超聲處理對類PSE雞肉分離蛋白結構和乳化特性的影響

李 可，李三影，杜曼婷，王艷秋，張俊霞，白艷紅

（鄭州輕工業大學食品與生物工程學院，河南省冷鏈食品質量安全控制重點實驗室，食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 鄭州 450001）

在過去的幾十年，全球禽肉的生產和消費迅速增長[1]。值得注意的是，消費者的消費習慣已經發生了變化，對原料肉的品質與加工特性的要求越來越高。然而，類蒼白松軟滲水（pale, soft and exudative，PSE）雞肉是一類顏色蒼白、質地柔軟、汁液滲出的劣質肉，其發生率較高，具有較低的pH值，加工過程中鹽溶性蛋白難以提取[2]，導致產品的出品率降低和質構劣變，給禽肉深加工業造成巨大經濟損失。雞肉中含20%～23%的蛋白質，從雞胸肉中提取的肌肉蛋白是營養最豐富的蛋白種類之一。肌肉蛋白具有高消化性和低過敏性，富含人體所需的所有必需和非必需氨基酸，其功能特性對于肉制品的品質至關重要[3]。近幾年國內外學者關注不同加工方式改善類PSE雞肉蛋白質功能特性，包括打漿[4]、脈沖電場[5]、糖基化[6]、酸堿處理[7]等。與其他加工處理不同，酸堿處理原理是將畜禽/水產品肌肉蛋白溶于極性酸堿環境中，調節pH值至等電點以沉淀蛋白，從而獲得分離蛋白，其中通過優化酸堿溶解與等電點沉淀時pH值提高蛋白回收率。Zhao Xue等[7-8]發現利用堿溶酸沉法回收在pH 5.5時得到的類PSE雞肉分離蛋白（以下簡稱類PSE分離蛋白）回收率較高，然而其凝膠乳化功能特性卻弱于其他回收pH組。因此，有必要進一步改善回收pH 5.5時類PSE分離蛋白功能特性。

超聲處理是一種綠色的食品物理加工技術。高強度超聲波（16～100 kHz、10～1 000 W/cm2）通過物理效應、機械效應、熱效應等產生的物理和化學作用，改變食品組分的結構與功能性質[9]。最近有研究證明，超聲波技術有潛力改性各種酸堿分離蛋白并改善其功能特性，如鱈魚分離蛋白[10]、紫貽貝分離蛋白[11]、豌豆分離蛋白[12]等。在肉品加工中，超聲處理主要應用于原料肉的速凍解凍、嫩化、腌制滾揉、畜禽副產物分離提取等[13-14]，有效改善了肉品組分功能性質和品質，提高加工效率[15]。目前，超聲處理應用于輔助提取畜禽副產物蛋白，提高了回收率，而關于超聲處理對類PSE分離蛋白功能特性及其結構變化的影響研究鮮見報道。因此，本實驗以類PSE分離蛋白為研究對象，采用超聲對類PSE分離蛋白進行改性，探討不同超聲功率對類PSE分離蛋白結構和功能特性的影響，并進一步分析超聲處理后類PSE分離蛋白結構與功能的相互聯系，以期為類PSE分離蛋白的加工應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

去骨的雞胸肉采集于鄭州某加工廠去骨線。

金龍魚大豆油 益海嘉里金龍魚糧油食品有限公司；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB） 北京華邁科生物技術有限責任公司；二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）上海源葉生物有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS） 美國Sigma公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PH-STAR CPU胴體肌肉pH值測定儀 北京布拉德科技發展有限公司；CiX62便攜式色度儀 美國愛色麗公司；SZ-22A絞肉機 廣州旭眾食品機械有限公司；T25高速均漿機 德國IKA公司；VC750超聲波破碎儀 美國Sonic公司；PHS-3C pH計 上海雷磁儀器廠；AvantiJ-26S XPI 大容量高速冷凍離心機美國Beckman Coulter公司；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京通用儀器有限公司；Nano-ZS90納米激光粒度儀 英國馬爾文儀器公司；凝膠成像儀 美國伯樂公司；圓二色譜儀 英國應用光學物理公司；F-7000熒光分光光度計、Regulus 8100冷場發射掃描電子顯微鏡日本日立有限公司。

1.3 方法

1.3.1 類PSE分離蛋白的提取和分離蛋白溶液質量濃度的測定

樣品的選取參考Li Ke等[16]的方法。宰后24 h，測定所有樣品的L*值和pH值（pH24h），選取類PSE雞胸肉（L*＞53，pH24h＜5.7）。選取后，將所有肉眼可見的結締組織，脂肪去除。然后將肉切成約1 cm3正方體小塊，用真空包裝袋包裝，每袋約100 g，冷凍（－20 ℃），并在2 周內使用。

參考Zhao Xue等[17]的方法，取100 g樣品于4 ℃下解凍12 h，肉塊在預冷的絞肉機中以4 000 r/min 絞碎20 s（2 次）。然后將糊狀物與預冷的去離子水以1∶6（m/V）混合，10 000 r/min均質1 min。使用2 mol/L NaOH溶液調節肉漿至pH 11，將漿液均質后在4 ℃下冷卻10 min，以穩定系統。然后，肉漿在4 ℃下10 000×g離心15 min，漿狀上清液使用2 mol/L HCl溶液將pH值調節至5.5（等電點附近），在4 ℃下放置10 min待蛋白質完全沉淀后將混合物10 000×g離心15 min，收集沉淀物，即為類PSE分離蛋白。將沉淀溶于去離子水中，用1 mol/L NaOH溶液調整溶液至中性得到類PSE分離蛋白溶液。參考文獻[8]，采用雙縮脲法測定分離蛋白溶液的質量濃度，所有過程保持在4 ℃。

1.3.2 類PSE分離蛋白的超聲處理

將1.3.1節得到的分離蛋白溶液稀釋至20 mg/mL（用去離子水稀釋，后同），取50 mL于100 mL的小燒杯中進行超聲處理。13 mm的超聲波探頭放入液面下15 mm處，超聲頻率：20 kHz；超聲功率：150、300、450 W；超聲模式：超聲2 s，停止4 s；此條件下處理5 min。整個樣品處理過程中溫度低于12 ℃，得到的對照組（未進行超聲處理）、150 W組、300 W組、450 W組分離蛋白溶液在4 ℃下保存，48 h內進行后續分析。

1.3.3 類PSE分離蛋白溶液粒徑和電位的測定

將1.3.2節得到的4 組分離蛋白溶液稀釋至1 mg/mL。使用納米激光粒度儀測定分離蛋白溶液的粒徑和電位。

1.3.4 類PSE分離蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

根據Laemmli等[18]的方法進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分析。將1.3.2節得到的分離蛋白溶液稀釋至5 mg/mL，分別與等體積的還原緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl、20%（質量分數，后同）Gly、10% SDS、3.33% DTT和2%溴酚藍）、非還原緩沖液（0.5 mol/L Tris-HCl、20% Gly、10% SDS、2%溴酚藍）混合，然后在100 ℃的沸水中加熱5 min。電泳凝膠由5%濃縮凝膠和10%分離凝膠組成，加樣量為10 μL。在垂直電泳儀中以60 V電泳20 min，然后以110 V電泳約1.2 h。用考馬斯亮藍R-250染色30 min。然后，將其脫色直到背景清晰為止。使用凝膠成像儀成像，通過Quantity One軟件對還原條件下肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶定量分析。

1.3.5 類PSE分離蛋白二級結構的測定

將1.3.2節得到的4 組分離蛋白溶液稀釋至0.1 mg/mL。根據Dong Ming等[5]的方法，使用圓二色譜儀分析類PSE分離蛋白的二級結構。帶寬設定為1 nm，在190～260 nm的波長范圍內記錄樣品的平均殘留橢圓度。去離子水作為空白組，每個樣品重復3 次測定。然后用CDNN Pro軟件計算α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲的相對含量。

1.3.6 類PSE分離蛋白三級結構的測定

1.3.6.1 自由巰基含量的測定

參考Zhang Ziye等[19]的方法并稍作修改。將1.3.2節得到的4 組分離蛋白溶液稀釋至5.0 mg/mL。然后，將1 mL蛋白溶液與4 mL含5 mmol/L EDTA的磷酸鹽緩沖液（20 mmol/L Na2HPO4/NaH2PO4、pH 8.0）和100 μL 10 mmol/L DTNB溶液混合。將混合物在黑暗中保持30 min，用紫外-可見分光光度計測定412 nm波長處的吸光度，通過13 600 L/（mol·cm）的摩爾消光系數計算自由巰基含量，單位為μmol/g。

1.3.6.2 表面疏水性的測定

參考Ma Wuchao等[10]方法，使用ANS法測定類PSE分離蛋白的表面疏水性。用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）將1.3.2節得到的4 組分離蛋白溶液分別稀釋至0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL。將50 μL 8 mmol/L ANS溶液（溶劑為pH 7.0、10 mmol/L磷酸鹽緩沖液）與4 mL蛋白稀釋樣品混合，室溫避光反應20 min。熒光強度（FI）通過熒光分光光度計在340 nm（激發）和470 nm（發射）的波長下測定。FI對蛋白質量濃度的初始斜率作為表面疏水性（H0）。

1.3.6.3 熒光強度的測定

參考Zhao Xue等[20]方法，測定類PSE分離蛋白的內源性熒光光譜，稍作修改。用去離子水將1.3.2節得到的4 組分離蛋白溶液稀釋至0.1 mg/mL，在25 ℃下使用熒光分光光度計對溶液進行分析。使用光程為1 cm的石英比色皿，激發波長為280 nm，發射光譜范圍為290～460 nm。激發和發射狹縫寬度為2.5 nm，掃描速率為12 000 nm/min。

1.3.7 類PSE分離蛋白微觀結構觀察

將1.3.2節得到的4 組分離蛋白溶液進行真空冷凍干燥，獲得冷凍干燥后的蛋白樣品。掃描電子顯微鏡加速電壓為1.0 kV，在500 倍的放大倍數下觀察噴金處理后不同樣品的微觀結構。

1.3.8 類PSE分離蛋白溶解度的測定

樣品溶解度的測定參考Zou Ye等[21]方法，稍加修改。將1.3.2節得到的分離蛋白溶液稀釋至10 mg/mL，取5 mL分離蛋白溶液于10 mL離心管中，在4 ℃、10 000×g下離心30 min，根據雙縮脲法[8]測量上清液中的蛋白質量濃度（即去離子水中的溶解度）；相似地，將1.3.2節得到的分離蛋白溶液稀釋至10 mg/mL，然后按照2%的添加量加入NaCl，充分混合后取5 mL混合溶液于10 mL離心管進行上述離心操作，取上清液測定蛋白質量濃度（即2% NaCl中的溶解度）。蛋白溶解度按公式（1）計算。

1.3.9 類PSE分離蛋白乳化特性的測定

乳液制備參考Zhao Xue等[8]的方法。向1.3.2節得到的20 mL 20 mg/mL分離蛋白溶液中添加大豆油（200 g/L）和NaCl（2 g/100 g），為確保乳液體系完全混合，使用均質機以10 000 r/min 均質1 min后間歇1 min，再次均質1 min，保持溫度低于10 ℃。在均質過程中，將乳液保存在冰中以防止熱變性。均質后，立即在0、10 min吸取50 μL乳液，然后加入5 mL 1 mg/mL的SDS溶液充分混合。以SDS溶液為空白，測定500 nm波長處吸光度。乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）按公式（2）、（3）計算。

式中：A0和A10分別表示0 min和10 min時500 nm波長處的吸光度；D是稀釋倍數100；φ是油相體積分數（20%）；ρ是蛋白質量濃度/（g/mL）。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 21.0軟件進行數據處理，實驗結果均以平均值±標準差表示。采用SPSS 21.0統計軟件進行單因素方差分析，通過Duncan多重比較進行顯著性分析，P＜0.05時表示不同處理組間存在顯著差異；采用SPSS 21.0軟件對各指標進行Pearson’s相關性分析。使用Origin 2018軟件進行主成分分析、繪圖。

2 結果與分析

2.1 超聲對類PSE分離蛋白粒徑和電位的影響

粒徑通常用來評估蛋白聚集體的大小，在蛋白質的功能特性中起著重要作用[22]。圖1顯示不同超聲處理后類PSE分離蛋白的粒徑分布。隨著超聲功率的增加，蛋白粒徑分布逐漸向左移動，并逐漸從雙峰分布轉變為單峰分布，表明蛋白質在水溶液中均勻分布。如表1所示，對照組（未經超聲處理）平均粒徑為（3 828.33±22.68）nm。超聲功率為150、300、450 W時，蛋白平均粒徑分別為（994.20±17.80）、（713.80±28.52）、（586.13±16.42）nm，表明超聲處理可以顯著減小類PSE分離蛋白的粒徑（P＜0.05），這與粒徑分布是一致的。Yu Cuiping[11]、Zhang Ziye[19]、Malik[23]等也報道不同功率和時間超聲處理后，雞肌原纖維蛋白、貽貝分離蛋白和向日葵分離蛋白的粒徑也顯著降低。粒徑降低的原因可能是超聲空化作用產生的剪切力和湍流，經超聲處理后，蛋白質聚集體中的非共價鍵被破壞，導致顆粒變小[24]。

由表1可知，蛋白質樣品的ζ電位值都是負的，這表明蛋白表面帶負電的基團多于帶正電的基團。超聲處理后蛋白質的表面凈電荷是降低的，表明蛋白表面基團的電離度減弱[25]。與對照組相比，超聲處理后樣品的電位絕對值顯著下降（P＜0.05），這可能是由于超聲處理使蛋白質結構展開，暴露出更多的帶正電荷的基團，導致蛋白質表面的負電荷被中和[26]。ζ電位的變化與Wang Yuntao等[27]的研究結果一致。

表1 不同超聲功率處理對類PSE雞肉分離蛋白粒徑和ζ電位的影響Table 1 Effects of different ultrasonic power levels on the particle size and ζ-potential of PSE-like chicken protein isolate

2.2 超聲后類PSE分離蛋白的SDS-PAGE結果

圖2A顯示在還原和非還原條件下對照組和超聲處理組類PSE分離蛋白樣品的SDS-PAGE圖譜。與對照組相比，各超聲處理組蛋白組成成分沒有發生明顯變化，同時可以觀察到3個主要的條帶，分子質量分別約為205、45 kDa和35 kDa，對應的蛋白依次是肌球蛋白重鏈、肌動蛋白和原肌球蛋白。在還原條件下，與對照組相比（泳道1），超聲處理的蛋白質樣品的主要條帶組成沒有發生明顯變化，這表明超聲處理組未發生肽鍵斷裂。由圖2B可知，300、450 W超聲處理組樣品的肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶強度高于對照組，這可能是由于一定功率的超聲處理可以增加類PSE分離蛋白的水溶性。Zhu Zhenbo等[28]研究超聲處理核桃分離蛋白，結果表明不同超聲功率和時間處理后蛋白質樣品的主要條帶并沒有發生明顯改變，而出現主要條帶強度增強的原因是超聲處理增加核桃蛋白的水溶性，這與本研究結果相似。在非還原條件下，對照組和超聲處理的類PSE分離蛋白樣品的電泳圖譜也沒有顯著差異，表明超聲處理沒有破壞任何二硫鍵，進一步證實了超聲處理沒有導致任何蛋白質分子的斷裂[28]。

圖2 類PSE雞肉分離蛋白的SDS-PAGE圖譜（A）和還原條件下肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶的平均光密度值（B）Fig. 2 SDS-PAGE profiles (A) and average optical density of myosin heavy chain and actin bands from PSE-like chicken protein isolate under reducing conditions (B)

2.3 超聲對類PSE分離蛋白二級結構的影響

圓二色譜能夠反映蛋白質主鏈肽鍵的構象，是反映蛋白質結構是否發生變化的重要指標[29]。如圖3所示，類PSE分離蛋白在208、222 nm處出現的兩個負吸收峰，是α-螺旋的吸收峰，且α-螺旋含量與峰的強度成正比[30]。隨著超聲功率的增加，峰的強度逐漸增大，說明α-螺旋含量增加，其含量的增加表明超聲會引起類PSE分離蛋白構象部分恢復，從而使蛋白質的功能穩定性增加[31]。

圖3 不同超聲功率處理對類PSE雞肉分離蛋白二級結構的影響Fig. 3 Effects of different ultrasonic power levels on the secondary structure of PSE-like chicken protein isolate

如表2所示，隨超聲功率的增加，α-螺旋和無規卷曲相對含量增加，β-折疊、β-轉角相對含量大體呈下降趨勢；此外，與對照組相比，150、300 W超聲處理時，β-轉角和無規卷曲的相對含量沒有顯著變化（P＞0.05），超聲處理功率為450 W時，α-螺旋的相對含量顯著增加（P＜0.05），由15.25%增加到40.91%，而β-折疊的相對含量顯著下降（P＜0.05），可能是超聲處理使兩者之間發生了結構轉化，β-折疊相對含量還與蛋白質疏水性有關，其相對含量降低表明分子內部的疏水性位點暴露，疏水性增強[32]。Hu Hao等[33]也發現超聲處理增加大豆分離蛋白的α-螺旋和無規卷曲含量，減少β-折疊含量。但是，與本課題組之前研究超聲處理類PSE雞肉糜的結果[16]相反，這可能是由于類PSE雞肉經過酸堿處理和超聲處理溫度不同等所致。以上結果表明，超聲處理改變了類PSE分離蛋白的二級結構，促進類PSE分離蛋白構象部分恢復。

表2 超聲處理類PSE雞肉分離蛋白的二級結構相對含量變化Table 2 Changes in relative contents of secondary structures of PSE-like chicken protein isolate under ultrasonic treatments

2.4 超聲對類PSE分離蛋白三級結構的影響

2.4.1 超聲對類PSE分離蛋白自由巰基含量的影響

自由巰基是蛋白質中重要的功能成分之一。因此，其含量的變化可以反映蛋白質的變性程度，并對蛋白質的功能特性（例如溶解性、乳化能力和起泡能力）起著重要作用[34]。如圖4所示，超聲處理后自由巰基含量顯著增加（P＜0.05）。與對照組相比，當超聲功率增加到450 W，自由巰基含量增加了約2 倍。自由巰基含量的增加可能是由于超聲空化效應促進蛋白分子結構的展開，減小了蛋白粒徑（圖1），并使埋藏在分子內的巰基基團暴露出來[35]，從而使自由巰基含量增加。Hu Hao等[33]同樣研究發現，大豆分離蛋白的自由巰基含量隨超聲功率（200～600 W）的增加和超聲時間（15～30 min）的延長而增加。然而Liu Ru等[36]報道，超聲處理的肌球蛋白的自由巰基含量隨超聲功率（100～250 W）的增加和超聲時間（3～12 min）的延長而降低，這可能是由于敏感的自由巰基基團被超聲產生的過氧化氫（由超聲空化作用產生的一些瞬態自由基形成）所氧化。Chandrapala等[37]表明超聲處理后乳清濃縮蛋白的自由巰基含量沒有變化。以上實驗中超聲處理后自由巰基含量的差異可能是由于蛋白質變性程度、本身特性和超聲條件等不同。

圖4 不同超聲功率處理對類PSE雞肉分離蛋白自由巰基含量的影響Fig. 4 Effects of different ultrasonic power levels on the content of free sulfhydryl groups in PSE-like chicken protein isolate

2.4.2 超聲對類PSE分離蛋白表面疏水性的影響

H0代表蛋白質表面疏水基團的數量，通常用來反映蛋白質構象的改變，也與蛋白質功能密切相關[37]。如圖5所示，與對照組（517）相比，隨著超聲功率的增加，類PSE分離蛋白的H0顯著增加（P＜0.05）。同樣，有研究表明鱈魚分離蛋白、鰱魚肌球蛋白、雞肉肌原纖維蛋白等[10,36,38]的H0也隨著超聲強度增加或超聲時間延長而增加。H0的增加可能是因為超聲空化和物理剪切破壞蛋白質分子的部分疏水相互作用使蛋白質分子結構展開，暴露出分子內部的疏水基團[37]，從而增加與ANS探針的結合位點。H0的變化趨勢與自由巰基含量的變化趨勢一致。

圖5 不同超聲功率處理對類PSE雞肉分離蛋白表面疏水性的影響Fig. 5 Effects of different ultrasonic power levels on the surface hydrophobicity of PSE-like chicken protein isolate

2.4.3 超聲對類PSE分離蛋白熒光強度的影響

熒光光譜法廣泛用于評估蛋白質的三級結構變化，因為色氨酸/酪氨酸（Trp/Tyr）殘基的內在熒光對微環境的極性極為敏感[39]。如圖6所示，隨著超聲功率的增加，熒光強度明顯增加，與對照組相比，450 W組類PSE分離蛋白的最大發射波長紅移約3 nm。與對照組相比，超聲處理后紅移和熒光強度增加可能是由于蛋白質的解折疊，暴露出更多的Trp/Tyr殘基和疏水基團，從而增加微環境中的非極性[21]，這與H0的結果一致（圖5）。這些結果表明超聲處理后類PSE分離蛋白的構象被改變。Zou Ye等[29]也報道超聲處理可以增強雞肝中水溶性蛋白的熒光強度。

圖6 不同超聲功率處理對類PSE雞肉分離蛋白熒光強度的影響Fig. 6 Effects of different ultrasonic power levels on the fluorescence intensity of PSE-like chicken protein isolate

2.5 超聲對類PSE分離蛋白微觀結構的影響

從圖7A可以看出，對照組類PSE分離蛋白呈現大而不規則的形狀。與對照組相比，超聲處理后類PSE分離蛋白（圖7B～D）呈現出更小和更松散的片狀結構，這可能是由于超聲空化作用使蛋白質結構展開。有研究指出，超聲處理可以減小蛋白質的粒徑并提高溶解度[33]。本研究中掃描電子顯微鏡觀察結果與超聲處理類PSE分離蛋白粒徑（圖1）和結構（圖4～6）的變化一致。Jiang Lianzhou等[40]的研究也表明，超聲處理的黑豆分離蛋白顯示出更多的無序結構和不規則碎片。

圖7 不同超聲功率處理的類PSE雞肉分離蛋白的掃描電子顯微鏡圖Fig. 7 SEM of PSE-like chicken protein isolate under ultrasonic treatments at different powers

2.6 超聲對類PSE分離蛋白溶解度的影響

在食品體系中，溶解度不僅是評價蛋白質物理化學性質的最佳指標，也是確定某些功能性質的基礎，如凝膠和乳化能力。如圖8所示，隨著超聲功率的增加，類PSE分離蛋白在去離子水中以及2%的鹽（NaCl）溶液中的溶解度都顯著增大（P＜0.05）。與對照組相比，隨著超聲功率增加到450 W，去離子水和2%的鹽溶液中蛋白的溶解度分別提高了1.17 倍和6.46 倍。去離子水中超聲處理功率為450 W時蛋白的溶解度高于2%的鹽溶液中對照組蛋白溶解度，表明一定功率的超聲處理可以提高在降鹽水平下類PSE分離蛋白的溶解度。蛋白質溶解度的升高可能是因為超聲波的機械力破壞了蛋白質天然聚集形式的相互作用，促進可溶性蛋白質的形成[19]。此外，蛋白顆粒平均粒徑降低（表1），表面積增加，會促進蛋白質與水之間的相互作用，從而導致類PSE分離蛋白溶解度的增加[38]。蛋白質溶解性的改善將有利于蛋白質乳化性能的提高。

圖8 不同超聲功率處理對類PSE雞肉分離蛋白溶解度的影響Fig. 8 Effects of different ultrasonic power levels on the solubility of PSE-like chicken protein isolate

2.7 超聲對類PSE分離蛋白乳化特性的影響

EAI和ESI一般用來表征蛋白質的乳化特性，它們可以反映蛋白質幫助形成乳化體系及其穩定乳化體系的能力大小。如圖9所示，超聲處理樣品的EAI顯著高于對照組（P＜0.05），這表明超聲處理促進乳液的形成。隨著超聲功率的增加，蛋白質的EAI顯著增加（P＜0.05），超聲后蛋白質的EAI最大值為24.23 m2/g。與對照組相比，超聲功率為150、300、450 W時樣品的ESI分別提高至16.06、30.45、31.7 min，表明超聲處理可以提高乳液的穩定性。以上結果表明，超聲能夠改善類PSE分離蛋白的乳化特性。乳化特性的改善可能是由于超聲處理使蛋白質粒徑減小（圖1和表1），粒徑小的蛋白分子具有更大的分子遷移率來吸附在油-水界面周圍或是因為超聲處理誘導蛋白結構展開，暴露出更多的自由巰基和疏水基團增加蛋白的表面疏水性（圖5），從而增強界面處蛋白之間的穩定性[41]。Amiri等[42]也發現，在不同的超聲功率處理（100～300 W）30 min后，牛肉肌原纖維蛋白的EAI和ESI都顯著增加。

圖9 不同超聲功率處理對類PSE雞肉分離蛋白EAI和ESI的影響Fig. 9 Effects of different ultrasonic power levels on the emulsifying activity index and emulsifying stability index of PSE-like chicken protein isolate

2.8 相關性分析和主成分分析

不同超聲處理后類PSE分離蛋白的結構和乳化特性的Pearson’s相關性分析結果如圖10A所示。類PSE分離蛋白的平均粒徑與EAI（r=－0.959，P＜0.01）、ESI（r=－0.713，P＜0.01）呈極顯著負相關，表明平均粒徑較低的類PSE分離蛋白具有更好的乳化活性和乳化穩定性。EAI和ESI與α-螺旋相對含量、無規卷曲相對含量、自由巰基含量、熒光強度和表面疏水性呈極顯著正相關（P＜0.01），與β-折疊相對含量呈極顯著負相關（P＜0.01），表明蛋白質高級結構的改變有助于乳化特性的提高。這可能是由于超聲改變了類PSE分離蛋白的構象，使蛋白構象解折疊和柔韌性增加，可以更容易地擴張并快速吸附在油-水界面，從而提高蛋白的乳化特性[43]。溶解度與EAI（r=0.759，P＜0.01）和ESI（r=0.906，P＜0.01）呈極顯著正相關（P＜0.01），表明溶解度的增加也有利于蛋白質乳化特性的改善。由此可以看出，超聲處理后類PSE分離蛋白的結構、粒徑和溶解度的改變，對其乳化特性有著顯著和極顯著的影響。

應用主成分分析法進一步分析了不同超聲功率對類PSE分離蛋白結構和乳化特性的影響。主成分分析表明，PC1占總方差的87.4%，前兩個主成分占總方差的97.8%，說明乳化特性（EAI和ESI）與結構之間的高度相關性。在載荷圖（圖10B）中，PC1主要與EAI、ESI、熒光強度、自由巰基含量、表面疏水性、α-螺旋相對含量、無規卷曲相對含量和溶解度等因子呈正相關，與粒徑和β-折疊相對含量等因子呈負相關，這與圖10A中相關性分析結果一致。PC2主要與β-折疊相對含量和EAI等因子呈正相關。如圖10C所示，對照組和150 W組分布在PC1的負向端，而300、450 W組分布在PC1的正向端，450 W組在PC1的最右端且與對照組的距離最遠，表明超聲功率為450 W時對類PSE分離蛋白結構和乳化特性有顯著的影響。綜上，超聲處理后類PSE分離蛋白乳化特性的提高與其結構的改變存在高度相關性。

圖10 不同超聲功率處理后類PSE雞肉分離蛋白結構和乳化特性的Pearson’s相關性分析熱圖（A）、主成分分析載荷圖（B）和因子評分圖（C）Fig. 10 Heatmap of Pearson’s correlation analysis (A), PCA loading plots (B) and score plots (C) between the structure and emulsifying properties of PSE-like chicken protein isolate after ultrasonic treatments at different powers

3 結 論

本實驗利用不同功率超聲波處理類PSE分離蛋白，結果發現隨著超聲功率的增加，類PSE分離蛋白結構展開，暴露出更多的自由巰基、Trp/Tyr殘基和疏水基團，從而增加蛋白質的疏水性，進而增加蛋白的EAI；同時蛋白粒徑降低，溶解度提高，更多蛋白分子更容易吸附到油-水界面，增強了界面處蛋白之間的穩定性，使蛋白質ESI升高。超聲處理能夠改變類PSE分離蛋白的結構和物理性質，從而改善了類PSE分離蛋白的乳化特性，并且相關性分析和主成分分析表明蛋白質乳化特性的增加與其結構的改變顯著相關。因此，超聲處理提高類PSE分離蛋白功能特性，將有助于拓展應用超聲波輔助酸堿洗處理提取利用類PSE雞肉蛋白，可為類PSE分離蛋白在肉制品中的加工利用提供一定理論參考。