不同光照對蕎麥芽黃酮類化合物及相關代謝酶基因表達的影響

程佳麗，劉 軍，毛佳奇，李 翠，劉海杰

（中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京 100083）

蕎麥富含維生素、必需氨基酸和黃酮類化合物，是一種具有較高營養價值的作物[1-2]，但目前蕎麥多以原糧形式低價出售，精深加工和產品開發依然處于較落后的狀態[3]。我國是苦蕎產量最大、品種資源最豐富的國家，編入《中國蕎麥品種資源目錄》的品種有2 700余份[4]。不同品種蕎麥營養成分差別較大，但針對適于開發利用的蕎麥品種篩選的研究尚有不足。

發芽能夠使蕎麥總酚、總黃酮、縮合單寧等活性物質含量顯著增加[5-6]，口感得到改善，且蕎麥芽生產工藝簡單[7]，故蕎麥芽是一種值得研究的蕎麥產品。植物遭受逆境脅迫會啟動防御機制，產生更多具有生物活性的次級代謝產物，如外源添加Ca2+[8]、蔗糖[9]、殼聚糖[10]等均可增加蕎麥芽活性，而光照是一種易操作且有效的處理方式，研究表明光照處理可以提高植物及細胞的抗氧化活性[11]；發光二極管（light-emitting diode，LED）光源具有質量輕、體積小、節能等優勢，有巨大的市場應用潛力。

黃酮類化合物作為植物的次級代謝產物，是相關代謝酶與基因通過復雜的協同調控產生的。有研究表明，微酸性電解水處理[12]、超聲波和微波處理[13]能提高蕎麥芽中苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性，但目前針對相關酶基因表達方面的研究報道較少。本研究通過分析不同蕎麥品種的發芽形態及發芽后總酚、總黃酮的含量，選出本實驗條件下最適合生產蕎麥芽的品種，再進行LED白光、LED白光+紅光（記為紅光）、LED白光+藍光（記為藍光）光照處理，比較蕎麥芽中總酚、總黃酮含量，并分析不同光照下苦蕎芽中PAL、黃酮醇合酶（flavonol synthase，FLS）、查耳酮合成酶（chalcone synthase，CHS）及查耳酮異構酶（chalcone isomerase，CHI）基因的表達水平，從基因角度揭示其作用機理，以期為蕎麥及蕎麥芽的產業化和黃酮類化合物產生機理研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘晉蕎2號’‘黔苦3號’‘川蕎1號’‘西農9940’‘西農9976’‘貴紅花’‘溫莎甜蕎’種子由中國農業科學院提供；‘蒙古1號’‘蒙古2號’和‘蒙古4號’種子由內蒙古農業科學院提供。其中‘西農9976’‘貴紅花’‘溫莎甜蕎’為甜蕎品種，其余7個品種均為苦蕎品種。

甲醇、乙腈等高效液相色譜試劑（均為色譜級）北京化工廠；甲醇、Folin-Ciocalteau等（均為分析純）西隴科學股份有限公司；蘆丁、葒草苷、異葒草苷、牡荊素、兒茶素、槲皮素、槲皮苷、木犀草素標準品（均為色譜級） 國藥集團化學試劑有限公司；總RNA提取試劑盒、cDNA反轉錄試劑盒、熒光實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 北京全式金生物技術公司。

1.2 儀器與設備

KQ-600 DE數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；PRX-480C智能人工氣候箱（配有紅、藍、白LED光源） 寧波賽福實驗儀器有限公司；ME 204電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；TGL-185 M醫用離心機長沙平凡儀器儀表有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機北京四環科學儀器廠；10Avp高效液相色譜儀 日本島津公司；BCD-133EN冰箱 青島海爾股份有限公司；DL-CJ-1NDII潔凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司；HWS26電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科技有限公司；T100TMThermal Cycler PCR儀、CFX Connect熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司；Nano-300超微量核酸蛋白測定儀 北京原平皓生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蕎麥芽的制備

選種：剔除雜質和霉、蟲、壞種；殺菌：質量分數10%的次氯酸鈉溶液浸泡0.5 h，后用清水沖洗5～8 遍；浸種：在25 ℃黑暗條件下，水與種子以質量比4∶1浸泡18 h；催芽：將浸泡好的種子均勻擺在平鋪有濕紗布的育苗盤中，置于溫度25 ℃、相對濕度85%的黑暗環境中催芽48 h；發芽：溫度25 ℃、相對濕度85%條件下分別進行24 h黑暗（對照）及LED白光（12 250 lx）、紅光（12 250 lx LED白光+13 680 lx LED紅光）、藍光（12 250 lx LED白光+23 900 lx LED藍光）光照16 h（8 h黑暗）發芽處理。每隔 8 h均勻噴淋蒸餾水一次；收芽：催芽48 h后收芽記為發芽0 d，于發芽后每2 d（2、4、6 d）收芽一次。將鮮樣存放于－80 ℃冰箱，部分稱質量備用，其余經凍干機凍干，進一步研磨過篩（80 目），得到的蕎麥芽粉存放于－20 ℃冰箱待用。

1.3.2 蕎麥芽發芽率及形態學指標的測定

蕎麥百粒質量的測定：每個品種隨機取100 粒測定其質量，取3 次平均值；對100 粒種子進行發芽率測定：取催芽48 h后的蕎麥芽，當種子出現肉眼可見的胚根萌芽，且無霉變等其他不良情況時，即認定蕎麥種子已經發芽。蕎麥發芽6 d時，隨機取60 根測量其可食部位芽長并求其平均數即為芽長；測定60 根（3 組平行，每組20 根）蕎麥芽鮮質量，并求平均數即為蕎麥芽鮮質量，拍照記錄不同光照下發芽6 d蕎麥芽的形態。

1.3.3 蕎麥芽總酚含量的測定

樣品的提取：稱取0.025 g不同發芽時間蕎麥凍干粉，分別加入5 mL體積分數80%甲醇溶液，混勻后56 ℃超聲40 min，然后8 000 r/min離心5 min，取上清液，重復上述操作一次，將兩次上清液混勻存于冰箱備用。

根據Folin-Ciocalteau法[7]測定總酚含量。總酚含量以每克干質量樣品中所含沒食子酸質量表示，單位為mg/g。

1.3.4 蕎麥芽總黃酮含量的測定

樣品的提取同1.3.3節。總黃酮含量測定參照文獻[14]的方法進行，總黃酮含量以每克干質量樣品中所含兒茶素質量表示，單位為mg/g。

1.3.5 蕎麥芽蘆丁及其他黃酮類化合物含量的測定

樣品的提取同1.3.3節。取提取液1 mL經0.45 μm有機濾膜過濾至1.5 mL的棕色進樣小瓶中，待用。

高效液相色譜條件：色譜柱：inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1 mL/min；流動相A：體積分數36%乙酸溶液-水（2∶98，V/V）；流動相B：水-體積分數36%乙酸-甲醇-四氫呋喃（80∶20∶900∶5，V/V）；進樣量：10 μL；檢測器：0～33 min波長280 nm，33～64 min波長360 nm，高效液相色譜運行條件：0～25 min，25% B相；25～35 min，25%～55% B相；35～45 min，55%～65% B相；45～50 min，65%～70% B相；50.00～50.01 min，70%～75% B相；50.01～57.00 min，75.0%～78.5% B相；57.00～57.01 min，78.5%～25.0% B相；57.01～64.00 min，25% B相。

1.3.6 基因表達的測定

1.3.6.1 苦蕎芽中總RNA的提取

參考總RNA提取試劑盒說明書提取苦蕎芽總RNA，整個操作需要在超凈臺進行。

1.3.6.2 第一鏈cDNA的合成

以1.3.6.1節提取的總RNA為模板，利用cDNA反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA，將合成的第一鏈cDNA保存于－20 ℃冰箱備用。

1.3.6.3 引物的設計和合成

參考文獻[15-17]設計引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

1.3.6.4 熒光定量PCR分析

反應體系及反應儀器參數參考試劑盒說明書。基因相對表達量的計算應用2－ΔΔCt方法[18]。

1.4 數據統計與分析

除芽長測定外所有實驗均進行3 次重復，采用Excel軟件進行數據處理，結果以平均值±標準差表示，采用SPSS軟件中單因素方差分析法分析數據差異顯著性，以P＜0.05表示差異顯著，采用Origin和Excel軟件作圖。

深圳地鐵6號線民樂停車場出入線總長約2.6公里，隧道穿越強、中、微風化花崗巖，采用TBM+局部礦山及明挖法施工。其中明挖段長71m，隧道上方為南坪快速牛咀大橋，共7根橋墩侵入隧道洞身，為不中斷南坪快速交通，隧道穿越橋梁基礎采用樁基托換。

2 結果與分析

2.1 蕎麥品種篩選

2.1.1 不同品種蕎麥的百粒質量、蕎麥芽發芽率、鮮質量、芽長

不同品種蕎麥的百粒質量如表2所示。10個品種蕎麥的百粒質量在1.52～3.94 g之間，甜蕎品種高于苦蕎，其中‘西農9976’百粒質量最大，為（3.94±0.04）g。

表2 不同品種蕎麥的百粒質量Table 2 100-Grain masses of different buckwheat varieties

發芽率可反映種子的活性，且能評估其是否適合加工為芽菜。由圖1A可知，在苦蕎品種中，‘蒙古2號’發芽率高達94%以上，是本實驗中發芽率最高的品種；在甜蕎品種中，‘西農9976’發芽率最高，達80%，遠高于另外兩種甜蕎。

圖1 不同品種蕎麥芽的發芽率、鮮質量和芽長Fig. 1 Germination rates, fresh masses and sprout lengths of different varieties of buckwheat sprouts

蕎麥芽的鮮質量和芽長能夠反映蕎麥芽的長勢及其感官品質。由圖1B可知，甜蕎的鮮質量普遍高于苦蕎，這與蕎麥種子的百粒質量趨勢一致；在苦蕎品種中，‘黔苦3號’和‘蒙古2號’的鮮質量高于其他苦蕎，分別達到1.59 g/20 根和1.53 g/20 根，且‘蒙古2號’的百粒質量最小，說明其產量大；不同甜蕎種子的百粒質量及其芽的鮮質量差別不明顯，在3～4 g及1.80～1.98 g/20 根之間，其中‘西農9976’的鮮質量與百粒質量的比值偏小。由圖1C可知，不同品種的蕎麥芽可食部位芽長存在較大差異；在苦蕎芽中，‘蒙古2號’可食部位芽長最長，達到70 mm；在甜蕎芽中，‘西農9976’的可食部位芽長最短，為45 mm。

2.1.2 不同品種蕎麥發芽過程中的總酚、總黃酮含量

酚類和黃酮類化合物是植物中普遍存在的具有活性的次級代謝產物[19]，研究發現蕎麥中總酚和總黃酮含量隨發芽時間的延長而增加[20]，且苦蕎芽總酚含量明顯高于甜蕎芽[21]。由圖2A可知，在苦蕎芽中，發芽2、4、6 d，‘蒙古2號’總酚含量均最高，分別為38.8、48.9 mg/g和51.3 mg/g。在甜蕎芽中，發芽0、2、4 d，均是‘西農9976’總酚含量最高，分別達到5.7、14.3、29.7 mg/g。由圖2B可知，在苦蕎品種中，發芽2、6 d，‘蒙古2號’總黃酮含量都最高，分別為42.2 mg/g和50.2 mg/g，發芽0、4 d，‘蒙古2號’總黃酮含量均較高；甜蕎品種中，發芽2、4 d，‘西農9976’總黃酮含量最高，分別達10.1 mg/g和21.7 mg/g，發芽0、6 d，‘西農9976’的總黃酮含量僅低于‘貴紅花’。

圖2 不同品種的蕎麥芽隨發芽時間延長總酚及總黃酮含量的變化Fig. 2 Changes in contents of total phenols and total flavonoids in different varieties of buckwheat sprouts with germination time

‘西農9976’鮮質量較低且可食部位芽長較短，但其發芽率明顯高于‘貴紅花’和‘溫莎甜蕎’，且總酚和總黃酮含量也較高，綜合考量，‘西農9976’為本實驗選出的較優甜蕎品種；‘蒙古2號’的發芽率最高，可食部位芽長最長，鮮質量與百粒質量的比值最大，總酚和總黃酮含量高，故‘蒙古2號’為本實驗選出的較優苦蕎品種。

2.2 光照對蕎麥芽的影響

2.2.1 不同光照處理發芽6 d蕎麥芽的形態

由圖3可知，光照處理后的蕎麥芽顏色發生了明顯的變化，由“黃+白”轉變為“綠+紅”，其中藍光光照處理的蕎麥芽顏色最深，其次依次是紅光、白光；經光照處理后芽長總體向短粗型轉變，子葉展開。有研究表明，光照能夠抑制芽的生長，其中藍光抑制作用最為明顯[22]，這與本實驗的結果相吻合。

圖3 不同光照處理蕎麥芽的形態對比Fig. 3 Morphological comparison of buckwheat sprouts under different illumination treatments

2.2.2 不同光照對蕎麥芽總酚和總黃酮含量的影響

由圖4A1、A2可知，在發芽4、6 d時，3 種光照處理均提高了‘西農9976’的總酚和總黃酮含量，而在發芽2 d時，僅紅光和藍光能夠提升總酚和總黃酮含量；其中紅光光照的提升作用最強，與黑暗處理相比，發芽2、4、6 d總酚含量分別提高了83%、13%、13%，總黃酮含量分別提高了111%、46%、29%。由圖4B1、B2可知，在發芽2、4、6 d時3 種光照處理均提高了‘蒙古2號’的總酚和總黃酮含量，其中紅光提高總酚含量的作用最強，分別提高了32%、18%和33%；白光提高總黃酮含量的作用最強，分別提高了45%、40%、53%。有學者研究了光源對蕎麥芽黃酮類化合物含量的影響，結果發現LED紅光較熒光和LED藍光提升作用更強[22]；也有研究發現LED藍光較熒光和紅光能夠顯著提高甜蕎芽總酚和總黃酮及單體黃酮含量[23]。這可能是不同研究中所用的光照強度和時長不同所致。

圖4 不同光照處理的蕎麥芽隨發芽時間延長總酚含量變化Fig. 4 Changes in total phenol content in buckwheat sprouts under different illumination conditions with germination time

2.2.3 不同光照處理蕎麥芽黃酮類化合物分析結果

大量研究表明，蕎麥芽中除富含蘆丁，也含有一定量的葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素、槲皮素等其他黃酮類化合物[19,24]，但這些黃酮類化合物在不同光照下含量的變化鮮有研究。本實驗通過高效液相色譜對不同品種蕎麥黃酮類化合物進行定量分析，結果如表3所示，槲皮苷、木犀草素和槲皮素主要存在于苦蕎‘蒙古2號’中，在甜蕎‘西農9976’中幾乎未檢出；‘蒙古2號’中蘆丁含量遠高于‘西農9976’；發芽6 d后，‘蒙古2號’的牡荊素、葒草苷、異葒草苷、蘆丁、槲皮苷含量在白光光照下達到最高，分別較對照組提高14%、63%、69%、17%、33%；發芽6 d甜蕎‘西農9976’中牡荊素、葒草苷和異葒草苷含量明顯高于苦蕎‘蒙古2號’，且在白光和紅光光照下達到最高。研究表明不同的光照可以提高蕎麥芽中葒草苷、異葒草苷、牡荊素、異牡荊素和蘆丁的含量[22]，這與本實驗結果一致；但槲皮素含量的變化與文獻[11]結果不同，原因可能是本實驗通過LED不同光間的復合，與文獻[11]中UV光和LED光的復合不同。

表3 不同光照處理的蕎麥芽發芽6 d后黃酮類化合物含量的變化Table 3 Changes in flavonoid contents of buckwheat sprouts treated with different lights after germination for 6 days

2.2.4 不同光處理苦蕎芽中PAL、FLS、CHS、CHI的表達及與其黃酮類化合物含量相關性分析結果

由圖5可知，光照可以顯著上調苦蕎芽中CHI、CHS、FLS和PAL的相對表達量。在整個發芽過程中，苦蕎芽CHI和CHS的表達水平總體趨勢較為相近，均是隨發芽時間延長呈下降趨勢，在發芽第2天相對表達量最高；苦蕎芽FLS和PAL的表達水平總體趨勢較為相近，均是先升高后降低，在發芽第4天相對表達量最高，這與前人研究結果[25]一致；CHS、CHI和PAL在紅光光照下相對表達量達到最高，明顯高于藍光和白光處理，其中CHS相對表達量最高約達到對照組的30 倍，CHI相對表達量最高約達到對照組的25 倍，PAL相對表達量最高約達到對照組的10 倍；而FLS在紅光和白光兩種光照下相對表達量均較高，最高分別是對照組的50 倍和42 倍。

圖5 不同光照處理的苦蕎芽中CHI、CHS、FLS和PAL的表達Fig. 5 Expression levels of CHI, CHS, FLS and PAL in tartary buckwheat sprouts under different light illumination treatments

由表4可知，苦蕎芽中總酚、總黃酮、葒草苷、異葒草苷及槲皮苷含量與CHI、CHS、PAL和FLS的表達水平呈極顯著正相關（P＜0.01）；兒茶素和槲皮素含量與CHI、CHS、PAL和FLS的表達水平呈顯著負相關（P＜0.05，P＜0.01），木犀草素含量與基因CHI、CHS和PAL的表達水平呈顯著負相關（P＜0.05，P＜0.01）；而牡荊素含量只與FLS的表達水平呈顯著正相關（P＜0.05）；蘆丁含量與基因CHI和FLS的表達水平呈顯著正相關（P＜0.05，P＜0.01）。與黑暗處理相比，光照處理明顯上調了4 種基因的表達水平，也提高了酚類黃酮類物質的含量，說明CHI、CHS、PAL和FLS的表達與黃酮類化合物及酚類物質的合成存在一定的潛在關系。

表4 總酚和總黃酮含量、單一黃酮類化合物與抗氧化活性及CHI、CHS、PAL和FLS相對表達量的相關系數Table 4 Correlation coefficients between contents of total phenols,total flavonoids and individual flavonoids and relative expression levels of CHI, CHS, PAL and FLS

研究表明黃酮類化合物主要存在于子葉和莖[22,26]，但相關代謝酶基因的表達主要在根部和莖部[15,25]，黃酮類化合物可以從植物的合成位點向根尖、中根或子葉進行長距離運輸[27-28]，但基因表達的部位是確定的（圖6）。考慮到蕎麥芽根部黃酮類化合物含量低且口感差，本實驗僅針對可食部位進行研究，這可能是造成不同實驗組之間的基因表達水平與其總酚和總黃酮等含量相關性不顯著的原因。

圖6 植物中黃酮類化合物分布及傳輸Fig. 6 Distribution and transmission of flavonoids in plants

3 討 論

本實驗所選7個苦蕎品種中，‘蒙古2號’發芽率最高、產量最大，外觀長勢好，活性物質含量較高，為最優苦蕎品種；本實驗所選3個甜蕎品種中，‘西農9976’發芽率遠高于‘貴紅花’和‘溫莎甜蕎’，且其形態粗壯、長勢良好，整體活性物質含量與其他兩個品種差異較小，為最優甜蕎品種。LED白光、紅光和藍光光照處理均提高了蕎麥芽中總酚、總黃酮、蘆丁、牡荊素、葒草苷、異葒草苷及槲皮苷含量，該結果與Zhang Xiaoyan等[29]研究中LED光照提高蕎麥芽等芽菜活性成分的結論基本一致。其中，對于甜蕎芽‘西農9976’，紅光光照是最佳處理方式，這與文獻[23]中甜蕎芽在LED藍光光照下活性成分含量最高有一定出入，可能是所用蕎麥品種及光照強度存在差異所致，但也有研究表明甜蕎芽的蘆丁、槲皮素等活性成分含量在LED紅光光照下更高[22]；對于苦蕎芽‘蒙古2號’，提升總黃酮、蘆丁、牡荊素、葒草苷、異葒草苷、槲皮苷含量的最佳處理方法是白光光照，發芽6 d時，其中葒草苷、異葒草苷含量分別提高了63%、69%，而提升總酚含量的最佳處理方式是紅光光照，這與文獻[30]中紅藍光復合處理為最佳處理方式不完全吻合，這同樣可能是所用蕎麥及光源具體參數不同所致。不同光照均可以顯著上調苦蕎芽中CHI、CHS、FLS和PAL表達水平，這與光照提高苦蕎芽總酚和總黃酮類化合物含量的結果相印證，相關性分析結果明確了PAL、FLS、CHS和CHI對蕎麥芽中總酚和總黃酮類化合物合成的調控作用。不同實驗組之間的基因表達水平與其總酚和總黃酮等含量部分相關性不顯著可能緣于植物中次級代謝產物合成過程的復雜性，還需要進一步的研究來揭示其潛在機制。