褪黑素處理對香菇采后品質及活性氧代謝的影響

賈 樂，韓延超，房祥軍，陳杭君，郜海燕

（浙江省農業科學院食品科學研究所，農業農村部果品產后處理重點實驗室，浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室，中國輕工業果蔬保鮮與加工重點實驗室，浙江 杭州 310021）

香菇（Lentinula edodes）是世界第二大食用菌，因其含有豐富的膳食纖維、維生素、礦物質等，具有獨特的風味和口感，同時還具有降低血糖、血脂水平[1]、抗腫瘤[2]等功能。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是植物體在進行正常生理代謝時產生的一系列性質活潑的含氧物質的總稱，在整個貯藏期間，香菇會不斷產生ROS，但在貯藏前期，由于一系列ROS清除酶活性較強，過多的ROS會被清除，ROS代謝平衡得以維持；貯藏后期隨著香菇的衰老及外界不良環境的脅迫，這一代謝平衡被破壞，ROS代謝失衡會加速細胞膜脂過氧化進程，導致有毒代謝產物丙二醛（malondialdehyde，MDA）積累，細胞膜透性升高，進而加速采后衰老進程，縮短香菇壽命，這給生產和貯運造成很大的損失。因此，迫切需要找到安全有效的方法，最大限度地降低香菇貯藏期間ROS的積累、減少營養物質的損失，從而有效延長香菇的貯藏期。褪黑素（melatonin，MT）是一種普遍存在于動植物體內的一類小分子激素，具有多種細胞活性和生理活性，它在人類、動物和植物的生長發育中發揮重要功能。近年研究表明，MT具有調節植物生長、延緩葉片衰老、影響果實成熟和貯藏等作用[3-4]。MT作為一種安全的吲哚胺分子，不僅可以作為內源誘導分子和信號分子來緩解生物和非生物脅迫，還具有直接的抗氧化活性[5]，MT通過激活機體抗氧化系統，直接清除ROS，提高抗氧化物質的活性[6]，延長果蔬采后壽命[7]。研究表明，外源MT處理可以延緩香蕉采后成熟[8]；延緩黃瓜采后貯藏過程中抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）和可溶性蛋白含量的下降[9]；通過增強抗氧化酶活性和抑制細胞膜脂過氧化程度，有效維持桃果實感官和營養品質，提高桃果實的耐冷性，延長桃的保質期[10-12]；MT處理還可促進草莓果實中苯酚和花色苷的積累，維持草莓采后果實品質，降低草莓采后腐爛率[13]；蛋白質組學分析表明，MT處理可以調控番茄采后的成熟和衰老，衰老相關蛋白的表達經MT處理后發生下調表達，細胞凋亡抑制相關蛋白經MT處理后發生上調表達[14]；在木薯上的研究也證明了MT處理通過提高超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，降低H2O2積累，從而延遲木薯根采后生理變質[15]。這些研究表明，MT作為一種新型、天然、安全的保鮮劑，能夠有效提高果蔬的抗氧化能力，維持果蔬的采后品質，具有較好的應用前景。然而，將MT應用于香菇的保鮮研究鮮有報道。本實驗通過研究外源MT噴淋處理對香菇貯藏過程中品質變化及活性氧代謝的影響，旨在明確MT對香菇采后保鮮的作用及相關生理機制，為鮮香菇采后貯藏產業應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮香菇（品種‘901’）購于浙江武義創新食用菌有限公司，挑選大小均一、無開傘、沒有病害和機械損傷的完整菌菇。

MT 上海源葉生物有限公司；三氯乙酸、福林-酚、甲醛，硫代巴比妥酸（分析純）、鄰菲羅琳、AsA、鹽酸羥胺、三氯化鐵、H2O2、氫氧化鈉 上海凌峰化學試劑有限公司；羥自由基測定試劑盒、羰基化蛋白試劑盒 南京建成生物有限公司。

1.2 儀器與設備

TA.XT plus型物性測定質構儀 英國SMS公司；Hitachi H7650型透射電子顯微鏡 日本日立公司；UV-9000紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；Spectra-MAX-M2多功能酶標儀 瑞士TECAN公司；Fresco17型高速冷凍離心機 美國賽默飛世爾公司；DDS-307A型電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司；CR-400手持色差儀 日本柯尼卡美能達公司。

1.3 方法

1.3.1 香菇樣品處理

清除香菇基部栽培基質，隨機分成4 組，每組處理量1.0 kg，3個重復，分別使用清水（對照組）、0.25、0.50、0.75 mmol/L的MT溶液均勻噴灑于香菇表面，每1 kg香菇固定噴灑50 mL MT溶液，置于通風處使香菇表面水分完全蒸發，用聚乙烯包裝袋進行分裝。將分裝好的香菇放置于（4±1）℃恒溫箱中貯藏，取樣間隔為7 d，每次將取得的樣品用液氮速凍后放入－50 ℃冰箱，取樣完成后，進行各項指標的測定，結果取其平均值。

1.3.2 香菇相關指標的測定

1.3.2.1 開傘度和色澤的測定

用游標卡尺對香菇的開傘度進行測定。將香菇卷邊內緣的距離（L0）與外緣距離（L1）的比例作為開傘度值，最大開傘度記為1，每組處理隨機測定10個香菇，結果取其平均值[16]。色澤測定參考Ganjloo等[17]的方法并加以修改，用手持色差計測定。每組隨機選取10個香菇對香菇菌蓋進行測定，記錄色差儀上的L*、a*、b*值，最終結果取其平均值。按式（1）計算褐變指數。

1.3.2.2 硬度與呼吸強度的測定

參考文獻[18]的方法并略作修改，選取P/6型不銹鋼探頭，直徑為56 mm，下壓距離5.0 mm，測前速率2.0 mm/s，測定速率1.0 mm/s，測后速率2.0 mm/s，以最大破裂的力作為硬度，每次隨機選取10個香菇進行測定，最終結果取其平均值，單位為kg/cm2。呼吸強度采用堿液吸收法[19]進行測定，單位為mg/（kg·h）。

1.3.2.3 AsA、總酚含量及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力的測定

AsA含量的測定參考文獻[20]并稍作修改。稱取1.0 g香菇研磨樣品，加入體積分數5%的三氯乙酸溶液5.0 mL，振蕩混勻，10 000 r/min離心20 min取上清液。吸取0.5 mL上清液于試管中，依次加入1.5 mL三氯乙酸、1.0 mL無水乙醇、0.5 mL 0.5%磷酸-乙醇溶液、1.0 mL 0.5%鄰菲羅啉-乙醇溶液、0.5 mL 0.03%三氯化鐵-乙醇溶液，30℃水浴60 min，以加入蒸餾水代替鄰菲羅啉-乙醇溶液的試管為參照，534 nm波長處測定吸光度，根據標準曲線方程計算AsA含量，結果以mg/100 g表示。

總酚含量的測定采用福林-酚法[21]。稱取0.25 g香菇研磨樣品于離心管中，加入1.25 mL乙醇溶液（體積分數60%），浸提2 h后于10 000r/min離心20 min，取0.2 mL上清液進行測定，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，計算樣品中的總酚含量，單位為mg/g。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的測定：稱取0.25 g香菇研磨樣品于離心管中，加入1.25 mL無水乙醇，1 200 r/min離心30 min，取0.1 mL上清液（樣品組），加入2.9 mL的DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L），以等量蒸餾水作為空白組，混勻后避光反應30 min，以加入2.9 mL無水乙醇為對照組，分別測定各組在517 nm處的吸光度，按式（2）計算DPPH自由基清除能力。

式中：A0表示空白組在517 nm處的吸光度；A1表示樣品組在517 nm處的吸光度；A2表示對照組在517 nm處的吸光度。

1.3.2.4 超氧陰離子自由基產生速率與H2O2含量的測定

超氧陰離子自由基產生速率的測定參考Li Xiaoan等[22]的方法，以KNO2為標準品繪制標準曲線，計算樣品中超氧陰離子產生速率，單位為μmol/（min·g）。H2O2含量的測定參考文獻[19]的方法，單位為μmol/g。

1.3.2.5 細胞膜透性及丙二醛含量的測定

細胞膜透性測定參考Luo Yaguang等[23]的方法并稍作修改，分別從香菇的中心和四周隨機切取約1 g的香菇片（厚度1 mm），放入50 mL離心管中，加水定容至50 mL。室溫下靜置10 min后用電導率儀測定電導率，記為R1/（μS/cm），隨后沸水浴5 min，自然冷卻至冷卻至室溫后再次測其電導率，記為R2/（μS/cm），根據公式（3）計算相對電導率（relative electric conductivity，REC），用REC表示細胞膜透性。

MDA含量測定采用硫代巴比妥酸比色法，具體方法參考文獻[24]并略作修改，取0.25 g香菇研磨樣加入1.5 mL 100 g/L的三氯乙酸溶液，混勻后在4 ℃下10 000 r/mim離心20 min后得上清液，取0.75 mL上清液加入等體積0.67%（質量分數）硫代巴比妥酸溶液，混勻后沸水浴20 min，取出冷卻后離心，分別用酶標儀測定其在450、532、600 nm處的吸光度，根據式（4）計算待測液中MDA濃度（c），根據式（5）計算香菇中MDA含量。

1.3.2.6 羥自由基生成能力及羰基化蛋白質量濃度的測定

取0.2 g香菇研磨樣于離心管中，加入1.8 mL生理鹽水，4 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上清液采用羥自由基測試盒測定羥自由基生成能力，單位為U/mL。羰基化蛋白質量濃度取上清液后采用羰基化蛋白試劑盒測定，單位為ng/mL。

1.3.2.7 線粒體超微結構觀察

參照趙天鵬[25]的方法略作修改，用戊二醛固定液固定香菇（新鮮香菇、貯藏28 d MT處理組、貯藏28 d對照組）組織，然后進行漂洗，完成后進行梯度脫水和滲透，之后用包埋劑處理，并在烘箱中保溫聚合48 h，用超薄切片機對香菇組織進行切片（70 nm厚），然后用撈樣環將切片圈起來，用濾紙蘸取氯仿在撈樣環上方劃過，進行熏蒸，熏蒸后置于銅網上，用2%的醋酸雙氧鈾染色10～15 min，漂洗后再用含有氫氧化鈉的檸檬酸鉛染色10～15 min，選擇30 000×放大倍數，觀察香菇細胞及線粒體的完整性。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2010軟件對數據進行整理，利用SPSS軟件，采用Duncan法對數據進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。采用GraphPad Prism 8軟件進行數據處理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 MT處理對香菇采后褐變度與亮度的影響

香菇的褐變程度可用褐變指數表示，L*值代表香菇的亮度。如圖1A所示，在整個貯藏期間，香菇褐變指數不斷上升，對照組褐變指數始終高于MT處理組。香菇L*值呈下降趨勢，即香菇亮度不斷下降，如圖1B所示，與其他處理組相比，0.50 mmol/L MT處理組L*值下降最為緩慢，在貯藏至第42天時，0.25、0.50、0.75 mmol/L MT處理組的L*值分別是對照組1.61、1.87、1.60 倍，說明MT處理可以抑制香菇褐變，其中0.50 mmol/L MT處理可維持香菇較高的亮度。

圖1 MT處理對香菇褐變度（A）與L*（B）的影響Fig. 1 Effect of melatonin treatment on the browning degree (A) and L* value (B) of shiitake mushrooms

2.2 MT處理對香菇采后硬度與開傘度的影響

硬度是反映香菇品質較為直觀的指標之一，隨著貯藏時間的延長，各組香菇硬度均呈下降趨勢，由圖2A可知，在貯藏前期，不同濃度MT處理后的香菇硬度與對照組無顯著性差異，在貯藏中后期各不同濃度MT處理后的香菇硬度的維持情況比對照組要好。在貯藏至21 d時，對照組的硬度（3.04 kg/cm2）顯著低于0.50 mmol/L MT處理組（6.44 kg/cm2）。香菇的開傘度可以反映香菇的衰老程度，由圖2B可知，香菇開傘度在貯藏期間不斷增加，在貯藏前期，對照組與各不同濃度MT處理后的香菇無顯著性差異，貯藏21 d后，處理組與對照組之間的差異逐漸顯現，其中以0.50 mmol/L MT處理組開傘度最低。因此，通過一定濃度的MT處理可以有效保持香菇的硬度并抑制其開傘。

圖2 MT處理對香菇硬度（A）及開傘度（B）的影響Fig. 2 Effect of melatonin treatment on the hardness (A) and cap opening (B) of shiitake mushrooms

由以上實驗結果可知，在香菇的采后貯藏過程中，MT處理能夠有效維持香菇表觀品質劣變，其中以0.50 mmol/L MT處理效果最為顯著，因此，以下對實驗均以0.5 mmol/L MT處理組與對照組進行比較。

2.3 MT處理對香菇采后呼吸強度的影響

香菇采后呼吸強度是反映其生命活動強弱的重要指標，與生物體內其他生命活動也密切相關。由圖3可知，在整個貯藏期間，香菇呼吸強度在貯藏過程中各組之間整體變化趨勢一致，前期呈先下降后上升的趨勢，出現呼吸高峰后再下降，在貯藏結束時，呼吸強度又上升，前期呼吸強度下降可能由于香菇貯藏溫度的改變（從常溫到低溫）導致，貯藏末期呼吸速強度高可能是由于子實體受外界微生物侵染，腐爛后釋放出CO2，使測定的呼吸速率上升。其中0.50 mmol/L MT處理組始終保持在最低水平。貯藏42 d時，處理組香菇的呼吸強度與對照組相比降低了44%。

2.4 MT處理對香菇H2O2含量、超氧陰離子生成速率與羥自由基生成能力的影響

H2O2與超氧陰離子都是細胞內ROS的存在形式，過度積累會對細胞造成不可逆的損傷，羥自由基是細胞內ROS的重要組成部分，羥自由基生成能力在一定程度上反映了細胞內ROS代謝強弱，在貯藏期間，香菇細胞內的H2O2含量與超氧陰離子產生速率及羥自由基生成能力均呈上升趨勢。如圖4A所示，整個貯藏期間對照組的H2O2含量始終高于MT處理組，貯藏后期，對照組H2O2含量上升速率明顯高于0.50 mmol/L MT處理組，貯藏結束時，對照組H2O2含量為0.26 μmol/g，是MT處理組的1.44 倍。由圖4B可知，對照組超氧陰離子生成速率持續上升，直至貯藏結束達到最高值2.37 mol/（min·g），而MT處理組的超氧陰離子生成速率只在貯藏前期有較明顯的升高，之后便一直保持在較低的水平，在貯藏前期（0～14 d），MT處理組與對照組之間差異不顯著（P＞0.05），貯藏14 d之后，MT處理組與對照組之間差異明顯，在貯藏結束時，處理組香菇的超氧陰離子的生成速率與對照組相比分別降低了39.1%。由圖4C可知，在整個貯藏期間，羥自由基生成能力持續上升，貯藏末期，對照組羥自由基生成能力達到7.16 U/mL，比MT處理組高了32%，且兩者差異極顯著（P＜0.01）。以上說明說明MT處理組可有效緩解香菇體內H2O2含量的積累，抑制香菇細胞的超氧陰離子生成速率和羥自由基生成能力，從而減緩ROS對細胞的傷害。

圖4 MT處理對香菇H2O2（A）、超氧陰離子生成速率（B）及羥自由基生成能力（C）的影響Fig. 4 Effect of melatonin treatment on H2O2 content (A),superoxide anion generation rate (B) and hydroxyl radical generation capacity (C) in mushrooms

2.5 褪黑素處理對香菇細胞膜透性、MDA含量及羰基化蛋白質量濃度的影響

細胞膜的完整性可以反映細胞膜的受損程度，而細胞膜完整性可以通過測定組織的水浸提液的電導率來反映[26]。由圖5A可知，在貯藏前期，香菇細胞的REC變化趨勢較為平緩，0.50 mmol/L MT處理組與對照組之間沒有顯著差異，貯藏28 d后，對照組香菇REC急劇上升，在貯藏35 d達到峰值70.3%，而貯藏35 d的0.50 mmol/L MT處理組REC僅為33.7%，上升緩慢，在貯藏末期時，MT處理組REC極顯著低于對照組。說明經MT處理的香菇在貯藏期間細胞膜透性變化較小，可以較好地保持細胞膜完整性。MDA是細胞膜脂氧化產物，由圖5B可知，在整個貯藏期間，各組MDA含量變化趨勢較為一致，0.50 mmol/L MT處理組MDA含量始終顯著或極顯著低于對照組（P＜0.05、P＜0.01）。以上結果說明，0.50 mmol/L MT處理可有效保持香菇細胞膜的完整性，減少細胞電解質外泄，抑制膜脂過氧化，從而延長貯藏時間。羰基化蛋白是ROS介導的蛋白質氧化損傷產物，其含量可用來反映細胞的氧化損傷程度。由圖5C可知，羰基化蛋白質量濃度在貯藏前期急劇上升，貯藏中后期變化趨勢較為平緩，在整個貯藏期間，對照組的羰基化蛋白質量濃度始終高于MT處理組，說明MT處理可有效降低香菇細胞內蛋白氧化損傷程度。

圖5 MT處理對香菇REC（A）、MDA含量（B）及羰基化蛋白質量濃度（C）的影響Fig. 5 Effect of melatonin treatment on the relative conductivity (A),MDA (B) content and carbonylated protein content (C) of shiitake mushrooms

2.6 褪黑素處理對香菇AsA與總酚含量及DPPH自由基清除能力的影響

AsA與總酚與香菇的抗氧化性密切相關[27]。由圖6A可知，香菇AsA含量在貯藏期間呈現先下降后上升的趨勢，貯藏前期AsA含量下降可能與子實體品質劣變相關，后期AsA含量上升可能與菇體失水有關[28]。在整個貯藏期間，對照組AsA含量始終低于MT處理組。如圖6B所示，在貯藏前期，由于香菇采后的生長發育，各組香菇中總酚含量呈上升趨勢，隨后各組的總酚含量又開始下降，貯藏第42天時，0.50 mmol/L MT處理組總酚含量較對照組提高了1.37 倍。DPPH自由基清除能力可以較為直觀地展現香菇的抗氧化能力，自由基清除率越高，表明果實的抗氧化能力越強。由圖6C可知，整個貯藏期間，處理組與對照組的DPPH自由基清除能力均呈現下降趨勢，MT處理組下降趨勢較為緩慢，在貯藏第35天時，MT處理組DPPH自由基清除能力是對照組的1.17 倍，且直到貯藏結束，MT處理組DPPH自由基清除能力始終高于對照組。

圖6 MT處理對香菇AsA含量（A）和總酚含量（B）及DPPH自由基清除力能力（C）的影響Fig. 6 Effect of melatonin treatment on the contents of ascorbic acid (A)and total phenols (B) and DPPH radical scavenging capacity (C) in shiitake mushrooms

2.7 細胞壁及線粒體超微結構觀察結果

線粒體呼吸鏈上的電子泄漏是機體內ROS的主要來源[29]，因此線粒體形態與香菇ROS代謝之間關系密切。由圖7A可知，新鮮香菇線粒體形態飽滿，呈橢圓形，結構清晰，基質豐富，雙層膜結構完整，無破損現象，細胞壁邊界清晰。貯藏28 d后，對照組線粒體降解，線粒體膜損傷，內部基質降解成絮狀物質，細胞壁完全降解（圖7B）；而MT處理組細胞壁雖發生降解，但其結構仍能觀察到，線粒體結構完整，內容物無滲出現象（圖7C)，說明MT處理可有效維持香菇線粒體結構的完整，延緩細胞壁的降解。

圖7 MT處理對貯藏香菇細胞壁及線粒體形態的影響Fig. 7 Effect of melatonin treatment on cell wall and mitochondrial morphology of shiitake mushrooms

3 討 論

香菇采后極易失水、腐爛、變質，嚴重影響其商品價值和食用品質。MT作為一種無毒無害的新型保鮮劑，現已成為果蔬采后保鮮領域的研究熱點?；钚匝踔饕诠夂献饔门c呼吸作用的電子傳遞鏈傳遞過程中產生，因香菇中沒有葉綠體，故香菇中ROS主要在線粒體中產生。目前已知線粒體呼吸鏈上的電子泄露是機體內ROS的主要來源[30]。采后ROS在果蔬體內的主要存在形式為羥自由基、超氧陰離子、H2O2等[31]。旺盛的呼吸作用會消耗大量的營養物質，釋放呼吸熱與水分，造成高溫高濕的環境，加速采后香菇品質的劣變。本研究發現，MT處理可以有效降低貯藏期間香菇的呼吸強度，延緩香菇子實體硬度和色澤的下降，降低香菇的開傘度，維持香菇的表觀品質，0.50 mmol/L MT處理組效果最為顯著；然而，辛丹丹等[32]研究表明，以0.10 mmol/L MT處理，能顯著延緩黃瓜品質和抗氧化能力的下降，不同種類果蔬的MT有效處理濃度和方式存在不同，這可能是作用對象與作用方式（浸漬與噴淋）不同。MT處理還能減少細胞內H2O2含量的積累，降低超氧陰離子自由基產生速率及羥自由基生成能力，通過降低活性氧代謝產物的生成速率減輕活性氧對細胞造成的傷害。黃鴻暉等[33]研究發現，MT處理可有效抑制草莓的H2O2積累及降低超氧陰離子生成速率，與本研究結果一致。ROS的積累可促進采后果實的衰老，加速膜脂過氧化進程與蛋白質氧化程度，導致脫氧核糖核酸鏈的斷裂，影響正常的堿基修飾及基因表達調控[34]?？偡优cAsA在ROS非酶促清除系統中發揮著重要的作用[35]，在整個貯藏期間，MT處理組香菇體內的總酚含量和AsA含量始終高于對照組，在對MT處理大棗[36]和芒果[37]中也得到相同的實驗結果，這可能與MT是一種強抗氧化劑和自由基清除劑有關，可以直接對ROS進行清除[38]。自由基清除能力能直觀反映果蔬的抗氧化能力[39]，MT處理組DPPH自由基清除能力始終顯著高于對照組，MT處理組通過增強自由基的清除能力，減少了細胞內ROS的積累，延緩了膜脂過氧化進程，減少了細胞內有毒物質MDA的產生，維持完整的膜結構，從而維持香菇采后品質。本研究還發現，MT處理可有效抑制香菇體內羰基化蛋白質量濃度的上升，延緩香菇線粒體的降解，維持正常線粒體形態。香菇體內ROS的主要產生部位是線粒體[40]。ROS的積累對線粒體蛋白質造成氧化損傷，導致線粒體各組成部分功能障礙，最終加速衰老[41]。

4 結 論

本實驗結果表明，一定濃度范圍的MT處理對香菇表觀品質的維持具有積極作用，與0.25、0.75 mmol/L MT處理相比，0.50 mmol/L MT處理能更好地維持香菇的硬度、色澤與開傘度等表觀品質，抑制呼吸強度及開傘度。進一步研究發現，0.50 mmol/L MT處理香菇可以有效降低羥自由基生成能力和超氧陰離子自由基產生速率，減少細胞內H2O2、羰基化蛋白及MDA積累，維持細胞膜的完整性，同時能夠延緩其體內總酚和AsA等抗氧化物質含量的下降，提高DPPH自由基清除能力，提高機體的抗氧化能力，超微電子顯微鏡觀察發現MT處理能夠有效維持香菇細胞線粒體的完整性。綜上，0.50 mmol/L MT處理可有效維持香菇貯藏品質，降低ROS代謝對細胞造成的損傷，延長香菇貯藏保鮮時間。