牦牛乳硬質干酪成熟過程中生物胺與細菌群落結構分析

宋雪梅，宋國順，梁 琪,*，張 炎，張忠明

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省功能乳品工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

牦牛乳蛋白質量分數為6.53%，脂肪質量分數為5.64%，平均比荷斯坦牛乳高出1 倍以上，干物質質量分數為18.38%[1]，很適宜制作干酪。牦牛乳硬質干酪出品率較高、成熟期長、風味濃郁、營養價值高。然而干酪是富含蛋白質的發酵食品，其成熟過程中伴隨著酪蛋白降解而產生的游離氨基酸在干酪中存在的微生物作用下易產生生物胺。生物胺是世界范圍內公認的對人體健康有影響的物質，在不同國家均出現過因食用不同干酪（如Gouda、Swiss、Cheddar、Gruyere、Cheshire）而引起生物胺中毒的報道[2-3]。

不同干酪中各生物胺含量變化范圍較大[4]。干酪中生物胺種類和含量因其制作原料乳種類、工藝、成熟時間、干酪中微生物等而存在較大差異[5]。目前，生物胺引起人體中毒的限量因個體而異，很難建立統一的衡量標準[6]，除了對魚中組胺含量有規定外，對乳及其制品沒有強制規定生物胺最高限量。

生物胺是一定環境條件下，微生物氨基酸脫羧酶作用于游離氨基酸所形成。干酪中具有氨基酸脫羧酶活性的微生物對生物胺形成起著重要作用，這些微生物源自制作干酪的發酵劑或者生產過程中的污染菌[7]。乳酸菌是干酪中組胺和酪胺的主要生產者[4]。干酪中非發酵劑產生的生物胺含量高于乳酸乳球菌乳酸亞種和乳酸乳球菌乳脂亞種產生的[8]。Ladero等[9]運用熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法對乳制品中產胺菌株定量檢測時，發現糞腸球菌、短乳桿菌、彎曲乳桿菌和乳酸乳桿菌與腐胺積累相關。Shalaby等[10]發現乳酸鏈球菌和瑞士乳桿菌脫羧酶作用于組氨酸產生組胺。因此，通過分析干酪中微生物群落結構，有助于了解生物胺形成機理。

目前，對牦牛乳硬質干酪成熟過程中蛋白質降解及品質研究較多[11-12]，但是關于干酪成熟過程中生物胺的動態變化研究鮮見報道。因此，本實驗以此為切入點，研究牦牛乳硬質干酪成熟過程中生物胺的動態變化規律，同時解析干酪的細菌群落結構，為評價牦牛乳硬質干酪質量安全和探究生物胺形成的微生物機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牦牛乳采自天祝縣抓喜秀龍鄉；凝乳酶 北京多愛特生物科技有限公司；嗜熱發酵劑 丹尼斯克（中國）有限公司；組胺二鹽酸鹽、2-苯乙胺鹽酸鹽、酪胺鹽酸鹽、腐胺二鹽酸鹽、尸胺二鹽酸鹽、丹磺酰氯、L-脯氨酸、1,7-二氨基庚烷等均為分析純 美國Sigma公司；乙腈（色譜純）、亮氨酸、水合茚三酮、氯化鎘、乙醚、碳酸氫鈉（分析純）等均為國產試劑；E.Z.N.A? Mag-Bind Soil DNA Kit試劑盒 美國OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒 美國Life公司。

1.2 儀器與設備

干酪槽為甘肅省功能乳品工程實驗室自制；TGL-20M高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；PHS-3C精密pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；HWS26-電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；真空包裝機 溫州市大江真空包裝機械有限公司；2998 PDA四元梯度超快速液相色譜儀 美國Waters公司；WD-12氮吹儀 杭州奧盛儀器有限公司；Pico-21臺式離心機 美國Thermo Fisher公司；DYY-6C電泳儀電源、DYCZ-21電泳槽 北京市六一儀器廠；FR-1000凝膠成像系統 上海復日科技有限公司；ETC 811PCR儀 北京東勝創新生物科技有限公司；Q32866Qubit?3.0熒光計 美國Invitrogen公司。

1.3 方法

1.3.1 干酪制作和取樣

參考劉興龍等[13]的方法制作新鮮牦牛乳硬質干酪，真空包裝后，在4 ℃下成熟1～6個月。按照干酪成熟時間依次對其編號為SR1、SR2、SR3、SR4、SR5和SR6。將不同成熟期的干酪貯藏在－80 ℃，用于后續實驗。

1.3.2 干酪pH值測定

參考Jin等[14]的方法測定pH值。稱取干酪5 g，加入10 mL蒸餾水混合、勻漿后用pH計測定pH值。

1.3.3 干酪中游離氨基酸含量測定

參考Folkertsma等[15]的方法并作適當修改后測定干酪中游離氨基酸含量。稱取一定量切碎的干酪，按照料液比1∶9加入蒸餾水，研缽研碎，40 ℃下放置1 h，于3 000 r/min離心30 min，再用快速濾紙過濾。取過濾液30 μL，用蒸餾水稀釋到1 mL，加入2 mL鎘-茚三酮溶液，84 ℃反應5 min。冷卻后，于507 nm波長處測定吸光度。以亮氨酸為標準品制作標準曲線，通過標準曲線方程計算干酪中游離氨基酸含量。

1.3.4 干酪中生物胺含量測定

1.3.4.1 生物胺提取和衍生

參考Innocente等[16]的方法，稱取5 g研磨均勻的干酪于試管中，加入0.1 mol/L鹽酸10 mL和1 mg/mL 1,7-二氨基庚烷100 μL，均質2 min后，干酪漿液在12 000 r/min、4 ℃下離心20 min。收集上清液，用同樣方法浸提殘余物，將浸提液混合倒入容量瓶，用0.1 mol/L鹽酸溶液定容至25 mL。

吸取1 mL溶液，加入0.5 mL飽和碳酸氫鈉和1 mL（50 mg/mL）丹磺酰氯溶液于能夠密封的試管中，漩渦振蕩30 s后，40 ℃反應60 min。之后，加入200 μL的L-脯氨酸（100 mg/mL），漩渦振蕩1 min，在室溫黑暗處反應15 min。然后用1 mL乙醚萃取，4 ℃下離心3 min（3 000 r/min），吸取上層有機溶液，重復離心1 次，兩次離心所得有機溶液層混合并用氮氣吹干，將殘留物溶解于1 mL乙腈中，經0.22 μm膜過濾后進行測定。吸取1 mL不同質量濃度的混合標準品（組胺、2-苯乙胺、酪胺、腐胺、尸胺），加入相同的1,7-二氨基庚烷內標，按照上述方法進行衍生，并繪制標準曲線。

1.3.4.2 色譜條件

參考Moret等[17]的方法并適當調整后利用高效液相色譜儀測定生物胺含量。色譜柱：Symmetry C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；紫外檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL；流動相A為水，流動相B為乙腈；梯度洗脫條件：0 min，65% B；1 min，65% B；10 min，80% B；14 min，80% B；21 min，100% B；30 min，100% B。

1.3.5 DNA提取、PCR擴增和高通量測定

利用E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit提取試劑盒提取樣品中總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，Qubit定量檢測DNA樣本濃度。擴增16S rRNA基因V3～V4高變異區。通用引物分別為341F（5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’）和805R（5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’）。PCR擴增兩輪，第一輪PCR擴增體系（30 μL）：2×Hieff?Robust PCR Master Mix 15 μL、341F和805R各1 μL、10～20 ng模板DNA、9～12 μL ddH2O。擴增條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，循環5 次；之后，94 ℃變性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s，循環20 次；最后72 ℃延伸5 min；第二輪擴增引入Illumina橋式PCR兼容引物，其體系除模板DNA為20～30 ng之外，其余與第一輪相同。擴增條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性20 s；55 ℃退火20 s；72 ℃延伸30 s，循環5 次；之后72 ℃延伸5 min。擴增所得PCR產物純化回收后，構建文庫，最后進行高通量測序和分析（由生工生物工程（上海）股份有限公司協助完成）。

1.3.6 高通量測序數據處理

使用Cutadapt軟件去除引物接頭序列，再根據PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接成一條序列，然后按照barcode標簽序列識別并區分樣品得到各樣本數據，最后使用PRINSEQ切除reads尾部質量值20以下的堿基，最終過濾掉低復雜度序列，得到各樣本有效數據。

1.3.7 OTU聚類和物種注釋

使用Usearch軟件，按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，聚類過程中去除嵌合體，得到OTU代表序列，然后，使用RDP classifier比對RDP數據庫，對每個OTU對應的物種進行分類注釋，最終分別在門、綱、目、科、屬等分類水平上統計各樣本的群落組成。

1.4 數據處理與分析

每個處理重復3 次，理化數據結果用平均值±標準偏差表示，利用SPSS 19.0軟件對數據進行方差分析和Pearson相關性分析，利用Excel 2007軟件進行作圖。使用Mothur軟件進行Alpha多樣性分析，利用R軟件中的vegan package進行主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和作圖。

2 結果與分析

2.1 牦牛乳硬質干酪成熟過程中pH值和游離氨基酸含量的變化

pH 4.0～5.5對某些氨基酸脫羧酶活性具有重要影響。從表1可知，牦牛乳硬質干酪在1～6個月成熟過程中pH值變化趨勢平緩，pH值均在5.2～5.5，這為干酪中生物胺的形成提供了有利環境。游離氨基酸是制約生物胺形成的重要因素，如組氨酸脫羧酶和鳥氨酸脫羧酶的產生緊密依賴于游離氨基酸含量，且受到微生物生長階段的調控[18]。如表1所示，在1～6個月成熟過程中，牦牛乳硬質干酪中游離氨基酸含量呈現增加趨勢，且成熟6個月干酪中游離氨基酸含量比成熟1個月干酪顯著高出75.32%（P＜0.05）。

表1 牦牛乳硬質干酪成熟過程中pH值和游離氨基酸含量的變化Table 1 Changes in pH and total free amino acid contents in hard cheese made from yak’s milk during ripening

2.2 牦牛乳硬質干酪成熟過程中生物胺含量的變化

預實驗中利用高效液相色譜分別確定了組胺、2-苯乙胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、精胺和亞精胺等出峰時間。在測定牦牛乳硬質干酪中生物胺時，未檢測出色胺、精胺和亞精胺，因此，后續以2-苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺和酪胺這5 種生物胺為標準品，以不同質量濃度標準品與內標峰面積和質量濃度之比分別作為因變量與自變量，繪制標準曲線并得到標準曲線方程，分別為y=0.085 5x－0.014 4（R2=0.977 3）、y=0.158 1x－0.001 9（R2=0.999 4）、y=0.142x－0.000 5（R2=0.999 7）、y=0.121 4x+0.019 6（R2=0.997 7）和y=0.111 6x+0.002 1（R2=0.999 0）。通過標準曲線方程，計算出干酪樣品中各生物胺含量。不同成熟期牦牛乳硬質干酪中生物胺含量變化如圖1所示。

圖1 牦牛乳硬質干酪成熟過程中生物胺含量的變化Fig. 1 Changes in the contents of biogenic amines in hard cheese made from yak’s milk during ripening

從圖1可知，牦牛乳硬質干酪中的生物胺主要為腐胺、2-苯乙胺、酪胺、組胺和尸胺，這與大多數干酪中生物胺種類相同[19]。干酪中生物胺含量最高階段均出現在成熟后期5～6個月，這說明成熟期長的干酪含有較高生物胺含量，在大多數干酪品種中也存在類似現象。因此，成熟時間是導致生物胺積累的重要因素之一。

牦牛乳硬質干酪在1～6個月成熟過程中，其生物胺含量呈現增加趨勢，但是不同生物胺含量增長趨勢不同。2-苯乙胺和腐胺含量在前4個月成熟過程中增加緩慢，之后急劇增加，第6個月時，其含量最高。成熟6個月干酪中2-苯乙胺和腐胺含量分別是成熟4個月干酪中2-苯乙胺、腐胺含量的3.73 倍和3.06 倍，且兩者間差異顯著（P＜0.05）。尸胺在1～4個月成熟過程中含量呈現增加趨勢，第4個月時，尸胺含量達到最高，隨后小幅度降低后再升高，但是成熟6個月干酪中尸胺含量與成熟4個月干酪中差異不顯著（P＞0.05）。2-苯乙胺是二胺氧化酶和組胺N-甲基轉移酶的抑制劑。腐胺和尸胺含量的增多不但會影響干酪風味，還會通過抑制組胺氧化酶活性增強組胺毒性[20]。因此，需注意對牦牛乳硬質干酪中2-苯乙胺、腐胺和尸胺進行控制。

組胺和酪胺是兩種毒性相對較大的生物胺。牦牛乳硬質干酪中組胺在1～5個月成熟過程中含量呈現緩慢增加趨勢，成熟5個月時其含量達到最高,且與其他不同成熟階段的干酪存在顯著差異（P＜0.05）。干酪中酪胺在1～4個月成熟過程中含量呈現先上升再降低的趨勢，之后，其含量呈現增加趨勢，酪胺在成熟6個月干酪中含量最高，是成熟3個月干酪的1.99 倍，但是與成熟5個月干酪沒有顯著差異（P＞0.05）。成熟5個月干酪中組胺含量為（16.78±3.68）mg/kg，遠低于美國食品藥品管理規定的食品中組胺含量限量（不超過50 mg/kg）。成熟6個月干酪中酪胺含量為（62.33±6.11）mg/kg，也低于Brink等[21]建議的酪胺安全劑量（100～800 mg/kg）。

酪胺和腐胺是干酪中常見的、濃度較高的生物胺[22-23]，然而不同畜種乳制作的不同干酪中生物胺存在差異。Caciotta牛乳干酪中主要生物胺是腐胺和尸胺；Pecorino綿羊乳干酪中主要生物胺是酪胺和尸胺[24]。Lanciotti等[25]發現成熟末期綿羊乳干酪中生物胺含量為850 mg/kg。本實驗發現，牦牛乳硬質干酪中腐胺為主要生物胺，在1～6個月成熟過程，平均占總生物胺含量的50.01%。不同成熟期干酪的總生物胺含量低于（448.29±9.56）mg/kg。Spanjer等[26]建議干酪中酪胺、組胺、腐胺和尸胺總含量不應超過900 mg/kg，Taylor等[27]認為生物胺總含量低于1 000 mg/kg的食品是安全的。因此，從干酪中組胺、酪胺和總生物胺含量來看，牦牛乳硬質干酪處于安全范圍內。

2.3 牦牛乳硬質干酪中各生物胺、游離氨基酸含量和成熟時間之間的相關性分析

生物胺的積累依賴于對氨基酸的有效利用。由表2可知，牦牛乳硬質干酪中游離氨基酸含量和各生物胺含量、成熟時間之間存在正相關關系，其中游離氨基酸含量與腐胺含量、尸胺含量和總生物胺含量間均呈極顯著正相關性（P＜0.01），與2-苯乙胺、酪胺含量呈顯著正相關性（P＜0.05），這說明干酪中游離氨基酸含量對生物胺形成具有重要影響。在其他干酪研究中也得到類似結果[5]。成熟時間與游離氨基酸含量、各生物胺含量之間也具有較強正相關性，這進一步說明成熟時間的延長導致生物胺的積累。干酪中各生物胺含量之間存在正相關性，其中組胺含量和酪胺含量間呈顯著正相關性（P＜0.05），2-苯乙胺含量與腐胺、尸胺、酪胺含量之間呈現極顯著正相關性（P＜0.01），腐胺含量與尸胺、酪胺含量間以及尸胺含量和酪胺含量間也呈極顯著正相關性（P＜0.01），這說明生物胺的形成具有一定同源性。

表2 牦牛乳硬質干酪中各生物胺、游離氨基酸含量和成熟時間之間的相關性分析Table 2 Pearson correlation coefficients between ripening time and the contents of total free amino acids and biogenic amines in hard cheese made from yak’s milk

2.4 牦牛乳硬質干酪中細菌群落Alpha多樣性分析

Alpha多樣性是反映一個特定區域或生態系統的多樣性，主要通過Chao1、ACE等豐富度估計指數和Shannon、Simpson等多樣性指數來體現。從表3可以看出，Shannon指數在牦牛乳硬質干酪1～4個月成熟過程中呈現下降趨勢，在第5個月時呈現上升趨勢，之后又呈下降趨勢。這表明干酪的微生物多樣性在成熟過程中呈現先下降后上升再下降的變化趨勢。這主要由于是牦牛乳硬質干酪采用了真空包裝，干酪處于厭氧狀態中，隨著貯藏時間的延長和干酪中基質環境變化，部分微生物的生長繁殖受到抑制。另外，所有樣品Coverage指數接近1，表明使用的抽樣方案已經基本覆蓋了樣本中所有細菌，數據可用于后續分析。

表3 牦牛乳硬質干酪中菌落的Alpha多樣性指數Table 3 Alpha-diversity indexes of bacterial community in cheese samples

2.5 牦牛乳硬質干酪中細菌群落Beta多樣性分析

Beta多樣性是用來比較不同生態系統間群落的多樣性。通過可視化的PCoA圖能夠觀察和體現個體或群體間差異。本實驗利用基于Bray-Curits的PCoA圖解析不同成熟期牦牛乳硬質干酪樣品的細菌群落差異。

由圖2可知，第一主成分和第二主成分的貢獻率分別為64.92%、28.26%。成熟1～6個月的干酪樣品分布在4個區域。成熟2～4個月干酪樣品在相同區域，說明細菌群落結構相似，成熟1、5、6個月干酪樣品分別分布在不同區域，且與其他樣品距離較遠，說明其細菌群落結構有較大差異。這種差異也反映在不同成熟期干酪中生物胺的含量差異上。

圖2 不同成熟期牦牛乳硬質干酪樣品的主坐標分析Fig. 2 Principal co-ordinates analysis of cheese samples made from yak’s milk at different ripening periods

2.6 牦牛乳硬質干酪中細菌群落在門和屬分類水平的分析

為進一步了解不同成熟期牦牛乳硬質干酪中細菌群落結構，在門和屬水平對測序數據進行分類分析。從圖3可知，所有測試樣品包括兩個門，分別為厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），厚壁菌門相對豐度在84%以上，為優勢菌門。在1～6個月干酪成熟中，厚壁菌門相對豐度呈現增加趨勢，變形菌門相對豐度呈下降趨勢。

圖3 牦牛乳硬質干酪中細菌組成在門水平上的相對豐度Fig. 3 Relative abundance of bacterial phyla in cheese samples made from yak’s milk

由圖4可知，成熟1～6個月的牦牛乳硬質干酪包含鏈球菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬、拉烏爾菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬7個屬和無分類的腸桿菌科。不同成熟期干酪中鏈球菌屬相對豐度均高于79.6%，其平均相對豐度為84.63%，為主要優勢菌群，這與干酪制作過程中加入的發酵劑有關，其次為明串珠菌屬，其平均相對豐度為6.91%，乳桿菌屬平均相對豐度為3.97%，是干酪中第三優勢菌群。

圖4 牦牛乳硬質干酪中細菌組成在屬水平上的相對豐度Fig. 4 Relative abundance of bacterial genera in cheese samples made from yak’s milk

明串珠菌屬、拉烏爾菌屬、不動桿菌屬相對豐度在牦牛乳硬質干酪1～3個月成熟過程中呈現降低趨勢，在3～6個月成熟過程中，3個屬相對豐度呈現先上升后下降趨勢。明串珠菌屬相對豐度在第5個月時最高。干酪中腸桿菌屬，除成熟1個月干酪外，4個月成熟干酪中相對豐度最高。假單胞菌屬在干酪1～6個月成熟過程中，整體上呈現降低趨勢。乳桿菌屬在干酪1～3個月成熟過程中，呈現增加趨勢，之后，呈現先降低后增加趨勢，除成熟1個月干酪外，其平均相對豐度為4.61%。

一些學者在各種發酵劑的某些菌株中發現了酪氨酸和組氨酸脫羧酶[28-29]。嗜熱鏈球菌被發現具有產組胺和酪胺能力[30]。鏈球菌屬是牦牛乳硬質干酪中的主要優勢菌群，大量鏈球菌屬的存在對干酪中生物胺形成的影響作用不容忽視。大腸桿菌科和假單胞菌屬是原料乳中的常見菌，一些菌株含有脫羧酶，能夠產生組胺、尸胺和腐胺。明串珠菌屬的某些菌株也具有產胺能力。乳桿菌屬可能也含有脫羧酶，能夠產生組胺、酪胺、腐胺和尸胺[31]。以上分析進一步說明了牦牛乳硬質干酪中生物胺之間的相關性，同時表明除拉烏爾菌屬、不動桿菌屬之外，其他菌屬均存在產生物胺的可能性，后續將進一步深入對干酪中產胺微生物進行研究。

腸桿菌屬、明串珠菌屬、假單胞菌屬、拉烏爾菌屬、不動桿菌屬一般來自動物乳房、農場、擠奶環境以及與乳直接接觸的擠奶工人和容器[32]。牦牛乳采集于生活在青藏高原的牦牛，擠奶環境開放，擠奶方式為傳統的手工擠奶。雖然在牦牛乳硬質干酪制作過程中使用了熱處理，但是原料乳中部分微生物仍能夠存活并在干酪成熟過程中進行新陳代謝[33-34]，很可能參與到干酪中生物胺的形成中[35]。Nout等[36]認為生物胺含量低于100～200 mg/kg的食品可被消費者接受，因此，為了確保牦牛乳硬質干酪優質品質，需要重視擠奶環節，提高原料乳質量。

3 結 論

牦牛乳硬質干酪中主要生物胺為腐胺、2-苯乙胺、酪胺、組胺、尸胺。干酪中各種生物胺含量在1～6個月成熟過程中呈現增加趨勢。干酪中生物胺含量最高階段均出現在成熟后期5～6個月。干酪中組胺、酪胺和總生物胺含量分別低于推薦安全劑量50、100 mg/kg和1 000 mg/kg。干酪中游離氨基酸含量與除組胺之外的各生物胺含量、總生物胺含量、成熟時間具有顯著正相關性（P＜0.01，P＜0.05），各生物胺含量之間也存在正相關性。不同成熟期干酪包含鏈球菌屬、明串珠菌屬、乳桿菌屬、拉烏爾菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬7個屬和無分類的腸桿菌科。鏈球菌屬為優勢菌屬，其平均相對豐度為84.63%；明串珠菌屬次之，其平均相對豐度為6.91%，本研究為評估牦牛乳硬質干酪的質量安全性和生物胺形成機理提供了依據。