人工模擬胃腸道模型在食源性致病菌異質性研究中的應用進展

趙 偉，王揚眉，潘迎捷,2,3，趙 勇,2,3,*，劉海泉,2,3,4,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.農業農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306；4.上海海洋大學食品熱加工工程技術研究中心，上海 201306）

食源性致病微生物是影響人類健康及生命安全的一大因素[1]。據世界衛生組織報告顯示，全球每年發生的6億多起食品安全事件導致約42萬 人死亡，其中40%的食源性疾病患者為5 歲以下兒童，每年約有12.5萬 例兒童患者死亡[2]。食源性致病微生物帶來的食品安全問題已成為全球關注的熱點和難點問題[3]。在日常生活中，人類誤食攜帶食源性致病微生物的食品后，會產生腹瀉、嘔吐、發燒等臨床癥狀，更嚴重者會出現反應性關節炎、心臟病等疾病。

面對食源性致病菌的巨大危害，研究人員通過建立風險評估體系來預防和降低其影響，但在此過程中，發現某些食源性致病菌在同樣的處理條件下所產生的差異性會對已經建立的風險評估體系造成一定的影響。Murphy等[4]在1998年最早提出菌株異質性的概念，他們指出菌株異質性能真實地反映種群的差異性，且微生物異質性的概念也在后續的研究中得到逐漸完善，一般是指同一微生物即使在實驗室中通過單克隆培養后，最終群體中的每個細胞間都可能在遺傳、生理和生長行為等方面表現出廣泛的差異性[2,5]。食源性致病菌表現出的異質性（耐藥異質性、耐受異質性、毒力異質性等）會造成風險評估的不確定性和變異性，尤其會增加在工業生產中殺菌以及臨床治療的難度，最終對危害特征描述甚至微生物風險評估過程的準確性產生影響[6]，直接影響到人類的健康。

目前國內關于食源性致病菌異質性的研究相對較少，能夠運用于研究異質性而建立的模型更是少之又少。因此，建立相應的模型來研究異質性迫在眉睫，而在人體胃腸道中探究其耐受、耐藥異質性，有助于直接揭示食源性致病菌異質性對風險評估的影響以及其致病機理。為盡早預測這種異質性以及為應對異質性挑戰提前做準備，本文詳細總結了使用人工模擬胃腸道模型來研究食源性致病菌異質性的應用進展，以期能夠更好地利用其仿生消化系統以及能夠連續取樣和監測、成本低、效率高、重復性好且無體內實驗涉及到的倫理限制等優點來探究食源性致病菌在人體胃腸道內的異質性及其致病機理，為解決食源性致病菌引發的食品安全問題提供科學依據，并從源頭上有效控制食源性致病菌的致病風險。

1 模擬胃腸道模型

1.1 動物感染模型

人體胃腸道是一個相對復雜的內部結構，包括胃、小腸以及大腸，且人體胃腸道微生物種類繁多、數量巨大[7-9]（圖1）。人類胃腸道的疾病機制十分復雜，在理想情況下，食源性致病菌研究應該結合臨床實驗開展，然而由于消化道結構與功能的復雜性以及臨床研究重復性差、成本高、周期長、工作量大等原因，臨床經驗的積累在時間和空間上都存在很大的局限性，且許多實驗在倫理上也受到限制；同時由于人類腸道微生物的復雜性，許多微生物功能方面的問題也急需解決，因此結合臨床實驗開展食源性致病菌的研究進展緩慢[10]。基于上述情況，動物感染模型應運而生，目前動物生理學、動物病理學和動物治療學等研究領域廣泛應用了動物模型。在自然條件下，研究人員主要利用動物模型進行間接研究，有目的地篩選不易排除的因素，從而更加準確地觀察實驗的結果，并與實際的人類胃腸道疾病比較，準確地了解人類疾病的病理機制。一般情況下，動物模型可以分為靈長類動物、雪貂、貓、犬、嚙齒類動物、豬等幾類[11]，可廣泛應用于探究食源性致病微生物在人體胃腸道的感染機理。在眾多的食源性致病菌中，革蘭氏陰性微需氧菌幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）是常見的存在于人類胃腸道中的食源性致病菌[12]，它在胃內定植可引起人體不同的病理改變，包括胃炎、消化性潰瘍、黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、癌前病變和胃腺癌[9]。自1983年發現幽門螺桿菌以來，研究人員一直致力于在動物體內模擬其感染人致病的過程、分析腸道菌群的變化及進行開發疫苗的研究[11-13]，也將多種動物模型應用于其致病機理的探究。其中，Suganya等[13]利用幽門螺桿菌悉尼菌株在胃內的定植構建了幽門螺桿菌感染小鼠模型，以探究一種熱滅活全細胞疫苗治療幽門螺桿菌的可能性；Miszczyk等[14]構建了一個慢性幽門螺旋桿菌感染大鼠模型，用于探究胃微循環變化以及植物產品對慢性胃炎的治療效果；Memariani等[15]利用幽門螺桿菌悉尼菌株在胃中定植建立了一種大鼠幽門螺桿菌感染模型，用于研究大西洋黃連木精油對消化性潰瘍的治療效果；Rong Qian等[16]通過構建豬模型，發現青牛膽在體內和體外對幽門螺桿菌均有較強的抑殺作用；Mathur等[17]將人源化小腸上皮細胞的小鼠模型首次應用于沙門氏菌疫苗研制的研究中；Lu Shuaiyao等[18]選用了非人靈長類動物2個家族（舊大陸猴和新大陸猴）中的3個常用品種（恒河猴、食蟹猴和狨猴）進行SARS-CoV-2的感染，比較了3個品種非人靈長類動物在感染SARS-CoV-2后的臨床癥狀、病毒在體內的復制和分布以及宿主對病毒感染的反應。

圖1 人體胃腸道模型及腸道菌群密度分布示意圖[7,17-18]Fig. 1 Schematic diagram of the human gastro-intestinal tract model with the density distribution of intestinal flora[7,17-18]

雖然過去很多學者將動物感染模型廣泛應用于食源性致病菌以及流行病毒的研究中，但是動物感染模型仍然存在很大的局限性。理想的動物模型應該和人類具有相同的感染途徑、發病率、死亡率、腸道菌群等，感染性動物模型畢竟是利用動物通過人工感染方式進行模擬研究，尤其是通過人源性病原體感染動物往往不會得到和人完全相同的病程，這也是感染動物模型最大的應用局限性；因此，通過實驗動物模型得到的研究結果必須經過慎重地對比才能類推到人類。動物模型的局限性一般包括以下幾個方面：1）動物和人體存在較大差異，可能使同一病原體在不同的機體中表現不同。人類在遺傳背景、生理基礎、生活環境等方面和動物都有一定的區別，選擇進化樹和人類接近的動物，可能更能表現出疾病的類似性；2）動物種類和等級的限制等因素影響動物模型，不同的動物遺傳和生物學特性不同，對病原和致病菌感染會有不同的表現，不同種屬、品種、品系動物存在的個體差異也會影響模型的一致性；3）微生物的生物學特性會對模型產生極大的影響。總之，運用動物模型研究食源性致病菌雖然可以避免倫理問題，但是無法真實地顯示飲食、基因型或環境因素對人體胃腸道微生物組成的影響，而且物種間存在差異性，通過動物模型所得到的實驗結果多數與臨床結果不一致，其并不完全具備典型性；因此從普通動物模型中得到的結論不能直接類推到人體，無法準確反映人體腸道菌群的真實情況，這也成為未來需要解決的一個重要科學問題。

1.2 人工模擬胃腸道模型

人工模擬胃腸道模型是在實驗室的條件下，通過模擬人體消化過程中化學和物理的變化及生物的作用，分析食源性致病菌的耐受異質性及致病機理，為后期研發疫苗提供實驗基礎[19]。

1.2.1 靜態胃腸道模型

靜態胃腸道模型在食源性致病菌的研究中應用廣泛，主要通過模擬胃腸道環境來探究食源性致病菌在人體消化過程中的耐受性和異質性。Jiang Lingli等[20]利用體外模擬胃腸道模型研究了單核細胞增生李斯特菌在胃液中的存活情況，結果發現單核細胞增生李斯特菌無法在pH值為2.5和3.0的胃液中存活。Vaz等[21]研究了在模擬胃腸道條件下（在有食物的情況下）葡萄酒對蠟狀芽孢桿菌存活性的影響，發現除了合成胃液的作用外，葡萄酒會大大減少蠟狀芽孢桿菌活菌的數量。關小鶯等[22]以干酪乳桿菌發酵荔枝汁為研究對象，在人工胃液、腸液環境下對干酪乳桿菌的存活情況進行研究，結果發現干酪乳桿菌在人工腸胃液中具有較強的耐受能力。Wijnands等[23]使用體外靜態模型對沙門氏菌在模擬胃液中的存活情況進行了研究。André等[24]利用體外胃腸道模型模擬食物在胃中的消化過程并創建了新的消化方法（INFOGEST 2.0）。Roussel等[25]運用體外靜態模型對成年人及兒童胃腸道環境進行模擬，探究食源性致病菌在不同年齡段人群胃腸道中耐受性的差異。靜態模型是目前體外模型中應用最為廣泛的消化模型，主要適用于局部消化的研究，其操作比較簡單，但是靜態模型不能模擬胃腸道的蠕動以及觀察食源性致病菌在人體胃腸道發生的物理化學和生物變化[26]。

1.2.2 動態胃腸道模型

動態模型是在靜態模型的基礎上發展而來，目前主要開發出3 種動態模型。動態模型的優勢在于不僅能模擬胃腸道中物理和化學變化過程，而且可以顯示不同消化時間下發生的變化，也可以用于研究食源性致病菌的致病機理。

動態胃模型（dynamic gastric model，DGM）是目前使用較多的模擬胃內部消化的單室動態模型[27]。DGM由2個連續的隔室組成，第一階段主要模擬食品樣品在胃中的剪切、混合等物理過程，然后將處理好的食物經過特異性胃排空到第二階段的胃竇中[28]，此部分是胃消化過程中的關鍵“加工站”，但它無法準確地模擬消化過程中胃部的動態蠕動；而人體胃模擬器（human gastric simulator，HGS）是一種用于研究食物消化的體外胃模型，它能夠模擬胃壁的連續蠕動，具有與體內胃腸道相似的收縮力和頻率[29]，此外還結合了胃液分泌、排空系統和溫度控制，可以準確模擬動態消化過程，詳細分析攝入食品的物理和化學性質的變化[30]，其最大的優勢在于胃壁的蠕動收縮力和收縮頻率均可靈活調節，且與體內數據近似[31]。

DGM和HGS雖然非常適合胃部體外消化研究，但相對于整個消化系統而言，僅提供了局部胃處理過程的實驗結果，無法完全模擬整個消化過程中的連續變化，為了克服這個缺點，雙室和多室動態模型應運而生。由荷蘭國家應用科學研究院（The Netherlands Organization for Applied Scientific Research，TNO）開發的TNO胃腸道模型1（TNO gastro-intestinal model 1，TIM1）是目前最接近真實人體胃腸道消化的體外動態雙室模型，主要分為5個部分，包括消化道的胃、十二指腸、空腸、回腸和結腸，每一部分均用柔性膜來模擬對應的消化道場所[32]。TIM1系統能夠模擬人體胃腸道中的大多數參數，如胃排空、人體溫度、胃腸液的pH值變化、胃腸的消化時間等。TNO胃腸道模型2（TNO gastro-intestinal model 2，TIM2）在TIM1的基礎上發展演變而來，增加了模擬腸道微生物的功能[33]，可以模擬人體不同代謝階段的消化情況。

腸道微生物模擬系統[34]（simulated human intestinal microbial ecosystem，SHIME）是一個模擬人類胃腸道微生物生態系統的五級反應器，利用兩級“填充和拉伸”系統模擬小腸，利用三級反應系統來模擬大腸，并通過監測發酵通量以及產物情況來驗證整個系統，分析體內胃腸道微生物群落的多樣性和活性。

體外動態胃腸道模型普遍具有操作簡單、重復性良好、可實時監控且可根據實驗目的改變實驗條件等優點，但同時存在設備價格昂貴、系統內部不易清潔以及無法切實模擬消化過程中激素分泌和反饋調節等缺點。因此，想要人工模擬胃腸道模型能夠達到完全模擬人體消化過程仍然是一個挑戰，需要更先進的科學技術加以輔助與驗證。表1詳細比較了不同胃腸道模型的優劣勢。

表1 不同的胃腸道模型的比較Table 1 Comparison of different gastrointestinal tract models

2 應用人工模擬胃腸道模型探究食源性致病菌的異質性

異質性是微生物在復雜多變環境中生存的一種策略，在表型和遺傳等方面表現出差異，使微生物能夠在一定的生存環境中選擇特定的生存方式（與生存環境的變化協調一致），從而表現出該微生物的多樣性。通常來說，生長行為表現出的差異性被稱為生長異質性[35-36]；不同環境和食品中分離的微生物，其耐藥性、生理特性等具有顯著的差異，屬于典型的表型異質性。而同一菌株的不同單細胞，其毒力和致病性亦存在差異，且具有多樣性，在不同環境條件下表現出不同的生長速率、生物被膜的形成能力以及耐藥性等，這種廣度的異質性使得菌株對環境產生不同的適應性和抗性[37-39]。目前，國內的大部分報道主要集中于在體外研究單因素（不同溫度、鹽度、pH值等）條件下食源性致病菌表現出的異質性，而聚焦于人體胃腸道環境下進行食源性致病菌異質性的研究相對較少。因此，應用人工模擬胃腸道模型來探究食源性致病菌的異質性具有重大的科學意義。

2.1 應用人工模擬胃腸道模型探究食源性致病菌耐受異質性

2.1.1 應用人工模擬胃腸道模型探究大腸桿菌耐受異質性

微生物的培養生長一般可分為4個時期：延滯期、對數生長期、穩定期及衰亡期。食源性致病菌的生長異質性可能會出現在任何一個生長時期，其產生的主要原因是致病菌不管是在延滯期的適應過程、對數生長期的生長過程、穩定期的動態平衡過程還是在衰亡期的負生長過程，都會因為生長環境的脅迫在生長速率、傳代時間、耐受性及生長極限等方面表現出較大的差異性[40]。由TNO構建的TNO腸道模型TIM最初用于藥物活性的動態測試，是一種計算機多單元控制的體外消化模擬系統，現如今廣泛應用于探究食源性致病菌生長異質性。Miszczycha等[41]將大腸桿菌O26:H11和大腸桿菌O157:H7接種于生牛乳，并將其發酵制作為奶酪，隨后用TIM1系統研究奶酪中的大腸桿菌在模擬消化過程中的存活率變化，結果發現在通過人工胃和十二指腸的過程中，大腸桿菌存活水平降低；在胃隔室150 min后大腸桿菌O157:H7、大腸桿菌O26:H11的回收率分別為0.2%和1.8%，在回腸隔室中發現大腸桿菌O26:H11的存活率是大腸桿菌O157:H7的13 倍。由實驗結果可知，同種屬菌株間對模擬消化液的耐受性存在很大的差異性，表明同菌株間生長特性存在異質性，這種異質性的存在豐富了對菌株的研究內容，同時為研究食源性致病菌在胃腸道中的耐受異質性提供了理論基礎。不同年齡層次的人群對菌株的耐受異質性同樣存在差異。Roussel等[25]利用TIM研究大腸桿菌O157:H7在成人和兒童胃腸道消化條件下的存活率及毒力變化，結果發現大腸桿菌O157:H7的生長異質性及致病能力在成人和兒童的胃腸道中有較大差異，大腸桿菌O157:H7在兒童胃腸道中的致病能力以及存活率顯著高于成年人胃腸道。

2.1.2 應用人工模擬胃腸道模型探究副溶血性弧菌耐受異質性

外部環境（溫度、鹽度、pH值）和內在因素（不同毒力基因型）對食源性致病菌的異質性都有一定的影響。王思琦[42]利用人工靜態模擬消化模型對上海市不同來源的副溶血性弧菌在人體模擬消化過程中的存活率、形態變化、異質性及基因表達變化進行了驗證性研究，結果發現在人體消化過程中，唾液對副溶血性弧菌無明顯影響，不具備殺菌作用；副溶血性弧菌在胃液中存活率低，細胞的微觀結構受到嚴重破壞，胃是人體對副溶血性弧菌最有效的殺菌部位，致病性（trh+trh+、trh+tdh－、tdh－trh+）和非致病性（trh－tdh－）菌株的存活率存在顯著差異（致病性菌株的存活率顯著高于非致病性菌株）。Wang Yangmei等[43]首先通過模擬人體胃液探究50 株副溶血性弧菌在37 ℃下的生長異質性，其次研究了致病性和非致病性副溶血性弧菌在模擬人體胃液條件下的變異系數，結果表明，模擬人體胃液處理顯著提高了致病菌株的最大生長速率，縮短了延滯期的時間；而非致病菌株的最大生長速率降低，延滯期時間延長。同時致病基因型（tlh+/tdh+/trh－）菌株的變異系數明顯升高，說明致病基因型（tlh+/tdh+/trh－）的菌株對模擬胃液有較強的適應性，結果表明副溶血性弧菌對模擬胃液表現出明顯不同的耐受性和生長異質性。王思琦等[44]將濃度為107CFU/g的副溶血性弧菌接種于三文魚和南美白對蝦中，運用體外人胃仿生原位消化系統進行消化模擬，在食物消化120 min進入腸道后，副溶血性弧菌并沒有完全被胃酸殺滅，這表明副溶血性弧菌可隨食物基質的消化分解通過胃排空進入腸道，從而避免胃酸的殺滅并導致人體患病，初步揭示了副溶血性弧菌在人體消化道中的耐受性及致病機理。副溶血性弧菌的存活異質性受胃腸道的影響很大，江明倫等[45]等探究了3 株副溶血性弧菌在經酸處理后在模擬胃腸道環境中的存活情況，結果發現3 株菌表現出不同的耐受性，其中兩株副溶血性弧菌的存活率較高，另一株沒有顯著變化。

2.2 食源性致病菌耐藥異質性的探究方法

致病菌對抗生素產生耐藥性是對人類健康的全球性威脅。近幾年的一些研究表明，致病菌的耐藥異質性發生率很高，并且最終會導致臨床抗感染治療的失敗。雖然有很多檢測致病菌耐藥異質性的方法，如菌譜型分析法、瓊脂稀釋法、微量肉湯稀釋法、分子檢測法、群體-曲線下面積法及藥敏紙片擴散法等，但是致病菌的耐藥異質性如何在腸道中導致治療失敗的原因并沒有得到詳細的研究[46]。菌株耐藥異質性主要可以分為對不同種類抗生素的耐藥性（即單一抗生素耐藥性或多重抗生素耐藥性）以及對同種抗生素耐藥劑量的差異[47],若食源性致病菌產生耐藥異質性，則會導致原來的抗生素以及抗生素用量無法產生效用，致使臨床治療失敗。目前，只有少數的動物感染模型被應用于探究致病菌耐藥異質性和臨床治療失敗之間的關系。Band等[48]利用小鼠模型研究了陰溝腸桿菌耐藥亞群介導的抗生素失效，在小鼠感染但沒有黏菌素治療的情況下，小鼠的先天性免疫防御系統導致耐藥亞群的數量增加，使得分離菌株產生耐藥性，導致隨后的黏菌素治療失效，同時在黏菌素治療期間，耐藥亞群的數量也上升了。Band等[49]在另一項研究中發現小鼠在感染對黏菌素敏感的菌株（肺炎克雷伯氏菌GA65146）后未經黏菌素治療會死亡，通過黏菌素治療后能夠存活。但感染了任何一種耐藥異質性菌株（肺炎克雷伯氏菌Mu9或Mu156）的小鼠即使在黏菌素治療的情況下也無法存活。這兩項研究都是利用小鼠模型證明了菌株的耐藥異質性會導致黏菌素臨床治療失敗，且表明小頻率（10－6～10－2之間）耐藥亞群的持續存在會導致治療失敗。除了小鼠模型之外，其他動物感染模型和人工模擬胃腸道模型也被用來研究菌株的耐藥異質性，例如Nicoloff等[50]用兔心內膜炎模型證明了萬古霉素治療失敗與兩種異質性萬古霉素中介金黃色葡萄球菌分離株有關。Pierre等[51]使用大鼠模型，在其皮下植入耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌MRGR3，經2 mg/L的替考拉寧或范康霉素作用約12 h后，大鼠模型中沒有出現明顯的糖肽抗性亞群，但未經抗生素治療的大鼠模型3 周后出現了糖肽抗性亞群，表明在一定的人體胃腸道條件下可能會提高糖肽抗性亞群出現的頻率。Yun等[52]利用人體胃腸道消化模型探究胃腸道的消化環境對抗生素濃度的影響以及金黃色葡萄球菌RN4220經人體外消化后對四環素、氧氟沙星和青霉素3 種抗生素耐藥性的變化，結果發現經人體消化后金黃色葡萄球菌RN4220對3 種抗生素的耐藥性增強。除了動物模型的研究，藥效學模型也可以預測耐藥異質性可能導致治療失敗。在一項研究中，研究人員通過構建4 種不同推薦劑量方案的體外藥動學-藥效學模型，觀察24 h后兩株耐藥異質性鮑曼不動桿菌菌株對黏菌素耐藥性的變化，黏菌素干預初期兩株耐藥異質性鮑曼不動桿菌大量死亡，6 h后這兩種菌株開始迅速生長[53]。

3 結 語

食源性致病菌是影響食品安全的主要因素之一，而其異質性會對風險評估的準確性產生極大的影響，但目前對異質性的研究不夠重視，因此迫切需要研究食源性致病菌的異質性并完善微生物風險評估體系。通過對動物模型和體外人工模擬胃腸道模型進行比較，發現人工模擬胃腸道模型可以針對不同年齡、不同患病情況的病人進行獨立實驗設計，其操作相對簡便，屬于機械性的體外模擬。已有學者將動態模型運用于探究副溶血性弧菌和大腸桿菌的耐受異質性從而構建更加全面系統的食品安全風險精準評估體系。但目前人工模擬胃腸道模型在食源性致病菌異質性研究的應用仍存在許多不足，今后人工模擬胃腸道模型的研發方向和應用范疇應關注以下問題：1）開發更加接近人體實際情況的體外胃腸道模型并不斷完善人工模擬胃腸道模型的標準。體外胃腸道模型最大的優點在于不涉及倫理道德問題，可以根據實驗目標模擬胃腸道的條件，具有操作簡單、重復性好、可以實時監控等優勢。但是目前已經開發的人工模擬胃腸道模型和人體的真實胃腸道還是存在很大的差異，導致一部分的實驗結果不具有代表性，而且模擬胃腸道模型缺乏統一的標準，很多實驗參數存在很大的差異性，所得到的實驗結果不能進行系統性分析。因此，在后續的研究中，應不斷完善人工模擬胃腸道模型，使其不斷接近人體胃腸道的真實狀態，同時不斷完善人工模擬胃腸道模型的標準。2）綜合運用新興的科學技術構建新型的人工模擬胃腸道模型。未來，人工智能將作為相關醫學研究的常規工具[54]。在后續的研究中可將仿生學和人工智能結合來研究食源性致病菌的異質性。3）建立特異性人工模擬胃腸道模型研究食源性致病菌。在目前存在的人工模擬胃腸道模型中，多數是針對健康的成年人設計的，而人體胃腸道動力以及生化環境會受到年齡以及性別等因素的影響，面對這樣的情況，應該設計和構建符合特異性人群的胃腸道模型來研究食源性致病菌的異質性。