低溫等離子體處理對采后黃花菜活性氧代謝和品質的影響

馬曉艷，王 娟，張海紅，王 通，高 坤

（寧夏大學食品與葡萄酒學院，寧夏 銀川 750021）

黃花菜（daylily），又稱金針菜、忘憂草，為百合科萱草屬，多年生草本植物，兼食用、藥用、觀賞價值于一體，是我國特色蔬菜之一[1-2]。黃花菜營養豐富，含有糖類、蛋白質、維生素及多種人體必需氨基酸[3]，屬菜中珍品。目前，市場上干制是黃花菜主要的貯藏、銷售及食用方式[4]。盡管鮮黃花菜口感清脆、鮮甜味美，但因其易失水，耐貯性差，采后易腐爛變質而影響其商品貨架期[5]。因此，選擇合適的保鮮方式減緩黃花菜采后生理活動，延長其貨架期，已成為了亟待解決的問題。

等離子體被稱為物質的第4種狀態，由游離電子、離子、反應原子、中性分子和光子組成[6]。低溫等離子體技術因其具有可有效殺滅或減少農產品表面的微生物、降解代謝產物和農藥殘留等作用[7-8]，而成為一種新興的非熱食品殺菌技術[9]。低溫等離子體可電離果蔬周圍介質，產生活性氧（reactive oxygen species，ROS）、活性氮、紫外光子、帶電粒子等多種具有反應活性的殺菌物質，作用于微生物細胞的各個部位，蝕刻細胞、引起細胞膜穿孔、大分子氧化，從而造成細胞的破壞或死亡[10]。Misra等[11]研究發現，將草莓經5 min低溫等離子體處理后，背景菌群中的需氧嗜溫菌、酵母和霉菌在處理后的24 h內減少了2（lg（CFU/g）），等離子體處理可有效抑制微生物引起的腐爛變質。

低溫等離子體在處理過程中由于高能粒子和自由電子相互碰撞等因素，會產生大量的ROS[12]，ROS包括H2O2、超氧陰離子、超氧陰離子自由基、羥自由基（hydroxyl free radical，·OH）等[13-14]。盡管ROS對微生物殺菌起到積極的效果，但是能否引起果蔬植物細胞ROS代謝失衡及品質劣變，還有待于進一步探討。通常情況下，采后果蔬在貯藏過程中，通過超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶（peroxidase，POD）等ROS清除酶系統和非酶清除系統可保持ROS代謝動態平衡。然而高溫、重金屬、機械損傷和微生物侵染等逆境脅迫果蔬時，會破壞ROS代謝動態平衡，導致ROS積累過多，產生有毒有害的丙二醛（malondialdehyde，MDA），使細胞膜發生膜脂過氧化，加速細胞的衰老，加快果蔬的腐敗變質[15]。任翠榮等[16]研究發現常壓低溫等離子體處理距離10 mm、電壓為140 V、氣體流速1 L/h處理草莓60 s，貯藏5 d后，與對照組相較，草莓的質量損失率顯著降低，維生素含量顯著高于對照組，草莓的常溫保鮮期延長了2 d；王卓等[17]研究表明利用介質阻擋放電低溫等離子體在45 kV工作電壓下處理‘燦爛’藍莓50 s，藍莓表面細菌和真菌數量分別下降了1.75（lg（CFU/g））和1.77（lg（CFU/g）），與對照組相比，低溫等離子體處理抑制了藍莓的硬度和VC含量的下降，提高了藍莓SOD、CAT、POD等抗氧化酶的活性，促進超氧陰離子自由基的清除，花青素和總酚含量在貯藏初期略有下降，但對總抗氧化能力無顯著影響，同時可提高多酚氧化酶活力，促進藍莓酚類氧化形成醌類，促進木質素合成。

本研究擬利用介質阻擋放電等離子體設備對鮮黃花菜進行處理，探討低溫等離子體處理過程中產生的ROS等活性成分對黃花菜貯藏過程中的ROS代謝平衡以及品質的影響，為低溫等離子體在黃花菜保鮮中的應用、黃花菜保鮮新技術及裝備的開發提供理論依據，以期推動黃花菜產業的發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘大烏嘴’黃花菜采自寧夏吳忠市紅寺堡區太陽山鎮清泉合作社，挑選九成熟、長9～12 cm、單根質量8～10 g、直徑0.8～10.0 mm、無病蟲害、無機械損傷的花蕾。

無菌雙蒸水 北京雷根生物技術有限公司；無水乙醇（分析純） 天津市北聯精細化學品開發有限公司；冰乙酸（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；生理鹽水 山東齊都藥業有限公司；蛋白（total protein，TP）測定試劑盒、總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測定試劑盒、CAT測定試劑盒、POD測定試劑盒、H2O2測定試劑盒、MDA測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

低溫等離子體冷殺菌設備 南京蘇曼科技公司；PQ 001型臺式脈沖核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）分析儀 上海紐邁電子科技有限公司；SQP電子天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；752N紫外-可見分光光度計 上海悅豐儀器儀表有限公司；HH-1數顯恒溫水浴鍋 金壇市江南儀器廠；DDS-307A電導率儀 上海儀點科學儀器股份有限公司；維生素C測定儀 杭州陸恒生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃花菜預處理

選擇聚酯（polyester，PET）保鮮盒對黃花菜進行包裝，使用聚乙烯（polyethylene，PE）進行拉伸裹包，包裝10 盒，每盒50 g，隨機挑選5 盒進行低溫等離子體處理，剩下5 盒為對照樣品。依據前期預實驗結果，設置低溫等離子體處理參數為：放電電壓110 kV、放電頻率110 Hz、處理時間150 s、處理距離7.5 cm。處理后的黃花菜置（4±1）℃下貯藏。貯藏期間每3 d測定黃花菜的可溶性蛋白、H2O2和MDA含量以及ROS清除酶活力等。

1.3.2 抗氧化酶活力的測定

酶液的提取：準確稱取1 g黃花菜組織，按照1∶9（m/V）的比例加入生理鹽水，冰水浴條件下制備成質量分數10%的組織勻漿液，勻漿液在4 ℃條件下3 500 r/min離心10 min，取上清液測定。

POD、SOD、CAT活力均采用試劑盒進行測定，具體操作按照試劑盒說明書進行，結果均以蛋白質量計。

1.3.3 H2O2和MDA含量測定

H2O2和MDA含量的測定均采用試劑盒完成，結果均以蛋白質量計。

1.3.4 相對電導率的測定

相對電導率的測定參照李合生[18]的方法，略作修改。選取黃花菜最外層葉子，剪成1 cm葉片，稱取5.0 g葉片，蒸餾水沖洗后用濾紙吸干水分。將葉片放入燒杯中，加入50 mL蒸餾水后在25 ℃的環境中靜置1 h，測定溶液的電導率（P1/（μS/cm））。將燒杯置于沸水浴中煮沸15 min，取出冷卻至室溫后測定此時的電導率（P2/（μS/cm））。相對電導率按下式計算。重復測定3 次，計算平均值。

1.3.5 可溶性蛋白含量的測定

可溶性蛋白含量的測定基于考馬斯亮藍試劑盒完成。

1.3.6 總可溶性固形物（total soluble solid，TSS）質量分數的測定

取10 g黃花菜搗碎，用兩層紗布過濾，將濾液攪拌均勻，使用手持阿貝折光儀測定TSS質量分數，重復測定3 次，取平均值。

1.3.7 VC含量的測定

取10 g黃花菜，打碎均質后，使用VC測定儀測定VC含量，重復測定3 次，取平均值。

1.3.8 色度a*值測定

參考姚亞明[19]的方法，采用便攜式色差儀對黃花菜每片花瓣表皮中部測定，每個黃花菜測定3 次，重復測定3 次，取平均值。a*表示紅綠度，正值代表紅色，負值代表綠色。

1.3.9 水分分布的測定

利用PQ 001型臺式脈沖核磁共振分析儀進行測定。采用自旋回訊磁振脈沖序列，得到自由誘導指數衰減曲線，對曲線進行反演操作，得到T2圖譜。

1.4 數據處理與分析

各指標均重復測定3 次，數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 26軟件進行數據統計分析，差異顯著性采用鄧肯多重比較檢驗，P＜0.05表示差異顯著，并采用Origin Pro 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 低溫等離子體處理對采后黃花菜ROS清除酶活力的影響

植物體內ROS的含量主要通過活力ROS清除酶和內源抗氧化物質來調節。活力ROS清除酶主要包括SOD、CAT、POD等[20]。

SOD在高等植物的所有部位幾乎都存在，分布于葉綠體、線粒體中，其主要作用是催化植物組織內的超氧陰離子變為H2O2[21]。由圖1可知，隨貯藏時間的延長，SOD活力呈先上升后下降的趨勢，在貯藏3～9 d內，處理組SOD活力一直高于對照組，處理組和對照組均在第9天達到峰值，在貯藏9～15 d內，對照組SOD活力高于處理組，第15天時，處理組SOD活力顯著低于對照組（P＜0.05）。由此可知，貯藏前期，低溫等離子體處理可以誘導黃花菜在SOD活力增加，但二者之間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 低溫等離子體處理對采后黃花菜SOD活力的影響Fig. 1 Effect of cold plasma treatment on SOD activity of postharvest daylily

CAT主要存在于過氧化氫體中，能夠催化H2O2分解為H2O和O2，從而有效消除ROS[22]。由圖2可知，在貯藏0～3 d內，處理組和對照組CAT活力均呈上升趨勢，二者均在第3天出現第一次峰值，此時處理組CAT活力為2.22 U/mg，是對照組的1.91 倍，顯著高于對照組（P＜0.05），在貯藏12 d時，處理組達到第二次峰值，為2.26 U/mg,，是此時對照組的2.97 倍，差異顯著（P＜0.05），第15天，對照組CAT活力顯著大于處理組（P＜0.05）。由此可知，低溫等離子體處理誘導并顯著提高了貯藏期間的黃花菜CAT活力。

圖2 低溫等離子體處理對采后黃花菜CAT活力的影響Fig. 2 Effect of cold plasma treatment on CAT activity of postharvest daylily

由圖3可知，處理組和對照組POD活力0～3 d內均下降，處理組POD活力在第6天達到了峰值，為321 U/mg，是此時對照組的3.56 倍，這可能是為了應對ROS水平的升高，黃花菜組織中的抗氧化機制被觸發，黃花菜處于氧化應激狀態，POD活力增大。對照組POD活力則在貯藏0～12 d內緩慢下降，第15天，略微上升，在貯藏期內，處理組POD活力均高于對照組，且在貯藏第6、9、15天，處理組均顯著高于對照組（P＜0.05）。進一步可知，低溫等離子體處理可提高POD活力，這可能是由于低溫等離子體放電產生的ROS作為信號轉導分子，誘導了黃花菜POD活力的增加。

圖3 低溫等離子體處理對采后黃花菜POD活力的影響Fig. 3 Effect of cold plasma treatment on POD activity of postharvest daylily

2.2 低溫等離子體處理對采后黃花菜H2O2含量的影響

植物細胞正常代謝過程中產生的ROS，包括羥自由基、超氧陰離子和H2O2。濃度較低的H2O2可在植物生長發育過程中作為信號轉導分子起到重要的調控作用[23]。然而，當果蔬植物組織中的H2O2含量超過一定閾值時，H2O2會影響其ROS代謝平衡，從而毒害細胞。由圖4可知，隨貯藏時間的延長，處理組和對照組H2O2含量均呈先上升后下降的趨勢，其中處理組H2O2含量在貯藏期間始終低于對照組，但二者差異不顯著（P＞0.05）。相比對照組，低溫等離子體處理并未造成黃花菜ROS代謝失衡，過多積累H2O2，這可能是因為低溫等離子體處理提高了抗氧化酶活性，及時清除了黃花菜組織中的ROS。

圖4 低溫等離子處理對采后黃花菜H2O2含量的影響Fig. 4 Effect of cold plasma treatment on hydrogen peroxide (H2O2)content of postharvest daylily

2.3 低溫等離子體處理對采后黃花菜MDA含量的影響

MDA是果蔬采后膜脂過氧化的主要產物之一，其含量可間接衡量植物細胞受損程度[24]。由圖5可知，隨著貯藏時間的延長，處理組和對照組MDA含量均呈明顯上升的趨勢，且對照組在貯藏后期達到了較高水平，說明膜脂嚴重過氧化。貯藏初期，黃花菜MDA含量僅為0.41 nmol/mg，貯藏第3天，處理組MDA含量為0.51 nmol/mg，對照組MDA含量為1.16 nmol/mg，是處理組的2.27 倍，處理組MDA含量顯著低于對照組（P＜0.05），說明對照組膜脂氧化程度較高；在貯藏過程內，處理組的MDA含量始終顯著低于對照組（P＜0.05）。由此可知，低溫等離子體處理可有效減少采后黃花菜MDA的累積，降低鮮黃花菜采后膜脂過氧化的程度，較好地保持黃花菜細胞膜完整性，延緩黃花菜采后的衰老變質。

圖5 低溫等離子體處理對采后黃花菜MDA含量的影響Fig. 5 Effect of cold plasma treatment on MDA content of postharvest daylily

2.4 低溫等離子體處理對采后黃花菜細胞膜透過率的影響

由圖6可知，隨貯藏時間延長，細胞膜相對電導率均呈逐漸上升的趨勢。在貯藏第6天，處理組的細胞膜相對電導率顯著高于對照組（P＜0.05）；在貯藏6～15 d內，處理組的細胞膜相對電導率均極顯著高于對照組（P＜0.01）。由此可知，低溫等離子體處理可以減緩細胞膜相對電導率的增加，從而使黃花菜細胞膜保持完整性。這可能是因為低溫等離子體處理同時具有殺菌和提高黃花菜抗氧化酶活性的作用[25]，這兩者的協同作用避免了黃花菜細胞膜結構被微生物侵染，從而保持了細胞膜的透過性，減緩了黃花菜采后的生理活動，提高了黃花菜的采后品質。

圖6 低溫等離子體處理對采后黃花菜細胞膜透過率的影響Fig. 6 Effect of cold plasma treatment on cell membrane permeability of postharvest daylily

2.5 低溫等離子體處理對采后黃花菜可溶性蛋白含量的影響

由圖7可知，隨貯藏時間的延長，可溶性蛋白含量總體呈下降趨勢，可能是因為發生了水解[26]。但是貯藏第3天，處理組黃花菜的可溶性蛋白含量高達16.38 mg/g，而對照組快速下降至10.8 mg/g，差異顯著（P＜0.05），這可能是因為低溫等離子體處理會抑制采后黃花菜蛋白水解酶活性，從而提高了可溶性蛋白的積累。貯藏后期，處理組可溶性蛋白保持較高水平，但二者差異不顯著（P＞0.05）。由此可知，低溫等離子體處理可延緩鮮黃花菜可溶性蛋白的降低，從而提高黃花菜細胞的保水性，對細胞膜起到保護作用，使黃花菜保持較好的營養價值。

圖7 低溫等離子體處理對采后黃花菜可溶性蛋白含量的影響Fig. 7 Effect of cold plasma treatment on soluble protein content of postharvest daylily

2.6 低溫等離子體處理對采后黃花菜TSS質量分數的影響

TSS主要以可溶性糖類為主，是果蔬自身呼吸代謝活動的主要能量來源，其質量分數是反映果蔬成熟度和貯藏品質的重要指標[27]。由圖8可知，隨貯藏時間的延長，TSS質量分數總體呈先升高再下降趨勢。在貯藏期間，處理組與對照組TSS質量分數差異不顯著（P＞0.05），由此可知，低溫等離子體處理對采后黃花菜的TSS質量分數變化無明顯影響。

圖8 低溫等離子體處理對采后黃花菜TSS質量分數的影響Fig. 8 Effect of cold plasma treatment on soluble solid content of postharvest daylily

2.7 低溫等離子體處理對采后黃花菜VC含量的影響

VC是黃花菜中重要的營養成分，其含量也是衡量鮮黃花菜品質的重要指標。由圖9可知，隨貯藏時間延長，采后黃花菜的VC含量均呈逐漸下降趨勢。在貯藏第6～15天內，處理組VC含量均顯著高于對照組（P＜0.05）。由此可知，低溫等離子體處理可以延緩鮮黃花菜采后VC含量的下降，這可能是低溫等離子體處理過程中釋放的活性粒子抑制了VC的氧化[28]，使其保持較高的營養價值。

圖9 低溫等離子體處理對采后黃花菜VC含量的影響Fig. 9 Effect of cold plasma treatment on VC content of postharvest daylily

2.8 低溫等離子體處理對采后黃花菜a*值的影響

色澤是決定黃花菜感官品質的重要指標。鮮黃花菜含有大量葉綠素，所以其色澤偏綠。由圖10可知，隨著貯藏時間的延長，鮮黃花菜的a*值總體呈逐漸上升的趨勢，是因為葉綠素在貯藏期間不斷降解[5]。貯藏前期，處理組與對照組a*值差異不顯著（P＞0.05），貯藏第9～15天，對照組a*值顯著高于處理組（P＜0.05）。由此可知，低溫等離子體處理可以延緩貯藏后期鮮黃花菜的褐變，使鮮黃花菜保持較好的感官品質。

圖10 低溫等離子體處理對采后黃花菜a*值的影響Fig. 10 Effect of cold plasma treatment on a* value of postharvest daylily

2.9 低溫等離子體處理對采后黃花菜中水分遷移規律的影響

橫向弛豫時間（T2）的長短可表征水分的流動性，弛豫時間短，說明水分流動性差，橫向弛豫時間越長，說明水分流動性越強，因此可通過測定橫向弛豫時間T2的變化來研究黃花菜內部水分的遷移變化情況。從圖11可以看出，對照組和處理組在不同貯藏時間的低場核磁共振圖中均出現3個峰，從左至右為結合水（1～10 ms）、不易流動水（10～100 ms）和自由水（100～1 000 ms）[29]。自由水是黃花菜的主要水分狀態，所占峰面積比例最大，為90%左右。

圖11 采后黃花菜貯藏過程中的水分遷移規律Fig. 11 Effect of cold plasma treatmentwater migration in postharvest daylily during storage

圖11中兩組核磁信號峰均出現了橫向位移，說明各個狀態的水分子之間出現了相互轉化。如圖11B所示，在對照組的T2曲線中，貯藏15 d時出現了峰肩相融合的趨勢。一般情況下，當生物體細胞的生物膜處于完整狀態并具備選擇透過性時，各個細胞器之間或者細胞膜內外，不同狀態的水分子之間不會相互干擾，進而影響核磁信號[30]。但當受到外界不良條件的影響，不同區域的水分子（或溶質）可能會相互滲透產生干擾。因此，圖11B中對照組T2曲線不易流動水和自由水出現峰肩融合現象的原因可能是貯藏末期黃花菜細胞生物膜系統受到攻擊，如微生物、ROS等，從而使細胞膜的透過性增加，使不同區域內的水分互相干擾造成核磁信號峰出現變化。相比之下，處理組黃花菜的核磁信號峰之間未出現位移相融的現象，各個水分狀態更接近于新鮮黃花菜。

通過峰面積歸一化法對不同狀態的水分含量（以峰面積表征）進行如表1所示處理，可以反映黃花菜在貯藏初期（第0天）、貯藏中期（第6天）、貯藏末期（第15天）黃花菜中結合水、不易流動水和自由水的遷移情況。如表1所示，黃花菜在貯藏期間，自由水含量逐漸減少，而結合水含量則基本不變，不易流動水含量先上升后下降；處理組不易流動水含量顯著低于對照組（P＜0.05），自由水含量也顯著高于對照組（P＜0.05），表現出較強的持水性容量。結合圖11可以看出，低溫等離子體處理可以較好地維持黃花菜的水分，保持其新鮮度，這可能是因為低溫等離子體處理的殺菌作用與提高抗氧化酶活性的協同作用，保持了黃花菜細胞膜的完整性，維持了正常的膜透過性功能，使各個水分狀態更穩定，從而減緩黃花菜采后衰老變質。

表1 低溫等離子體處理對黃花菜水分狀態的影響Table 1 Effect of cold plasma treatment on moisture state in daylily

3 討 論

ROS的積累會導致植物細胞膜的氧化損傷和脂質過氧化，ROS引起的干擾可通過ROS清除酶系統和非酶清除系統最小化。ROS清除酶系統主要包括SOD、CAT和POD，其可直接清除細胞內產生的或外界進入細胞中的多余ROS，SOD催化超氧陰離子使其降解為H2O2，CAT和POD將H2O2還原為H2O和O2。低溫等離子體處理過程中產生的ROS可能會誘導貯藏前期的SOD活力提高，顯著提高貯藏期間CAT和POD活力（P＜0.05）。這與Puac等[31]研究發現低溫等離子體處理會導致胡蘿卜體內SOD和POD活力增加的結果是一致的。

低溫等離子體處理可以減緩H2O2和MDA的積累，有效緩解采后黃花菜細胞膜相對電導率的上升，維持正常的細胞膜選擇透過性。可能是因為ROS作為信號轉導分子，通過誘導CAT和POD活力來調節植物細胞內ROS濃度。為了應對ROS水平的升高，黃花菜組織中的抗氧化機制被觸發，CAT和POD活力增加。酶活力的增加說明細胞內存在較多的ROS，表明黃花菜細胞處于氧化應激狀態。誘導CAT和POD活力可能是抑制氧化損傷、延緩采后黃花菜花蕾衰老的因素之一。

可溶性蛋白是重要的營養物質，其含量增加或積累能提高細胞的保水能力，對植物細胞生物膜起保護作用。低溫等離子體處理可延緩鮮黃花菜可溶性蛋白含量的降低，從而提高黃花菜細胞的保水性，對細胞膜起到保護作用，使黃花菜保持較好的營養價值。TSS和VC也是鮮黃花菜中重要的營養物質，低溫等離子體處理對鮮黃花菜中TSS質量分數無顯著影響，低溫等離子體處理有效延緩了VC含量的下降。色澤是評價鮮食黃花菜感官品質的重要指標，低溫等離子體處理延緩了鮮黃花菜a*值的上升，抑制了鮮黃花菜的褐變。水分分布測定結果表明，貯藏末期，處理組黃花菜不易流動水含量顯著低于對照組（P＜0.05），自由水含量顯著高于對照組（P＜0.05），使黃花菜表現出較強的持水性和新鮮度，綜合以上可知，低溫等離子體處理可減緩可溶性蛋白的水解、誘導抗氧化酶的活性，從而抑制ROS積累以及膜脂過氧化作用，延緩細胞膜透過性的增加，減少黃花菜的水分流失，保持黃花菜水分活度，防止鮮黃花菜采后的衰老變質，延長其貨架期。低溫等離子體技術在農產品的采后貯藏和加工中具有廣闊的應用前景[32]。

綜上所述，低溫等離子體在110 kV、110 Hz下處理鮮黃花菜150 s，可以誘導鮮黃花菜貯藏前期的SOD活力，顯著提高CAT和POD活力（P＜0.05），抑制H2O2積累，顯著抑制MDA積累（P＜0.05），顯著延緩細胞膜透過性的增加（P＜0.05）和黃花菜可溶性蛋白的水解，維持了黃花菜TSS質量分數，顯著延緩VC含量下降和貯藏后期黃花菜a*值的上升，延緩黃花菜的褐變，從而有效減緩黃花菜采后代謝活動，使其保持較好的品質，延長其貨架期。