10-羥基癸烯酸誘導肝癌細胞凋亡、周期阻滯及遷移抑制的機制

臧延青，鞠雪瑩，翟雨晴，姚 笛，朱 磊，王長遠,2,*

（1.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江 大慶 163319；2.國家雜糧工程技術研究中心，黑龍江 大慶 163319）

肝癌又稱為肝細胞癌，具有惡性程度強、致死率高、浸潤和轉移性強、預后差的特點[1-2]。在全球范圍內，肝癌在癌癥發病率和致死率中分別位于第5位和第2位[3]，其中，我國肝癌致死率占全球50%以上[4]。肝癌常見的化學治療藥物主要有順鉑、洛鉑和5-氟脲嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）等，治療效果較好，但存在價格昂貴、毒副作用強及耐藥性高等諸多問題，限制了其在臨床上的應用。因此，開發高效、安全、低毒的潛在天然抗肝癌輔助藥物或功能因子已成為當前研究熱點。有研究表明，大豆異黃酮能夠預防肝細胞癌變、抑制肝癌細胞生長[5]；苦參堿具有促進人肝癌HepG2細胞凋亡的作用[6]。

凋亡是細胞自主調節導致細胞死亡的生理過程，由線粒體功能障礙和半胱天冬酶（Caspases）的特異性激活介導[7]，具有細胞核改變、細胞皺縮、DNA斷裂等特征，由Caspase-3的裂解啟動和多種信號通路觸發[8]。凋亡途徑通過不同的信號通路被激活，包括絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、信號轉導與轉錄活化因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）3和核因子（nuclear factor，NF）-κB信號通路[9]，其中，MAPK信號通路（由細胞外調節蛋白激酶（extracellular-signal-regulated kinase，ERK）、C-Jun氨基末端激酶（C-jun N-terminal kinase，JNK）和P38組成）在細胞生長、發育、分化、凋亡和細胞周期阻滯中起重要作用[10]；STAT3信號通路參與腫瘤的發生，是信號轉導和轉錄激活的重要轉錄因子，也被認為是許多癌細胞的致病因子和治療靶點[11-12]；NF-κB信號通路參與細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲，激活NF-κB可促進細胞增殖，抑制細胞凋亡[13]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）平衡對細胞發揮正常生理功能有著重要作用，并參與各種信號通路的轉導，與癌細胞的存活、增殖和遷移密切相關[14]。多項研究表明，ROS通過調控MAPK、NF-κB和STAT3信號通路，誘導腫瘤細胞凋亡[15-16]。

10-羥基癸烯酸（10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA）又稱為王漿酸，是蜂王漿中特有的有機酸類化合物[17]，具有抗菌消炎[18]、增強免疫力[19]、抗腫瘤[20]、抗輻射[21]、抗抑郁[22]等多種生物活性。Miyata等[23]闡明蜂王漿及其主要成分可通過調控多種腫瘤相關因子抑制腫瘤生長和癌細胞侵襲。陳立軍等[24]通過噻唑藍實驗發現，蜂王漿能促進瘤組織壞死和細胞凋亡，對黑色素瘤細胞生長有明顯的抑制作用。Yang Yuanchang等[25]通過酶聯免疫吸附劑測定試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和Western blot實驗發現，10-HDA在體外對人結腸癌WiDr細胞具有抗炎活性，同時對細胞內NF-κB信號通路相關蛋白表達水平有抑制作用。鄭錦芬等[26]通過細胞增殖活性測定、ROS檢測結果發現，10-HDA具有毒性作用，可導致細胞衰老和ROS水平升高，證實了10-HDA調控ROS水平是其發揮抗癌作用的重要方式。而癌細胞內ROS水平的升高，可調控MAPK、STAT3和非受體型酪氨酸蛋白激酶（janus kinase，JAK）2信號通路，引發Caspase-3級聯反應，進而誘導細胞發生凋亡和細胞周期阻滯作用[27]。

10-HDA對腫瘤細胞活性的抑制作用已得到了證實，但其誘導肝癌HepG2細胞凋亡和抑制遷移的功效研究鮮見報道，其作用機制尚不清楚。本研究從分子水平上，研究10-HDA對肝癌HepG2細胞的增殖抑制、誘導凋亡、細胞周期阻滯、ROS水平調控的相關信號傳導途徑和抑制細胞遷移作用，探討MAPK、NF-κB、STAT3信號通路誘導肝癌HepG2細胞凋亡作用機制，揭示10-HDA對肝癌HepG2細胞的作用靶點，為肝癌發病機理的研究及功能性食品開發提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3 種肝癌細胞株（HepG2、Hep3B、Huh7） 中科院上海細胞庫；3 種正常細胞株（L-02、IMR-90、GES-1）上海賽齊生物工程有限公司；10-HDA（純度≥98%）成都瑞芬思生物科技有限公司； 5-FU、JNK抑制劑、P38抑制劑、ERK抑制劑 美國MedChem Express公司；RPMI 1640培養基、DMEM培養基、青/鏈霉素（penicillin/streptomycin，P/S）及磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS） 美國Hyclone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 美國Gibco公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）美國Sigma公司；一抗、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗兔、抗鼠免疫球蛋白G北京中杉金橋生物技術有限公司；化學發光試劑ECL美國Thermo公司；2’,7’-二氯二氫熒光素二酯（2’,7’-dic hlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）活性氧熒光探針、細胞毒性實驗（cell counting kit-8，CCK-8）檢測試劑盒、細胞凋亡與壞死檢測試劑盒、DNA含量檢測試劑盒（細胞周期）、Annexin V-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）細胞凋亡檢測試劑盒、線粒體膜電位檢測試劑盒、核蛋白提取試劑盒北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MCO-18AIC型CO2培養箱 日本三洋公司；390302型倒置顯微鏡 德國Leica公司；SynergyHTX型酶聯免疫檢測儀 美國伯騰儀器有限公司；EVOS FL型全自動智能成像系統 美國Life Technology公司；FACS Calibvr型流式細胞儀 美國貝克曼公司；PowerPac型電泳儀、170-3940型半干轉印儀、Amersham Imager 600凝膠成像系統 美國伯樂公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

肝癌HepG2、Hep3B、Huh7細胞、正常肺IMR-90細胞及正常胃GES-1細胞的培養基為DMEM（10%（體積分數，下同）FBS、1% P/S），正常肝L-02細胞的培養基為RPMI 1640（10% FBS、1% P/S），在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中培養，當細胞匯合度達到70%～80%時進行分瓶。

1.3.2 細胞毒性檢測

取對數生長期的細胞，以每孔1×104個細胞的密度接種于96 孔板中，放置在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h后，用含1% FBS的培養液饑餓處理2 h，加入用DMSO溶解的5-FU或10-HDA，使其終濃度分別為0、1、3、10、30、100 μmol/L，每組有8個復孔，繼續培養24 h。根據CCK-8試劑盒說明書，使用酶聯免疫檢測儀測量490 nm處各孔吸光度，按下式計算細胞存活率。

式中：OD實驗組為細胞中加了5-FU或10-HDA和CCK-8溶液時的吸光度；OD空白組為無細胞且只加CCK-8溶液時的吸光度；OD對照組為細胞中只加CCK-8溶液時的吸光度。

通過SPSS 20.0軟件分析數據得出半數致死濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為39.65 μmol/L，作為后續實驗處理濃度，并用該濃度（39.65 μmol/L）的5-FU或10-HDA加入96 孔板中處理不同的時間（0、3、6、12、24、36 h）。

1.3.3 細胞凋亡率測定

取對數生長期的HepG2細胞，以每孔1×105個細胞的密度接種于6 孔板中，放置在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h后，加入終濃度為39.65 μmol/L的10-HDA或5-FU處理不同的時間（0、3、6、12、24 h），根據細胞凋亡與壞死檢測試劑盒，使用EVOS FL型全自動智能成像系統，記錄細胞凋亡及壞死的形態特征；使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡率，利用線粒體膜電位檢測試劑盒中JC-1熒光探針法檢測線粒體膜電位的變化情況，再經流式細胞儀檢測,分析細胞凋亡情況，每個樣本1×104個細胞，采用Cyexpert 1.2軟件進行數據分析。并通過Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達，方法參考1.3.8節。

1.3.4 細胞周期分布檢測

HepG2細胞經39.65 μmol/L 10-HDA處理不同的時間（0、3、6、12、24 h），1 000 r/min離心3 min收集細胞，加入1 mL預冷的75%乙醇重懸細胞，在4 ℃下固定12 h。根據DNA含量檢測試劑盒（細胞周期）說明書，經流式細胞儀分析，每個樣本1×104個細胞，采用Cyexpert 1.2軟件進行數據分析得到不同周期細胞的凋亡比例。并通過Western blot法檢測周期相關蛋白表達，方法參考1.3.8節。

1.3.5 線粒體凋亡相關信號通路蛋白表達檢測

根據核蛋白提取試劑盒說明書，提取HepG2細胞核蛋白，用于Western blot實驗分析，進行信號通路相關蛋白檢測，方法參考1.3.8節。

MAPK通路（JNK、P38和ERK）抑制劑處理：取對數生長期的HepG2細胞，以每孔1×105個細胞的密度接種于6 孔板中，放置在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h后添加抑制劑和10-HDA，分為4 組：對照組；JNK/P38/ERK抑制劑組；10-HDA組（終濃度39.65 μmol/L）；JNK/P38/ERK抑制劑+10-HDA組。繼續培養24 h，8 000 r/min離心5 min收集細胞，提取細胞蛋白，用于線粒體凋亡相關信號通路蛋白檢測，方法參考1.3.8節。

1.3.6 細胞內ROS水平檢測

取對數生長期的HepG2細胞，以每孔1×105個細胞的密度接種于6 孔板中，放置在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養24 h后，用39.65 μmol/L的10-HDA處理不同的時間（0、3、6、12、24 h），1 000 r/min離心3 min收集細胞，加入終濃度為10 μmol/L DCFH-DA室溫孵育30 min，經流式細胞儀檢測細胞熒光強度，從而分析細胞內ROS水平，每個樣本1×104個細胞，采用Cyexpert 1.2軟件進行數據分析。

將細胞分為4個小組進行處理（方法同1.3.5節）：對照組；N-乙酰-L-半胱氨酸組（N-Acetyl-L-cysteine，NAC）；10-HDA組（終濃度39.65 μmol/L）；NAC+10-HDA組。繼續培養24 h，8 000 r/min離心5 min收集細胞，根據試劑盒說明書，經流式細胞儀分析細胞凋亡數量。同時，采用上述方法收集細胞，提取細胞蛋白，用于相關信號通路蛋白檢測，方法參考1.3.8節。

1.3.7 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移情況

取對數生長期的HepG2細胞，以每孔1×105個細胞的密度接種于6 孔板中，放置在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養至細胞匯合度80%左右，在培養孔中劃出3 道豎線，分別在培養孔中加入39.65 μmol/L的10-HDA或5-FU，并處理不同的時間（0、3、6、12、24 h），使用EVOS FL型全自動智能成像系統，記錄細胞遷移情況。

1.3.8 Western blot法檢測蛋白表達

收集處理后的HepG2細胞，加入裂解液，在4 ℃下，12 000 r/min離心30 min，得到蛋白上清液，通過考馬斯亮藍法測定蛋白含量，取蛋白樣品30 μg，加入5×buffer上樣至8%～12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行分離，再將蛋白質轉至硝酸纖維素膜上，室溫下5%脫脂乳封閉2 h后，分別加入相應的一抗（Bax、Bcl-2、Cyt c、C-Caspase-3、靶向聚二磷酸腺苷核糖聚合酶（poly adenosine diphosphate-ribose polymerase，PARP）、ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、P38、P-P38、P-STAT3、STAT3、NF-κB P65、NF-κB PP65、IκB-α、Cyclin B1、CDK1/2、轉化生長因子β1、磷酸化糖原合酶激酶3β、糖原合酶激酶3β、鋅指轉錄因子、Twist轉錄因子、鈣黏蛋白E、鈣黏蛋白N、抗波形絲蛋白、β-actin、AKT、P-AKT、P21、Cyclin A、P-IκB和Lamin B1），4 ℃過夜孵育。再加入HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，使用ECL化學發光試劑顯色，通過Amersham Imager 600凝膠成像系統成像，目的條帶使用Image J軟件分析相對灰度值。

1.4 數據統計與分析

實驗數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，組間數據比較采用t檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 10-HDA和5-FU處理對肝癌細胞增殖的影響

如圖1A所示，與5-FU處理相比，10-HDA對3 種肝癌細胞具有抑制增殖作用，其抑制作用呈劑量依賴性。經計算可知，HepG2細胞的IC50為39.65 μmol/L，且對10-HDA的敏感度高于其他肝癌細胞，因此，后續實驗以HepG2細胞為主要的研究對象。此外，10-HDA處理對3 種正常細胞的毒性均低于5-FU（圖1B）。經39.65 μmol/L 10-HDA和5-FU處理后，肝癌細胞和正常細胞的存活均受到了明顯的抑制，且抑制作用呈時間依賴性（圖1C）。對于人正常細胞L-02、IMR-90、GES-1的存活率，在處理24 h時，5-FU處理后細胞存活率分別為42.11%、40.77%、48.07%，10-HDA處理后細胞存活率分別為58.45%、60.42%、60.07%，由此看出，與5-FU組相比，10-HDA對正常細胞系的毒副作用更小。當處理36 h時，10-HDA處理后細胞人正常細胞L-02、IMR-90、GES-1的存活率分別為44.77%、40.33%、46.06%，此時細胞存活率過低，藥物對人正常細胞有明顯的殺傷作用，因此，后續研究藥物處理時間均為24 h（圖1D）。

圖1 10-HDA對細胞存活率的影響Fig. 1 Effect of 10-HDA on cell viability

2.2 10-HDA對HepG2細胞凋亡的影響

HepG2細胞經10-HDA處理后，進行了Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染，隨著藥物處理時間的延長，HepG2細胞發生皺縮，具有凋亡形態學特征。通過熒光顯微鏡觀察，熒光強度隨10-HDA處理時間的延長逐漸增大，與5-FU處理后的細胞熒光強度有明顯差異（圖2A）。流式細胞術結果顯示，10-HDA處理24 h后HepG2細胞凋亡率高達49.24%（圖2B）；JC-1是一種檢測線粒體膜電位的熒光探針，當線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體基質中，形成聚合物（紅色）；當線粒體膜電位較低時，JC-1不能夠聚集在線粒體基質中，此時為單體（綠色）；用聚合體與單體熒光強度比值來表示線粒體的去極化作用。JC-1熒光探針法檢測結果顯示（圖2C），10-HDA處理后線粒體膜電位下降導致細胞凋亡。Western blot結果顯示，隨著藥物處理時間的延長，促凋亡蛋白Bax、Cyt c、C-Caspase-3和PARP的蛋白表達水平升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達水平明顯降低（圖2D）。

圖2 10-HDA對HepG2細胞凋亡及其相關凋亡蛋白表達的影響Fig. 2 The effect of 10-HDA on the apoptosis of HepG2 cells and the expression of apoptotic proteins

2.3 10-HDA對HepG2細胞周期分布的影響

流式細胞術結果顯示，G2/M期細胞凋亡率明顯升高，G0/G1期細胞凋亡率下降，且呈時間依賴性（圖3A）。Western blot檢測結果顯示，G2/M期相關蛋白P-AKT、Cyclin B1、CDK1/2和Cyclin A的表達水平降低，P21的蛋白表達水平升高（圖3B）。綜上所述，10-HDA通過調控HepG2細胞周期相關蛋白的表達，誘導HepG2細胞在G2/M期發生細胞周期阻滯。

圖3 10-HDA對HepG2細胞周期阻滯的影響Fig. 3 Effect of 10-HDA on cycle arrest in HepG2 cells

2.4 10-HDA對HepG2細胞線粒體凋亡的影響

HepG2細胞經10-HDA處理后，Western blot檢測結果顯示，P-ERK、P-STAT3、NF-κB P65和NF-κB PP65的蛋白表達水平降低，P-JNK、P-P38、IκB-α的蛋白表達水平增加，且呈時間依賴性（圖4A）。細胞核內STAT3、NF-κB和P-IκB的蛋白表達水平明顯降低（圖4B）。此外，利用MAPK抑制劑驗證MAPK和STAT3信號通路在細胞凋亡中的作用，結果顯示（圖5A～C），10-HDA處理組的P-STAT3、NF-κB的蛋白表達量降低，P-JNK、P-P38、IκB-α、Caspase-3蛋白水平升高，在加入JNK或P38抑制劑與10-HDA共同處理后，P-STAT3、NF-κB蛋白表達水平明顯升高，P-JNK、P-P38、IκB-α、Caspase-3蛋白水平明顯下降。但加入ERK抑制劑后的蛋白表達量的變化與加入其他兩組抑制劑的結果不一致，P-ERK、P-STAT3、NF-κB的蛋白表達量明顯更低，IκB-α、Caspase-3蛋白表達量明顯升高，表明10-HDA通過調控MAPK、STAT3和NF-κB信號通路誘導HepG2細胞線粒體依賴性凋亡。

圖4 10-HDA對HepG2細胞線粒體依賴性凋亡的影響Fig. 4 Effect of 10-HDA on mitochondria-dependent apoptosis of HepG2 cells

圖5 加入MAPK抑制劑的蛋白表達情況Fig. 5 Effect of MAPK inhibitors on the expression of proteins

2.5 10-HDA對ROS水平誘導HepG2細胞凋亡的影響

與對照組相比，HepG2細胞經10-HDA處理后，細胞內ROS水平呈時間依賴性增加（圖6A）。NAC和10-HDA共同處理組細胞凋亡率與10-HDA處理組相比顯著降低，表明加入NAC后抑制了10-HDA誘導細胞內ROS的積累引起的HepG2細胞凋亡（圖6B）。Western blot結果顯示，與NAC處理組相比，10-HDA處理組細胞質中P-JNK、P-P38、IκB-α和Caspase-3蛋白表達水平明顯升高，P-ERK、P-STAT3和NF-κB蛋白表達水平明顯下降。而與10-HDA處理組相比，NAC與10-HDA共同處理組的P-JNK、P-P38、IκB-α和Caspase-3蛋白表達水平顯著下降，P-ERK、P-STAT3和NF-κB蛋白表達水平明顯回升（圖6C）。10-HDA明顯抑制了細胞核中STAT3、NF-κB和P-IκB的蛋白表達水平，加入NAC處理后，蛋白表達水平明顯回升（圖6D）。綜上所述，10-HDA通過上調ROS水平激活MAPK、STAT3和NF-κB信號通路，觸發細胞線粒體凋亡。

圖6 10-HDA對ROS水平誘導HepG2細胞凋亡的影響Fig. 6 Effect of 10-HDA on ROS-induced apoptosis in HepG2 cells

2.6 10-HDA對HepG2細胞遷移和侵襲的影響

與對照組相比，10-HDA處理組細胞遷移能力明顯受到抑制，且呈時間依賴性（圖7A）。Western blot結果顯示，細胞遷移相關蛋白轉化生長因子β1、磷酸化糖原合酶激酶3β、鋅指轉錄因子、Twist轉錄因子、鈣黏蛋白N和抗波形絲蛋白的表達水平顯著下降，鈣黏蛋白E表達水平顯著上升，且呈時間依賴性（圖7B）。可知，10-HDA能夠抑制HepG2細胞的遷移和侵襲。

圖7 10-HDA對HepG2細胞遷移和侵襲的影響Fig. 7 Effect of 10-HDA on the migration and invasion of HepG2 cells

2.7 10-HDA對肝癌細胞凋亡、周期阻滯及遷移的影響

根據以上研究結果，可繪制出10-HDA誘導肝癌細胞凋亡、周期阻滯及遷移抑制的信號通路圖，見圖8。通過信號通路圖可看出，10-HDA通過介導細胞內ROS水平，從而調控MAPK/STAT3/NF-κB信號通路來誘導肝癌細胞凋亡，調控轉化生長因子β1來抑制肝癌細胞的侵襲和轉移。從分子水平上，表明10-HDA能夠誘導肝癌HepG2細胞凋亡作用機制。

圖8 10-HDA誘導肝癌細胞凋亡、周期阻滯及遷移抑制機制的示意圖Fig. 8 Schematic diagram of 10-HDA-induced apoptosis, cycle arrest and migration inhibition in hepatocellular carcinoma cells

3 討 論

10-HDA是蜂王漿中主要活性成分，具有抑制腫瘤細胞的分化、遷移和促進多種惡性腫瘤細胞凋亡或病例組織壞死的功效[28-29]。CCK-8檢測結果表明10-HDA能明顯抑制肝癌HepG2細胞的增殖，對肝癌HepG2細胞具有良好的殺傷作用。本實驗從細胞增殖、凋亡、細胞周期分布、ROS水平調控的相關信號傳導途徑和細胞遷移5個方面分別證實10-HDA對肝癌細胞的影響。

上調ROS水平可抑制腫瘤細胞生長[30]，有研究表明，正常細胞能夠維持正常的ROS水平，而腫瘤細胞內的ROS水平明顯高于正常細胞[31]，這使腫瘤細胞對ROS的水平上升更為敏感，因此，可通過上調細胞內ROS的水平來誘導腫瘤細胞凋亡。本實驗中，10-HDA上調了HepG2細胞ROS水平，導致MAPK、NF-κB、STAT3信號通路被激活，相關蛋白表達發生改變。MAPK信號通路是細胞增殖、分化、遷移和凋亡的關鍵，不同的細胞外刺激可以激活不同的MAPK信號通路，通過JNK、P38和ERK信號通路之間的相互調節來介導各種細胞生物反應。JNK和P38參與氧化應激反應、細胞分化和凋亡[30]，ERK是傳遞有絲分裂原信號，調節細胞增殖、分化和存活的信號轉導蛋白[32]。本實驗結果表明，10-HDA通過上調ROS水平，激活了MAPK、NF-κB和STAT3信號通路，最終誘導肝癌HepG2細胞凋亡。

凋亡是一種細胞程序性死亡的過程，主要通過死亡受體途徑和線粒體途徑發生[8]。線粒體凋亡途徑的關鍵組成部分Bcl-2蛋白家族（包括Bcl-2和Bax），位于線粒體上游[33]，MAPK和NF-κB信號通路的激活導致下游的Bcl-2蛋白家族發生變化，其中促凋亡蛋白Bax使線粒體外膜通透化時，凋亡蛋白酶活化因子Cyt c得到釋放，進而激活Caspase級聯反應下游的Caspase-3[34]。Caspase-3是細胞凋亡啟動的關鍵因子，參與包括PARP在內的許多關鍵蛋白的蛋白裂解[35]。結果表明，促凋亡蛋白Bax、Cyt c表達水平升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平降低，導致Caspase-3被激活，PARP表達水平升高。上述研究結果表明，10-HDA可通過調控Bax和Bcl-2的表達水平，破壞線粒體外膜的通透性，從而誘導肝癌HepG2細胞凋亡。

細胞周期阻滯是控制細胞增殖和誘導細胞凋亡的重要調控機制之一[36]，下調STAT3活性可抑制AKT的磷酸化及激活[37]，AKT在細胞存活、代謝、遷移和侵襲等信號通路中起重要的調控作用[38]，抑制AKT信號通路的活性，可發生細胞周期阻滯[39]。結果表明，10-HDA通過上調ROS水平，激活STAT3信號通路，使STAT3磷酸化水平下降，從而抑制AKT的磷酸化水平，下游蛋白Cyclin B1、CDK1/2和Cyclin A表達水平下降，P21蛋白表達水平升高，最終誘導肝癌HepG2細胞在G2/M周期發生阻滯。

轉化生長因子β1介導腫瘤細胞發生上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），是參與細胞侵襲、轉移的關鍵因子，能夠提高侵襲和遷移能力[40]，通過抑制轉化生長因子β1的表達來抑制肝癌HepG2細胞的侵襲和遷移[41]。有研究表明，通過增加ROS水平，抑制轉化生長因子β1誘導的糖原合酶激酶3β磷酸化，而其下游鋅指轉錄因子和Twist轉錄因子是鈣黏蛋白E的關鍵轉錄因子[42]，上調鈣黏蛋白E蛋白的表達可以抑制癌細胞的遷移和侵襲，而鈣黏蛋白N與之相反[43]，此外，鈣黏蛋白E的過表達導致抗波形絲蛋白表達降低，抑制了EMT的發生[44]。因此，抑制EMT的發生是抑制細胞遷移的重要過程。本實驗中，10-HDA通過增加HepG2細胞ROS水平，下調了轉化生長因子β1、磷酸化糖原合酶激酶3β、鋅指轉錄因子、Twist轉錄因子、鈣黏蛋白N和抗波形絲蛋白的表達水平，上調了鈣黏蛋白E蛋白的表達水平，從而抑制了EMT的發生。以上研究結果表明，10-HDA能夠抑制肝癌HepG2細胞遷移作用。

綜上所述，10-HDA處理HepG2細胞后，細胞內ROS水平升高，激活MAPK、NF-κB和STAT3信號通路，觸發線粒體依賴性凋亡，并在G2/M周期發生細胞阻滯，同時抑制了轉化生長因子β1信號通路，抑制了細胞遷移和侵襲。該實驗結果可為研究10-HDA的生理功能、肝癌發病機理及功能性食品開發提供一定的理論基礎。