南瓜籽蛋白源血管緊張素轉化酶抑制肽的制備及其降血壓活性

何海艷，劉夢婷，楊愛萍，蔣彩云，崔 逸，汪洪濤

（1.江蘇經貿職業技術學院健康學院，江蘇 南京 211168；2.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210023）

高血壓是最常見的慢性心血管疾病，與人類多種臟器并發癥緊密聯系，嚴重危害人類的健康。據統計，全球成人高血壓患病率約為30%，中國高血壓病患高達2.45億 人[1]，有鑒于此，《國務院關于實施健康中國行動的意見》（國發〔2019〕13號）已經對包括高血壓在內的重大慢性病發起了“攻堅戰”。腎素血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統是機體調節血壓的重要系統，其中血管緊張素轉化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）I會促進腎素血管緊張素系統的升血壓和減弱激肽釋放酶-激肽系統的降血壓作用，因此，抑制ACE活性是控制血壓的一種有效措施[2]。

目前，臨床降血壓藥物ACE抑制劑如卡托普利、阿拉普利、依那普利和賴諾普利等雖然藥效明顯，但會引起嘔吐、心悸等副作用[3]。近年來，食物源生物活性肽因其營養、安全性引起了極大的關注，研究人員已經從雞蛋、魚肉等動物蛋白源以及青豆、海藻、花生等植物蛋白資源中獲得多種食源性ACE抑制肽[4]，并且闡明了相關活性機制和降血壓活性效果[5]。最新的研究認為，血壓輕度升高會使患者產生記憶力下降和患阿爾茨海默病的風險[6]，不僅高血壓患者需要降血壓，正常人收縮壓降低5 mm Hg也會大大降低心血管事件風險[7]；因此，活性肽等類似的降血壓產品將具有廣闊的應用空間。

南瓜籽中含有30%～40%的蛋白質，氨基酸組成豐富，是一種較好的植物蛋白資源。目前，關于南瓜籽蛋白源ACE抑制肽的研究相對較少，南瓜籽肽可能存在的ACE抑制分子機制也不夠清楚。因此，本實驗采用堿性蛋白酶水解南瓜籽蛋白釋放ACE抑制肽，通過膜分離技術獲得ACE抑制肽并通過質譜技術鑒定其結構，同時利用ACE抑制活性實驗、自發性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHRs）模型、抑制動力學和分子對接方法研究ACE抑制肽的降血壓活性和酶抑制機制，以期為南瓜籽降血壓肽的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SHRs（SPF級無特定病原體（生產許可證號SCXK（蘇）2019-0001） 北京維通利華實驗動物技術有限公司。

南瓜籽為烏魯木齊市售；堿性蛋白酶（Alcalase）、ACE、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸（N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine，FAPGG） 北京索萊寶科技有限公司；兔肺ACE（酶活力100 U/L） 美國Sigma公司；透析袋 美國Thermo Fisher公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

RET磁力攪拌器 德國IKA公司；FE20K pH酸度計美國貝克曼庫爾特公司；Allegra64R高速冷凍離心機瑞士梅特勒-托利多公司；熒光酶標儀 美國Spectra MAX Gemini公司；Stirred Cell 8010超濾裝置 美國Millipore公司；真空冷凍干燥機 德國Christ公司；高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜儀（high performance liquid chromatography quadrupole-time-of-flight tandem mass spectrometry，HPLC/Q-TOF-MS/MS）（配有光電二極管矩陣檢測器和TOF檢測器） 美國SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 南瓜籽蛋白的水解及水解物的膜分離

參考Chen Wenye等的方法，采用堿溶酸沉法提取南瓜籽分離蛋白（pumpkin seed protein isolate，PPI）[8]。將PPI溶于蒸餾水至終質量濃度5 g/100 mL，以1 mol/L NaOH溶液調pH值至8.0，水浴攪拌加熱至50 ℃并保溫，添加堿性蛋白酶（添加量為4%，以PPI質量計）消化4 h，酶解過程以1 mol/L NaOH溶液維持pH值不變，每10 min記錄消耗NaOH的體積，用以計算水解度；水解反應結束后，以2 mol/L HCl溶液調節pH值至4.5，并將反應容器沸水浴加熱10 min，冷卻至室溫，8 000×g離心20 min，上清液即為南瓜籽蛋白水解物（pumpkin seed protein hydrolysate，PPH），部分PPH以截留分子質量100 Da透析膜透析后凍干，部分PPH依次通過截留分子質量1、3、5、10 kDa的超濾膜，透過液透析后凍干，于－20 ℃下貯存備用。

1.3.2 水解度的測定

采用pH-stat法[9]測定南瓜籽蛋白水解過程中的水解度，并根據公式（1）計算。

式中：c為NaOH溶液的濃度/（mol/L）；V為NaOH溶液的體積/mL；m為蛋白質的質量/g；α為水解時α-NH2的平均離解度（對南瓜籽蛋白，1/α取值為1）；htot為水解度常數（對南瓜籽蛋白，htot取值為8 mmol/g）。

1.3.3 ACE抑制活性的測定

根據Yang Yijie等的方法測定樣品的ACE抑制活性[10]。配制80 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 8.2，含有300 mmol/L的NaCl），用于溶解樣品、FAPGG（1 mmol/L）、ACE（100 U/L），96 孔板依次加入40 μL樣品、50 μL底物FAPGG、10 μL ACE，以磷酸鹽緩沖液為空白對照，置于37 ℃恒溫振蕩5 min后，30 min內每隔2 min測定340 nm波長處的吸光度，根據公式（2）計算ACE抑制率。

式中：v樣品為樣品的ACE酶促反應速率/min－1；v空白對照為空白對照的ACE酶促反應速率/min－1。

1.3.4 體內降血壓活性評價

參照羅鵬等的方法[11]，將體質量270～320 g雄性SHRs隨機分組（每組5 只），分別灌胃1 mL生理鹽水（空白對照組）、卡托普利（10 mg/kgmb）、PPH（大于100 Da的PPH樣品，后同）及低于1 kDa PPH組分（100 mg/kgmb）、合成南瓜籽肽（30 mg/kgmb），卡托普利和實驗樣品均溶于生理鹽水。采用夾尾法測量SHRs的收縮壓和舒張壓，結果以灌胃前后2、4、6、8、24 h SHRs血壓差表示。

1.3.5 肽的結構鑒定

采用LC-MS/MS鑒定低于1 kDa PPH組分中多肽組成。LC條件：色譜柱C18（4.6 mm×250 mm）；流動相A為水，流動相B為乙腈（含有體積分數0.1%甲酸），進樣體積10 μL，流速0.5 mL/min，流動相B 5%～95%梯度洗脫，洗脫時間20 min。MS條件：電噴霧離子源、碰撞能量35 V、錐孔電壓40 V。利用PEAKS Studio軟件分析活性肽序列并對比數據庫（UniProt）予以確認。經MS鑒定的南瓜籽肽于南京杰肽生物科技有限公司合成，純度達到98%。

1.3.6 酶的抑制動力學分析

參考He Rong等的方法分析南瓜籽肽的ACE抑制動力學[12]。抑制ACE的底物（FAPGG）濃度分別配制為0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L。按照1.3.3節方法進行反應。根據酶促反應速率（1/v）與底物濃度（1/[S]）的倒數作Lineweaver-Burk雙倒數圖，確定南瓜籽肽的ACE抑制模式，根據圖形y軸和x軸的截距分別計算抑制參數（最大酶促反應速率vmax和米氏常數Km）。

1.3.7 分子對接

參考管驍等的方法[13]以Protein Data Bank數據庫1O8A晶體結構為本研究的ACE受體，采用Chemdraw軟件繪制南瓜籽肽MLPL、RFPLL、LLPGF和LVF的分子結構，利用分子模擬軟件Discovery Studio（DS）中的CHARMm程序將肽分子能量最小化，利用CDDOCK程序對接南瓜籽肽和ACE。分子對接去除1O8A的配體、保留Cl原子和Zn原子，對接活性位點x為41.311、y為33.976、z為46.128，半徑10 ?。選擇DS軟件對接評分最高結果分析結合自由能、氫鍵、疏水基團和帶電基團等指標。

1.4 數據處理與分析

采用GraphPad Prism軟件繪制圖形，采用SAS軟件對數據進行單因素方差分析、Duncan多重比較，以P＜0.05表示差異顯著，每個實驗重復3 次以上。

2 結果與分析

2.1 南瓜籽蛋白的水解及水解物膜分離組分的活性分析

如圖1A所示，南瓜籽蛋白的水解度與水解時間呈正相關，水解開始1 h內水解度增加較快，水解度達到7.99%；60～200 min內水解度增加了2.99%，水解反應速率明顯變慢，4 h后水解度達到11.23%，南瓜籽蛋白在堿性蛋白酶的作用下充分釋放了其中的活性肽。不同蛋白質的水解度與蛋白的種類及結構有關，例如，張齊等采用堿性蛋白酶制備文冠果蛋白酶解肽，水解度高達18.21%[14]，顯著高于本實驗中南瓜籽蛋白的水解度；而原洪等采用堿性蛋白酶制備花椒籽蛋白酶解肽，水解度則僅為7.23%[15]。

由圖1B可知，1 mg/mL質量濃度下，PPH ACE抑制活性也因水解物分子質量的不同而有所差別。PPH和低于1 kDa肽組分的ACE抑制活性較高，二者ACE抑制活性沒有顯著性差異（P＞0.05），分別為46.81%和46.22%；除3～5 kDa組分外，ACE抑制活性隨著PPH分子質量的增大而逐漸降低，5～10 kDa組分ACE抑制活性最低，抑制率為33.74%。綜上可知，低分子質量的南瓜籽多肽具有較高的ACE抑制活性，Zou Zhipeng等研究麥麩蛋白水解物時也發現低于1 kDa麥麩蛋白水解物組分的ACE抑制活性顯著高于麥麩蛋白水解物[16]。

PPH的降血壓活性如圖1C所示，SHRs灌胃PPH（100 mg/kgmb）后，PPH及低于1 kDa PPH組分在灌胃4 h時表現出了相似的降血壓效果，均降低SHRs收縮壓約14.80 mm Hg，而低于1 kDa PPH組分在灌胃6 h時表現出了最好的降血壓效果，降低SHRs的收縮壓約21.42 mm Hg，低于1 kDa PPH組分的降血壓活性優于PPH；低于1 kDa PPH組分雖然表現出持續的降血壓效果，但是仍差于降血壓藥物卡托普利。與其他相關研究相比，PPH表現出適中的降血壓效果，Chay等研究發現蠶豆籽水解物在300 mg/kgmb的劑量下灌胃4 h后的降壓效果最好，約降低SHRs血壓19.3 mm Hg[17]；鄒智鵬等研究發現小米蛋白水解物低于1 kDa組分（100 mg/kgmb）灌胃6 h后約降低SHRs的收縮壓37.8 mm Hg[18]。

圖1 南瓜籽蛋白的水解及水解物膜分離組分的活性Fig. 1 Hydrolysis of pumpkin seed protein and the activity of membrane ultrafiltration fractions from pumpkin seed protein hydrolysate

2.2 南瓜籽蛋白肽結構鑒定

由上述研究結果可知，低于1 kDa PPH組分具有較好的生物活性，為了確定可能引起活性的肽段結構，采用HPLC/Q-TOF-MS/MS鑒定了低于1 kDa PPH組分中南瓜籽蛋白肽組成。在獲得低于1 kDa PPH組分的總離子流色譜圖和一級質譜圖（圖2）的基礎上，利用PEAKS Studio軟件分析并比對UniProt數據庫，從低于1 kDa PPH組分中鑒定出了9 種多肽，分別是Leu-Leu-Val（LLV）、Leu-Val-Phe（LVF）、Leu-Thr-Pro-Leu（LTPL）、Ser-Val-Leu-Phe（SVLF）、Leu-Leu-Pro-Gln（LLPQ）、Met-Leu-Pro-Leu（MLPL）、Leu-Leu-Pro-Gly-Phe（LLPGF）、Val-Leu-Leu-Pro-Glu（VLLPE）、Arg-Phe-Pro-Leu-Leu（RFPLL）。此外，通過嘗試檢索生物活性肽數據庫發現所鑒定的9 種南瓜籽肽均未出現在這些ACE抑制肽或者降血壓肽數據中，僅發現了類似的降血壓肽序列，如LLY、LVY、LVE、LLP、LLF等（檢索數據庫：http://bis.zju.edu.cn/biopepdbr/index.php、http://pepbank.mgh.harvard.edu、http://www.nipgr.ac.in/PlantPepDB/），說明本研究從PPH發現了新的ACE抑制肽。

圖2 南瓜籽蛋白低于1 kDa組分的總離子流色譜圖（A）和一級質譜圖（B）Fig. 2 Total ion current chromatogram (A) and primary mass (B)spectrum of fractions with molecular mass less than 1 kDa from pumpkin seed protein hydrolysate

2.3 南瓜籽肽的ACE抑制活性及降血壓活性

如圖3A所示，9 種多肽RFPLL、VLLPE、LLPGF、MLPL、LLPQ、SVLF、LTPL、LVF、LLV的ACE半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為0.94、16.57、0.48、0.36、5.32、7.11、5.07、0.17、3.16 mmol/L，其中LLPGF、MLPL、LVF和RFPLL的IC50均低于1 mmol/L，具有較高的ACE抑制活性。多肽的生物活性與其序列和氨基酸組成有著顯著的相關性，N端和C端含有疏水性和芳香族氨基酸殘基以及含有Arg、Pro的活性肽具有較好的ACE抑制活性[19-20]，南瓜籽蛋白肽N端和C端含有Phe、Leu和Val等疏水性氨基酸，因此具備了較好的ACE抑制活性。此外，肽鏈的長短對ACE抑制活性也有一定的影響，例如，Zhang Peng等從小麥面筋蛋白水解物中分離得到高活性ACE抑制肽SAGGYIW和APATPSFW，其IC50分別為0.002 mg/mL和0.036 mg/mL[21]；Bhaskar等從馬豆粉中分離出ACE抑制肽TVGMTAKF和QLLLQQ，其IC50分別為30.3 μmol/L和75.0 μmol/L[22]，這些ACE抑制肽都具有較長的肽鏈以及特殊的氨基酸組成。

此外，進一步評價了ACE抑制活性較好的南瓜籽肽LLPGF、MLPL、LVF和RFPLL的降血壓活性（圖3B、C）。總體看來，RFPLL具有較好的降血壓活性，灌胃SHRs 6 h后使其收縮壓降低37.0 mm Hg、舒張壓降低17.0 mm Hg；其次是LVF，灌胃SHRs 6 h后使其收縮壓降低22.2 mm Hg、舒張壓降低11.2 mm Hg；而LLPGF和MLPL的降血壓活性相對較差；RFPLL和LVF灌胃SHRs 24 h后仍然具有一定的降血壓活性，并且在測試的劑量下RFPLL與卡托普利降血壓效果較為接近，說明從南瓜籽蛋白中獲得了效果較好的降血壓肽。另一方面，體外ACE抑制活性與降血壓活性存在一定的差異，ACE抑制活性相對較差的RFPLL卻表現出了較好的降血壓活性，類似的情況也有相關報道，如He Rong等從菜籽蛋白中分離得到ACE抑制活性相當的TF、RALP，30 mg/kg劑量下RALP降低SHRs血壓效果（16 mm Hg）明顯優于TF[23]，Yang Yijie等進一步研究發現RALP在代謝過程中發生降解，產生了活性更高的肽段ALP、LP和RA[10]，本研究所獲得ACE抑制肽RFPLL也可能發生了類似的代謝降解。

圖3 南瓜籽肽的ACE抑制活性及降血壓活性Fig. 3 ACE inhibitory and antihypertensive activity of pumpkin seed peptides

2.4 南瓜籽肽抑制ACE的動力學分析

采用Lineweaver-Burk雙倒數圖探討南瓜籽肽RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF抑制ACE的動力學模式。由圖4可知，RFPLL是ACE混合型抑制劑，低濃度下（0.5 mmol/L）RFPLL對ACE是競爭性抑制，較高濃度（1 mmol/L）表現出了非競爭抑制作用；MLPL的雙倒數直線近似相交于y軸，說明其對ACE的抑制模式可能是競爭性抑制，而LLPGF、LVF可能是非競爭性抑制類型。綜上，RFPLL通過與FAPGG競爭性結合ACE或者形成RFPLL-ACE-FAPGG復合物而降低ACE活性；MLPL可能主要通過與ACE的活性位點直接結合來抑制ACE活性；LLPGF和LVF通過與ACE-FAPGG復合物結合，改變ACE的空間構像而降低ACE活性。Ma Feifei等從銀杏蛋白中分離得到1個ACE非競爭性抑制肽TNLDWY和2個競爭性抑制肽RADFY、RVFDGAV[24]。

圖4 南瓜籽肽抑制ACE動力學雙倒數圖Fig. 4 Lineweaver-Burk plots for ACE inhibitory kinetics of pumpkin seed peptides

2.5 南瓜籽肽與ACE的分子對接

體細胞ACE分子C端活性中心含有3個活性位點S1（Y523、E384）、S1’（E162、D377）和S2’（Y520、K511、H513、H353、A354）和1個三聯體催化部位（His383、His387、Glu411與Zn2+配位結合）[25-26]。南瓜籽肽與ACE的分子對接結果如圖5所示，RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF均能夠較好地對接于ACE的活性中心殘基，其中，RFPLL與ACE的殘基Tyr523、Glu162、Asp377之間形成3個氫鍵，并通過O31、O28螯合Zn2+，獲得了較低的靜電勢能－231.64 kJ/mol，說明RFPLL能夠通過結合ACE活性位點S1、S1’及三聯體催化部位發揮抑制活性；小分子肽LVF與ACE的5個殘基His353、Ala354、Tyr520、Lys511、Gln281之間形成9個氫鍵，并且O2與Zn2+的距離僅有2.78 ?，也說明了LVF能夠通過結合ACE活性位點S2’及三聯體催化部位發揮抑制活性；LLPGF和WLPL分別與ACE的氨基酸殘基之間形成5個和7個氫鍵，但是結合勢能相對較高，分別為－112.99 kJ/mol和－80.00 kJ/mol。分子對接模擬進一步說明4個南瓜籽肽具有ACE抑制活性。類似地，有研究表明乳清蛋白肽IIAE、LIVTQ、LVYPFP通過與ACE活性中心殘基Gln259、His331、Thr358之間形成了較強的氫鍵從而表現出ACE抑制活性[27]；此外，3D藥效團模擬分析結果表明活性肽與ACE活性中心殘基Trp279、Gln281、His353、Ala354、Ser355、Ala356、His383、Glu384、Glu411、Asp415、Lys454、Phe457、Lys511、His513、Tyr520、Tyr523形成氫鍵，氫鍵可以很好地抑制ACE活性[28]。

圖5 南瓜籽肽與ACE的分子對接Fig. 5 Molecular docking of pumpkin seed peptides to the ACE active sites

3 結 論

本實驗采用堿性蛋白酶水解南瓜籽蛋白，經膜分離和質譜鑒定技術獲得高活性南瓜籽肽氨基酸序列，同時分析了南瓜籽肽的降血壓活性和ACE抑制機制，結果表明：1）低于1 kDa PPH組分具有較高降血壓活性，灌胃6 h后可以降低SHRs的收縮壓約21.42 mm Hg；2）南瓜籽肽RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF具有較好的ACE抑制活性，IC50均低于1 mmol/L，其中RFPLL和LVF具有較好的降血壓活性，灌胃6 h后分別使SHRs的收縮壓降低37.0 mm Hg和22.2 mm Hg、使SHRs的舒張壓降低約17.0 mm Hg和11.2 mm Hg；3）RFPLL、LLPGF、MLPL和LVF可以很好地對接ACE的活性中心，RFPLL是ACE混合型抑制劑，MLPL對ACE是抑制模式可能是競爭性抑制，LLPGF、LVF可能是ACE的非競爭性抑制劑。綜上，低于1 kDa PPH是一種良好的降血壓功能食品原料，而RFPLL和LVF可用于降血壓功能食品或者藥品的開發原料。