(hào)通路一方面可通過(guò)誘導(dǎo)HCC細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促使HCC的惡性度升高，另一方面可調(diào)控炎性因子的分泌，直接影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移[8-9]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MPK-1表達(dá)下調(diào)可激活MAPK/pERK信號(hào)通路，促使HCC細(xì)胞中炎性因子如TNF-α、趨化因子2(CCL2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)、IL-6、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及黏附分子等的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，促進(jìn)HCC細(xì)胞分泌上述細(xì)胞因子[10]。Li等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，HCC患者體內(nèi)細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的表達(dá)水平均顯著高于肝硬化患者和正常人群，認(rèn)為這些炎性因子分泌失調(diào)可促進(jìn)HCC的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制可能是炎性因子可激活炎性細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，維持慢性炎性反應(yīng)，促使腫瘤細(xì)胞增殖及惡性程度升高，抑制免疫反應(yīng)介導(dǎo)的腫瘤監(jiān)視，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

Lai等[12]的研究證實(shí)，MKP-1高表達(dá)可見(jiàn)于早期前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌中，而在這些腫瘤的晚期階段及腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，MKP-1的表達(dá)水平降低，可見(jiàn)MKP-1低表達(dá)提示腫瘤分期較晚，惡性程度較高，侵襲性較強(qiáng)，預(yù)后較差。本研究中，在MKP-1陽(yáng)性組與MKP-1陰性組的臨床病理特征差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性的基礎(chǔ)上，MKP-1陰性組在TACE術(shù)后6、9、12個(gè)月的PFS和OS均顯著低于MKP-1陽(yáng)性組(80.6%、51.4%、42.3%比100.0%、85.6%、71.6%，90.7%、68.5%、52.9%比100.0%、100.0%、78.7%，P均<0.05)，多因素Cox 回歸分析在校正了眾多混雜變量后，結(jié)果顯示MKP-1基因表達(dá)是HCC患者TACE術(shù)后1年P(guān)FS(HR=1.62，95%CI：1.12～4.15，P=0.023)和OS(HR=1.82，95%CI：1.44～4.78，P=0.035)的獨(dú)立影響因素。由此可見(jiàn)，MKP-1可用于預(yù)測(cè)TACE術(shù)后HCC患者的生存情況及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。目前在腫瘤晚期或侵襲、轉(zhuǎn)移時(shí)MKP-1表達(dá)下調(diào)的具體機(jī)制尚不明確，仍需進(jìn)一步探究。

AFP是一種酸性糖蛋白，由胎兒肝細(xì)胞產(chǎn)生，成人的血清AFP水平極低，而HCC、胃癌、膽管癌患者的血清AFP水平則明顯升高。血清AFP 水平可反映HCC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，與HCC的惡性程度密切相關(guān)[13]。多項(xiàng)薈萃分析顯示，血清AFP>400 ng/mL是影響TACE術(shù)后HCC患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[13-15]。夏冬東等[16]的研究探討了經(jīng)TACE術(shù)治療的HCC患者的AFP水平與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，AFP≥400 μg/L的患者的OS顯著低于AFP<400 μg/L的患者，且前者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)明顯高于后者。本研究中，Kaplan-Meier生存分析顯示，AFP≥400 ng/mL組在TACE術(shù)后6、9、12個(gè)月的PFS和OS均顯著低于AFP<400 ng/mL組(84.6%、57.6%、31.5%比100.0%、90.8%、58.4%，80.1%、52.7%、44.1%比100.0%、93.8%、81.9%，P均<0.05)，與上述研究結(jié)論相符。此外，Cox回歸分析顯示，術(shù)前 AFP 水平越高則HCC患者的TACE術(shù)后1年P(guān)FS和OS越低，術(shù)前AFP水平每升高100 ng/mL，TACE術(shù)后1年內(nèi)HCC進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)增加1.23倍，TACE術(shù)后1年內(nèi)死亡風(fēng)險(xiǎn)增加1.09倍。隨著術(shù)前AFP水平的升高，TACE術(shù)后6、9、12個(gè)月的PFS和OS呈降低趨勢(shì)。

綜上所述，術(shù)前AFP水平、MKP-1表達(dá)均為HCC患者TACE術(shù)后1年P(guān)FS和OS的獨(dú)立影響因素，術(shù)前AFP≥400 ng/mL、MKP-1表達(dá)陰性通常預(yù)示無(wú)法切除的HCC患者的TACE術(shù)后1年P(guān)SF和OS較低，術(shù)后腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較大，預(yù)后較差。上述指標(biāo)對(duì)于早期預(yù)測(cè)TACE術(shù)后HCC患者的預(yù)后、指導(dǎo)臨床決策、提供個(gè)體化治療具有重要的臨床意義。本研究尚存在不足之處，主要探討了術(shù)前AFP水平對(duì)HCC患者TACE術(shù)后生存情況的影響，但未對(duì)TACE術(shù)后AFP水平的變化對(duì)患者生存期的影響進(jìn)行觀察和分析，今后將進(jìn)一步研究探討。