黃花倒水蓮總皂苷抗凝血和抗血栓作用及機制：基于網絡藥理學

劉育鋮，毛思宇，李 昱，胡倩梅，鄒 輝，馮 星,*

（1.湖南師范大學醫學院，湖南 長沙 410013；2.湖南師范大學 小分子靶向藥物研究與創制湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410013）

黃花倒水蓮（Polygala fallaxHemsl，PFH）為遠志科遠志屬黃花倒水蓮的干燥根，在湖南省內資源豐富，具有補益氣血、健脾利濕、活血調經等功能，可用于急性慢性肝炎、跌打損傷、腰膝酸軟、病后體弱等疾病的治療，還具有一定的抗衰老作用，為少數民族瑤族的常用藥物，是南方傳統的藥食同源植物，民間常用其根部來燉煮肉類進行食療[1-2]。PFH主要成分可大致分為皂苷類、山口酮類、有機酸類和脂類等[3-5]，目前關于PFH的研究表明其藥理作用主要有以下4個方面：1）調血脂：黃花倒水蓮總皂苷（total saponin ofPolygala fallaxHemsl，PTS）降低高脂血癥病人機體內甘油三酯、總膽固醇以及低密度脂蛋白的含量，提高高密度脂蛋白含量[6-7]；2）抗凝：PFH水提取液可增加家兔的血漿復鈣時間、部分凝血活酶時間，同時可以抑制小鼠的足跖腫脹；3）抗氧化：口山酮類成分可以明顯降低小鼠肝臟中過氧化脂質含量，對小鼠血液細胞中超氧化物歧化酶的活性提升有一定作用；4）抗癌：PFH乙酸乙酯提取物可抑制肝癌細胞HepG2的增殖并促進其凋亡[8-10]。目前，關于PFH的臨床應用主要為：PFH熬制成的口服液治療原發性的高脂血癥，黃花參肝舒袋、白蓮湯治療慢性乙型肝炎[11-12]；而關于其抗凝血活性的相關應用鮮見報道。PFH為少數民族特色藥材，其價值沒有獲得充分的開發與利用，且已有初步研究表明PFH水煎液具有抗凝血效果，但未作深入探討，通過對PFH的化學成分、抗凝血作用及其機制的研究，為后續研究開發新型的抗凝血、抗血栓藥物奠定基礎。

網絡藥理學是一個結合多種學科的綜合概念，英國科學家Hopkins于2007年第一次解釋了其概念[13-15]，這是一種對系統機制研究、藥物療效評估和藥物開發設計的科學研究方法[16]。王林海等[17]運用了網絡生物學的相關概念，對蛋白質、基因與藥物之間互相影響關系進行了集中分析，他們發現許多與疾病相關聯的蛋白和藥物之間的影響關系不全是直接的，也有部分是通過間接作用來發揮其療效。中草藥多組分、多靶點及其各組分共同作用的特點使之成為了一個復雜的體系[18-20]，其信息量巨大，具有復雜的成分、豐富的靶點和龐大的系統，想從混合物的系統上展開其對人體影響的研究有著諸多難點。而將網絡藥理學和中草藥相結合的研究方法則順應了兩者之間的核心思想，探究事物的角度都是從事物之間的互相聯系這一要點出發[21-22]。充分利用網絡藥理學的層層關系建立成分-靶點-通路-疾病模型，可對傳統中草藥的配伍、組方、君臣佐使規律、作用靶點的識別和藥效學物質理論基礎進行科學合理的解釋，為復雜中草藥系統的研究、臨床前治療方案的研究提供了新的思路和方法[23]。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

無特定病原體級遠交群（sprague dawley，SD）大鼠，日齡56～59 d，生產許可證號：SCXK（鄂）2017-0012。

PFH藥材采摘自湖南省郴州市桂東縣，經由湖南師范大學醫學院藥學系盛習鋒副教授鑒定為遠志科遠志屬PFH的干燥根。

正常凝血質控血漿、活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）試劑盒、CaCl2、凝血酶時間（thrombin time，TT）試劑盒、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）試劑盒 德國TECO GmbH公司；NaOH 天津市大茂化學試劑廠；Tris-HCl 美國Amresco公司；低分子肝素 法國Sanofi-Aventis公司；磺達肝癸鈉 英國Glaxo Smithkline公司；肝素Anti-FIIa試劑盒、肝素Anti-FXa試劑盒 法國Hyphen Bio Med公司；復方血栓通膠囊 廣東眾生藥業股份有限公司；FeCl3溶液上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、水合氯醛 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

1100分析型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國安捷倫公司；MC-4000血液凝固分析儀 德國Teco GmbH公司；Vortex Genie漩渦振蕩器 美國Scientific Industries公司；ELx 808酶標儀 美國Bio-Tek公司；XS 105DU電子天平美國Mettler Toledo公司；100～1 000 μL移液槍 德國Eppendorf公司；500T標準型血凝杯 德國Teco GmbH公司；JB-P5包埋機 武漢俊杰電子有限公司；RM2016病理切片機 日本徠卡（上海）公司；Eclipse ci正置光學顯微鏡、DS-U3成像系統 日本尼康儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 PTS的提取

通過熱回流法提取PTS，將PFH根部粉末按照1∶30的料液比加入體積分數70%乙醇溶液，于回流提取裝置（65 ℃、250 W、50 kHz）提取1 h，提取2 次，合并提取液，旋蒸后溶于去離子水中，并依次用氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取。將正丁醇餾分溶于去離子水中，通過D101大孔樹脂柱，用去離子水-不同體積分數乙醇溶液梯度洗脫，得到20%、70%、95%乙醇組分以及水組分的PTS提取液。用旋轉蒸發蒸儀回收乙醇后置于冷凍干燥機中揮干水分，即得PTS干燥粉末，之后進行含量測定。

1.3.2 PTS中皂苷A質量分數的測定

樣品處理：精密稱取PTS 5 mg，用無水甲醇溶解，并轉移至10 mL的容量瓶內，定容至刻度，搖勻，并用0.45 μm微孔濾膜過濾，得到質量濃度0.5 mg/mL的樣品儲備液。

對照品處理：精密稱取PTS中皂苷A對照品1 mg，用甲醇溶解，轉移至10 mL容量瓶中，搖勻，用甲醇定容至刻度，得到質量濃度為0.1 mg/mL的對照品儲備液。再從儲備液中分別吸取20、50、100、150、200 μL于10 mL容量瓶中，搖勻并定容至刻度，獲得PFH中皂苷A對照品溶液。

色譜條件：流動相：乙腈與0.05%磷酸（40∶60，V/V），檢測波長：210 nm，進樣量：10 μL，流速：1.0 mL/min，柱溫40 ℃。

標準曲線的建立：分別吸取對照品溶液各10 μL進樣測定。以峰面積（Y）對質量濃度（X）進行線性回歸，即得標準曲線。再吸取樣品溶液10 μL進樣測定并計算出PTS中的皂苷A質量分數。

1.3.3 網絡藥理學預測PTS有效成分的作用靶點

以PFH、Polygala fallaxHemsl、黃花遠志等關鍵詞在TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、ChEMBL（https://www.ebi.ac.uk/chembl/）、Chemistry Database（http://www.organchem.csdb.cn）、中醫藥系統藥理學數據庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）等數據庫以及現有文獻報道中查詢PFH的相關成分及其相關作用靶點，將上述成分結構式的Mol2文件上傳至靶點預測工具Swiss（http://www.swisstargetprediction.ch）和DrugBank（https://www.drugbank.ca）得到每個成分所對應的一系列可能靶點以及每個靶點的Uniport編碼（Uniport ID）、自由度（Degree）、相關疾病和相關通路，并保存為Excel文件。然后將上述有效成分的靶點代入String工具中，得到PTS的蛋白相互作用網絡圖，并對其進行京都基因與基因百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析和基因本體（gene ontology，GO）分類生物學過程分析。以FII和PTAFR為關鍵詞，在KEGG（https://www.kegg.jp/）搜索，將檢索得到的通路圖重新組合，得到凝血因子II（coagulation factor II，FII）和血小板活化因子受體（platelet activating factor receptor，PTAFR）的凝血機制通路圖。

1.3.4 APTT、TT、PT的測定

APTT、TT、PT測定均依據試劑盒說明書進行實驗操作，該方法中以低分子肝素和黃達肝葵鈉作為PTS的對照品，以Tris-HCl緩沖溶液作為空白對照。

1.3.5 FIIa、FXa活力測定

抗凝血酶存在下FIIα、輔因子X（cofactor X，FX）α活力的測定：分別按照肝素Anti-FIIa試劑盒和肝素Anti-FXa試劑盒說明書進行實驗操作。

1.3.6 大鼠頸總動脈血栓模型的建立及血栓形成抑制率測定

分組：36 只SD大鼠適應性飼養一周后隨機分為：A組：不進行誘導處理的空白組（等劑量羧甲基纖維素鈉（sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na）溶液）；B組：通過FeCl3誘導大鼠產生動脈血栓且不進行藥物處理的模型組（等劑量CMC-Na溶液）；C組：血栓通膠囊組（60 mg/kg）；D組：低劑量PTS（low concentration of PTS，PTS-LD）組（30 mg/kg）；E組：中劑量PTS（medium concentration of PTS，PTS-MD）（60 mg/kg）組；F組：高劑量PTS（high concentration of PTS，PTSHD）（120 mg/kg），每組6 只。各組藥物分別用質量分數0.5% CMC-Na溶解至所需質量濃度。

給藥方式：灌胃給藥，1 mL/100 gmb，每日1 次，連續15 d。

FeCl3誘導大鼠頸總動脈血栓模型：參照文獻[24-28]并加以改進，最后一次給藥1 h后對大鼠實施腹腔麻醉，進行頸總動脈血栓造模，沿頸正中線切開1～2 cm，鈍性分離左側頸總動脈2.5 cm，放置無菌手術巾（3 cm×2 cm）于血管下方防止FeCl3損傷血管及其周圍組織，將吸有2.2 mol/L FeCl3溶液的濾紙條（1.5 cm×1.0 cm）環繞包裹并緊貼住暴露的頸動脈段，空白組放置生理鹽水濾紙條，等待15 min后取下濾紙條（從濾紙條環裹后立即開始記錄時間），精確剪下形成血栓位置處的血管。取下形成血栓的血管，用濾紙輕輕擦拭，擦干后于電子天平逐個稱出其質量，按下式計算其血栓形成抑制率（inhibition ratio，IR）。

稱質量后立即將血管放于體積分數10%甲醛試劑中24 h進行固定，取出后用流水沖洗4 h，制作石蠟切片，進行蘇木精-伊紅染色，通過顯微鏡觀察血栓結構。

1.4 數據處理與分析

采用SPSS 11.5和GraphPad Prism 6.01軟件進行數據分析，所有實驗均重復3 次，用平均值±標準差來表示實驗數據，并用One-Way ANOVA方法對數據進行統計學分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

縮小網店服務范圍的面積，增加一定網店的數量，來進行網點的擴張。通過網點拆分方法，原來一個網點所負責的服務范圍現在由多個新網點來服務，原來的網點小了，但是服務范圍擴張了，配送的效率也提升了，可以有效解決網點覆蓋區域不夠廣泛的問題，減少了人員和資源的浪費，節約了資本，提高了服務水平。并撤銷布局失誤和市場資源匱乏以及在市場競爭中被淘汰的網點，合并那些布局不合理，但還擁有一部分市場資源的網點，優化企業管理，提高企業運行效率和企業競爭力。

2 結果與分析

2.1 PTS中皂苷A質量分數

由圖1A、B可知，峰1和峰2均為皂苷A。通過標準曲線方程（圖1C）計算得出，樣品中皂苷A質量濃度為8.365 7 μg/mL，即該批次PTS中皂苷A質量分數為1.673%。

圖1 PTS中皂苷A的HPLC圖及標準曲線Fig. 1 HPLC chromatograms of saponin A in PTS and calibration curve for determination of saponin A

2.2 PTS的有效成分-作用靶點網絡

通過一系列數據庫分析獲得PFH的52 種已知成分，以口服生物利用率≥30%或藥物相似性≥0.18、藥物對小腸上皮細胞通透性≥0.4為指標篩選出20 種有效成分。通過Swiss等數據庫，尋找PTS的有效成分對應靶點。其中FII和PTAFR的自由度較高，自由度越高說明中藥成分與其之間的聯系越緊密，預測成為有效靶點的可能性和準確性也越高，并且兩者都是凝血相關通路上的主要目標靶點，所以將PTS有效成分及相關靶點Excel文件導入Cytoscape 3.4.2軟件并利用該軟件繪制出PTS的有效成分-作用靶點網絡圖（圖2）。靶點自由度與圖形的面積成正相關關系，即圖形面積越大，靶點自由度越高，靶點預測的準確性越高。

圖2 PTS有效成分-作用靶點網絡圖Fig. 2 C-T network diagram of PTS and targets

2.3 PTS的蛋白-蛋白相互作用網絡

將20 種有效成分的靶點代入Sting工具中，得到PTS的蛋白-蛋白相互作用網絡圖（圖3），并進行KEGG通路富集分析和GO分析富集生物學過程分析，其中FII和PTAFR參與的KEGG通路主要有補體及凝血級聯反應通路、血管平滑肌收縮相關通路以及鈣離子信號通路等，研究目標參與的生物學過程主要有細胞表面受體信號通路、細胞增殖的調控以及代謝過程等。

圖3 PTS蛋白-蛋白相互作用網絡圖Fig. 3 Protein-protein interaction network diagram of PTS

2.4 PTS的抗凝血機制通路

以FII和PTAFR為關鍵詞，在KEGG數據庫中搜索，將得到的通路圖重新組合，得到FII和PTAFR對應的凝血機制通路圖（圖4）。活化的FII可連接并切割蛋白酶活化受體（protease activated receptors，PAR）1和PAR4，活化的FII還可以直接和凝血調節蛋白結合，將蛋白C從酶原形式激活轉變為活化蛋白C，在Ca2+存在下可大大加快其激活過程，說明FII可能為PTS發揮抗凝血作用聯系最緊密、可能性最大的靶點。

圖4 PTS抗凝血機制通路圖Fig. 4 Pathway diagram for the anticoagulation mechanism of PTS

2.5 PTS存在情況下對APTT的影響

由表1可知，空白對照組APTT為（33.47±0.38）s。在4～32 μg/mL低分子肝素和8～128 μg/mL磺達肝癸鈉對APTT有影響。由表2可知，在0～2 mg/mL范圍內，PTS可劑量依賴性地延長質控血漿APTT。對樣品（低分子肝素、黃達肝葵鈉、PTS）終質量濃度與APTT進行線性擬合，并由擬合方程計算延長一倍APTT所需樣品質量濃度，其結果見表3，人質控血漿APTT延長一倍所需的低分子肝素、黃達肝葵鈉、PTS質量濃度分別為9.90、87.11 μg/mL和0.36 mg/mL。

表1 不同質量濃度低分子肝素和磺達肝癸鈉存在下APTT檢測結果Table 1 APTTs of different concentrations of low-molecular-mass heparin and fondaparinux sodium

表2 不同質量濃度PTS存在下APTT檢測結果Table 2 APTTs in the presence of different concentrations of PTS

表3 不同化合物抗凝血活性APTT檢測結果Table 3 Anticoagulant activity of different compounds as determined according to APTTs

2.6 PTS存在情況下對TT的影響

由表4可知，空白對照組TT為（9.53±0.58）s。2～24 μg/mL的低分子肝素和8～128 μg/mL的磺達肝癸鈉對TT有影響。由表5可知，在0～2 mg/mL范圍內，PTS可劑量依賴性地延長質控血漿TT。對樣品終質量濃度與TT均值進行線性擬合，并由擬合方程計算延長一倍TT所需樣品質量濃度，結果見表6，人質控血漿TT延長一倍所需的低分子肝素、PTS質量濃度分別為5.01 μg/mL、0.14 mg/mL。

表4 不同質量濃度低分子肝素和磺達肝癸鈉存在下TT檢測結果Table 4 TTs in the presence of different concentrations of lowmolecular-mass heparin and fondaparinux sodium

表5 不同質量濃度PTS存在下TT檢測結果Table 5 TTs in the presence of different concentrations of PTS

表6 不同化合物抗凝血活性TT檢測結果Table 6 Anticoagulant activity of different compounds as determined according to TTs

2.7 PTS存在情況下對PT的影響

表7 不同質量濃度低分子肝素、磺達肝癸鈉和PTS存在下PT檢測結果Table 7 PTs in the presence of different concentrations of lowmolecular-mass heparin, fondaparinux sodium and PTS

表8 不同化合物抗凝血活性PT檢測結果Table 8 Anticoagulant activity of different compounds as determined according to PTs

2.8 PTS對FIIa和FXa活力的影響

低分子肝素對抗凝血酶依賴的FXa活力半數抑制質量濃度（half-maximal inhibitory concentration，IC50）為（51.63±2.02）μg/mL，PTS對FXa的活力無影響（表格未列出）。由表9和圖5可知，低分子肝素對抗凝血酶依賴的FIIa活力IC50為（0.06±0.00）μg/mL，隨著低分子肝素、PTS質量濃度的增加，FIIa活力逐漸減小，PTS可劑量依賴性地抑制FIIa的活力，其IC50為（85.88±12.50）μg/mL，說明PTS是通過抑制FIIa活力即凝血酶活性來發揮其抗凝血作用。

表9 PTS對FIIa活力的影響Table 9 Effect of PTS on FIIa activity

圖5 FIIa相對活力與樣品質量濃度的線性擬合曲線Fig. 5 Linear fitting curve between relative FIIa activity and sample concentration

2.9 PTS對FeCl3誘導大鼠頸總動脈血栓模型的影響

由圖6及表10可知，空白組頸部總動脈血管腔內無血栓結構形成，血栓面積率為0.05%，如綠色箭頭所指，血管各層膜結構明顯。模型組血管腔內明顯可見有閉塞性血栓結構形成，血管組織結構異常，管腔內可見大量混合血栓，導致管腔狹窄，紅色箭頭所示為大量纖維蛋白，黑色箭頭所示為紅細胞及少量血小板，動脈內膜內皮細胞數量減少，中膜顯著變薄，結構不明顯，血栓面積率為86.85%。與模型組相比，PTS-LD和PTS-MD組血管腔內血栓結構有略微程度的減少，血栓面積率分別為78.84%和72.79%，而血栓通膠囊組和PTS-HD組血管腔內中可看出血栓結構較模型組明顯減少，血栓面積率分別為50.69%和43.51%。PTS-LD和PTS-MD組對血栓形成的抑制率較低，分別為13.6%和16.2%，血栓通膠囊組和PTS-HD組對血栓形成有顯著的抑制效果，其抑制率為39.7%和47.4%。

表10 各組藥物對FeCl3誘導大鼠頸總動脈血栓模型的影響Table 10 Inhibitory effect of tested drugs on FeCl3-induced common carotid artery thrombosis in rats

圖6 各組藥物對大鼠血栓影響的蘇木精-伊紅染色切片圖（100×）Fig. 6 Effect of tested drugs on rat thrombosis (100 ×)

3 結 論

本實驗找到52 種已知的PFH成分，篩選出20 種有效成分。以這些成分為基礎，得到PTS的有效成分-作用靶點網絡圖，發現PTS對FII和PTAFR兩個靶點有作用，通過蛋白-蛋白相互作用圖發現FII和PTAFR兩個靶點主要參與凝血級聯等反應通路，得到的FII和PTAFR對應的凝血機制通路圖，進一步說明FII可能為PTS發揮抗凝血作用聯系最緊密、可能性最大的靶點。

體外凝血3 項檢測實驗結果表明，在質量濃度2～32 μg/mL范圍內，低分子肝素對APTT和TT的影響較大，對PT無顯著影響，其延長人質控血漿APTT、TT一倍所需質量濃度分別為9.90 μg/mL和5.01 μg/mL，與對照組相比，其對內源性凝血途徑和共同凝血途徑影響較大，不影響外源性凝血途徑。在質量濃度8～128 μg/mL范圍內，磺達肝癸鈉僅對APTT有顯著影響，對TT和PT均無影響，其延長人質控血漿APTT一倍所需質量濃度為87.11 μg/mL，與對照組相比僅對內源性凝血途徑有影響，對共同凝血途徑和外源性凝血途徑沒有影響。上述研究結果與現有報道結果[29-31]一致，在質量濃度0～2 mg/mL范圍內，PTS對APTT、TT有顯著影響，可以劑量依賴性地延長人質控血漿的APTT和TT，對PT無影響，其倍增人質控血漿APTT、TT所需質量濃度分別為0.36 mg/mL和0.14 mg/mL，與對照組相比，PTS是通過影響內源性和共同凝血途徑來體現其抗凝效果的。體外FIIa和FXa活力檢測實驗結果表明，PTS對FXa活力無影響，可劑量依賴性地抑制FIIa活力，其IC50為（85.88±12.50）μg/mL。

體內FeCl3誘導大鼠頸總動脈血栓模型影響的檢測結果表明PTS-HD組可顯著抑制大鼠頸總動脈血栓的形成，其血栓面積率為43.51%，抑制率為47.4%，抑制效果優于已上市陽性對照藥血栓通膠囊組（血栓面積率為50.69%，抑制率為39.7%），說明PTS可以抑制FeCl3誘導的大鼠頸總動脈血栓形成。結合體外實驗結果可以推測PTS的抗血栓作用是基于對凝血系統的抑制作用，即通過抑制凝血酶FIIa的活力從而抑制纖維蛋白凝塊和局部血凝塊形成來發揮抗凝血、抗血栓作用。

PTS的抗凝血活性已有前期的研究基礎，通過體內外實驗證實了PTS的抗凝血、抗血栓作用，并首次發現其抗凝血作用的靶點為內源性凝血途徑上的FIIa。在后續的研究計劃中，本課題組將嘗試提取分離出總皂苷含量更高的PTS并分離制備出一系列單一的皂苷類化合物，以期得到未見報道的新皂苷類化合物以及探究單一皂苷類化合物是否較PTS具有更強更有效的抗凝血活性。