濃香型白酒窖泥微生物評價體系的構建

張夢夢，吳玉軒，呂志遠，蘇 寧，胥鑫鈺

（濟南趵突泉釀酒有限責任公司，山東濟南 250115）

濃香型白酒的生產是以窖泥微生物、大曲微生物、酒醅微生物等復雜的物質能量代謝為前提，其中窖泥微生物的作用使得濃香型白酒產生濃郁的窖香，因此窖泥微生物區系對白酒的風味與品質至關重要。

窖泥微生物屬于厭氧發酵體系,其研究的難點在于大量具有重要代謝功能的微生物在實驗室條件下難以培養[1]。而這些微生物群落組成及多樣性反映了窖泥質量,并在很大程度上決定了濃香型白酒品質。窖泥中富集多種厭氧功能菌，主要為嫌氣性梭狀芽孢桿菌，它們參與濃香型白酒發酵的生香作用。據資料顯示，老窖中嫌氣芽孢桿菌超過新窖的3 倍。濃香型白酒以固態窖泥發酵為特征,窖泥中微生物的生長代謝活動對白酒風味物質的形成具有重要影響[2]。老熟窖泥的細菌多樣性指數及均勻度指數高于新窖泥和趨老熟窖泥[3]。全面剖析窖泥中功能微生物菌群組成及多樣性、窖泥質量與微生物群落之間的關聯性為深入認識白酒生產機制,進而為從根本上提升白酒品質提供理論依據。同時也是帶動白酒傳統生產技術升級及實現白酒可持續發展的必要環節[4]。

廣義的細菌是指所有的原核生物，是所有生物中數量最多的一類。細菌中有很多釀酒有益菌，對白酒風味起著舉足輕重的作用，如：己酸菌是老窖發酵生香的一種功能菌；乳酸菌具有產乳酸酯的能力，并能將己糖同化為乳酸、酒精和CO2。不同的釀酒有益菌對白酒發酵均起著不可忽視的作用。

梭菌屬是芽孢桿菌科的一個屬，是能形成芽孢、厭氧生長的革蘭氏染色陽性大桿菌，因芽孢常比菌體大，致使菌體呈梭狀而得名，又稱厭氧芽孢桿菌屬。梭菌因其能夠代謝合成白酒中的重要風味物質而被認為是窖泥中的優勢菌之一，例如C.tyrobutyricum及C.butyricum的主要代謝產物為丁酸，同時伴有乙酸生成等[5]。

本次實驗結果主要以PCR-DGGE 條帶為依據，并將條帶采取一定方法換算出條帶分值。根據結果分析條帶得分高低與窖池酒質的對應關系，找到適合本廠窖泥的微生物評價體系。因此，此實驗對窖泥追蹤、提高酒質、改良生產等有著重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

窖泥樣品：取樣對象為濃香型窖池的池壁窖泥，由于時間原因，窖泥取樣分4 輪不同窖池的窖泥。此次實驗以窖泥普查為主，各輪次穿插同一窖池不同輪次的窖泥樣品。因檢修結束后（比正常輪次發酵期延長60 d），生產經驗可知，優質原酒一般出現在中下層，故實驗選擇池壁下層窖泥取樣分析。本次分析樣本數目較豐富，共573 個窖泥樣品，其中一輪164 個樣品、二輪188 個、三輪170 個、四輪51 個。此報告主要針對四個輪次所取樣品進行階段性匯總分析，分細菌界和梭菌屬兩大體系進行實驗。

試劑及耗材：Easy taq 酶、DNA Maker、loading buffer、GelStain 染液，北京全式金生物技術有限公司提供；DNA 提取試劑盒、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、尿素、四甲基乙二胺、過硫酸銨（均為分析純），生工生物工程(上海)股份有限公司。

儀器設備：高速冷凍離心機，德國Sigma 公司；T100 型PCR 擴增儀、DCodeTM System 突變檢測系統及凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；DYCP-31 E型瓊脂糖電泳儀，北京六一儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 分析方法

為進一步探究原酒酒質、窖泥理化指標與窖泥微生物多樣性之間的關聯性，綜合所有樣品，對窖泥理化指標與窖泥微生物所對應指紋圖譜進行了量化。

1.2.2 實驗步驟

1.2.2.1 窖泥DNA提取

窖泥DNA 的提取采用基因組DNA 提取試劑盒，試劑盒具體組成見表1。

表1 DNA提取試劑盒具體組成

取0.22～0.23 g的窖泥，加入400 μL 65 ℃預熱的Buffer SCL,振蕩混勻，置于65 ℃水浴15 min；室溫12000 r/min 離心3 min，吸取上清液轉移至新的1.5 mL離心管中；加入等體積Buffer SP，顛倒混勻，冰浴10 min；室溫12000 r/min 再次離心3 min，吸取上清液至一個干凈的1.5 mL離心管中；加入200 μL氯仿，充分混勻，12000 r/min 離心5 min。吸取上層水相至一個干凈的2 mL 離心管中；加入1.5 倍體積的Buffer SB，充分混勻后用移液器將其全部加入到吸附柱中，室溫靜置2 min；12000 r/min 離心30 s，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，加入700 μL Wash Solution，12000 r/min 離心30 s，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，加入300 μL Wash Solution，12000 r/min 離心1 min，倒掉收集管中廢液；將吸附柱放回收集管中，12000 r/min離心2 min（此步絕不可省略，否則殘余的乙醇會嚴重影響得率和后續實驗）。取出吸附柱，放入一個新的1.5 mL 離心管中，在吸附膜中加入50～100 μL TE Buffer，靜置3 min。12000 r/min 離心2 min，得到的DNA 溶液置于-20 ℃保存或直接用于后續試驗。重復最后一個步驟或將TE Buffer 60 ℃預熱，以此提高DNA的得率。

1.2.2.2 PCR擴增

配制所需樣品的總體系，見表2。

表2 細菌體系(共50 μL)

細菌引物：

（1）上游引物：F338（含GC夾子）。

（2）下游引物：R518。

表3 梭菌體系(共50 μL)

梭菌引物：

（1）上游引物：SJ-F（含GC夾子）。

（2）下游引物：SJ-R。

注：分裝完總體系，加模板DNA 時，注意換槍頭，防止交叉污染。標記好順序，防止混亂。

擴增體系配制結束后，混勻于PCR儀中進行擴增，不同類型菌種采用不同擴增方式。

1.2.2.3 瓊脂糖凝膠電泳

（1）制膠

①稱取0.3 g 瓊脂糖于三角瓶中，加入20 mL 1×TAE緩沖液，加熱溶解（注意瓊脂糖完全溶解，壁上勿沾，混勻）。

②加熱混勻后，加入1 μL gelstain（核酸染料），混勻充分。

③將混勻溶解后的瓊脂糖溶液倒入事先準備好的模具中。

④室溫凝固約30 min，凝固后，拔下梳子于電泳槽中待用。

⑤電泳槽中緩沖液（1×TAE）倒至約max 位置，使緩沖液沒過凝膠，進行點樣。

⑥將提取的DNA 與Loading Buffer 混勻后，點入到孔中（依次點入，不亂順序）。

（2）點樣結束后，插入電極，130 V，30 min左右。

此步驟用來檢測DNA 是否提取成功，若用試劑盒提取后的DNA相對穩定，此步驟可省略。

1.2.2.4 DGGE（變性梯度凝膠電泳）

（1）制備丙烯酰胺凝膠

①將預先洗干凈的制膠條安裝正確。

②變性劑的制備。

表4 細菌變性劑的制備

表5 梭菌變性劑的制備

相關藥品加入完畢后，均定容至100 mL備用。

注：a.40 %Arc-Bis 制備法：Arc：38.93 g；Bis：1.07 g。

B.50×TAE 溶液制備：Tris-Base：242 g+500～600 mL H2O；EDTA：18.6 g+200 mL H2O。

水：750 mL；冰乙酸：57.1 mL。

③準備兩個高低變性梯度的離心管，制備相應菌種變化梯度。

④將制好的高低濃度變性劑混勻充分，灌膠。

⑤凝膠制好后，輕輕插入梳子，避免產生氣泡。

⑥凝膠待用，室溫約凝4 h左右。

（2）點樣，電泳

①細 菌：將PCR 擴 增好 的DNA 模板+9 μL Loading buffer（6×），離心混勻，全部吸取點入點樣孔，緩沖液封孔，放入電泳槽內準備電泳，待液面到達run 線，設置儀器為20 V，20 min 沖洗泳道，之后電泳。

表6 菌種變化梯度

②梭菌：將PCR 擴增好的DNA 模板+9 μL Loading buffer（6×），離心混勻，全部吸取點入點樣孔，緩沖液封孔，放入電泳槽內準備電泳，待液面到達run 線，設置儀器為20 V，20 min 沖洗泳道，之后按60 V+930 min條件進行電泳。

（3）染色

電泳結束后，在板內倒入染色液（核酸染料selstain），避光染色1 h，后于去離子水中清洗30 min左右，后于紫外線下顯像觀察。

（4）DGGE條帶順序

擴增，篩選條帶較好的凝膠切下，于50 μL 無菌水中，65 ℃水溶和-20 ℃冰箱中反復凍融（4 ℃過夜也可），膠完全融化后作為DNA 模板放于4 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 檢修后細菌四輪窖泥評價與原酒酒質分析

本次實驗就檢修后第一輪至第四輪的540 個樣品進行分析，去除25 個異常樣品后，以橫坐標為窖泥評價得分，定60 分為及格線；縱坐標代表平均己酸乙酯含量，其中一輪因發酵時間較長，己酸乙酯含量較高，因此己酸乙酯基準線定為5.2 g/L，其余三輪己酸乙酯基準線定3.8 g/L，據此繪制窖泥細菌評價與原酒酒質分布圖。四輪對比圖如圖1所示。

圖1 檢修后細菌界窖池得分與原酒酒質關系

圖1 整體表現為一三象限數據多，二四象限數據少的規律。一三象限，主要呈現窖泥綜合得分越高，平均己酸乙酯含量越高的規律，也就是窖泥綜合得分與原酒酒質呈現正相關；二四象限呈現窖泥綜合得分較低，但平均己酸乙酯較高或窖泥綜合得分較高，但平均己酸乙酯較低的現象，出現這些偏離規律的數據，可能是窖泥質量不是決定原酒酒質的唯一因素，或者窖泥的評價體系并不完美。但是，大體規律還是有很強的指向性。

其中我們發現檢修期后第一輪次酒質受窖泥影響比其他輪次要大，這應該與發酵時間有關系。因為檢修期結束后，各窖池的發酵期均增加了60 d左右，己酸乙酯轉化率提高。

由圖2 可以看出，數據點主要集中在一三象限，且分布在漸近線兩側。可以得出數據總體的線性趨勢呈正相關，即窖泥評價得分越高，平均己酸乙酯越高。

圖2 四輪次細菌界綜合窖泥得分與原酒酒質關系

白酒發酵是一個多微共酵的過程，窖泥微生物是決定白酒風味與品質的核心，但是發酵過程還受發酵時間、酒醅質量、發酵情況、人工操作等多因素的共同影響。

2.2 檢修后梭菌四輪窖泥評價與原酒酒質分析

本次實驗就檢修后第一輪至第四輪的560 個樣品進行分析，去除15 個異常樣品后，以橫坐標為窖泥評價得分，定60 分為及格線；縱坐標代表平均己酸乙酯含量，其中第一輪因發酵時間較長，己酸乙酯含量較高，因此己酸乙酯基準線定為5.2 g/L，其余三輪己酸乙酯基準線定3.8 g/L，據此繪制窖泥梭菌評價與原酒酒質分布圖。四輪對比圖如圖3所示。

圖3 檢修后梭菌屬窖池得分與原酒酒質關系

4 個輪次共有560 個數據，數據點分布平均，由圖3 不難看出，梭菌屬對比圖與細菌界的對比圖走向大致相同。整體呈現第一象限、第三象限窖池數據最多，第二象限、第四象限數據少的規律。且樣品數據均分布在漸近線兩側，窖池綜合得分與原酒酒質基本呈正相關，可以說明窖池綜合得分越高原酒酒質越好，也可以說明梭菌屬對窖泥質量有著重要影響。

此外還可以看出，梭菌屬檢修后第一輪窖泥樣品總體最接近趨勢線，可以得出檢修后第一輪次受窖泥質量影響最大，后三輪次二四象限中偏離趨勢線的點可以說明原酒酒質的好壞有諸多影響因素，窖泥質量的好壞只能作為影響原酒酒質的因素之一，還受發酵時間、操作過程等影響。

由圖4 可以看出，梭菌屬數據分布相比細菌界數據分布整體上移，可以看出梭菌對窖泥質量的影響較大。整體樣品分布與細菌界相差不大，還是以一三象限為主，部分在第二象限和第四象限偏X 軸方向。這表明窖泥的綜合得分與平均己酸乙酯總體成正相關，即窖泥質量較高的窖池，原酒酒質也較好，窖泥質量差的窖池，對應的原酒質量也較為遜色。

圖4 四輪次梭菌屬綜合窖泥得分與原酒酒質關系

2.3 對細菌界、梭菌屬的評價體系驗證

為驗證以上評價體系是否準確，現隨機抽取20組質量等級不同的原酒樣品及其所對應的窖泥樣品。對其原酒酒質及窖泥樣品分別進行檢測分析，分析圖譜如圖5—圖6。

圖5 原酒酒質與細菌界窖泥得分關系

圖6 原酒酒質與梭菌屬窖泥得分關系

由圖5、圖6 可看出，窖泥微生物評價得分基本遵循原酒的酒質變化，這也說明所構建的窖泥微生物評價體系可以運用于實際生產中對整個窖池所產原酒質量的預估及評價。

3 結論

本次實驗結果主要以PCR-DGGE 條帶為依據，并將條帶采取一定方法換算出條帶分值。根據結果分析條帶得分高低與窖池酒質的對應關系，找到適合本廠窖泥的微生物評價體系。對573 個窖泥樣品的細菌和梭菌分析表明，窖泥質量對于原酒酒質有著舉足輕重的作用，窖泥微生物多樣性與原酒酒質兩者相互聯系、相互制約。原酒酒質的好壞與窖泥質量緊密相關，但窖泥質量不是影響原酒酒質的唯一因素，這與酒醅質量、人工操作、發酵情況等也有著千絲萬縷的聯系，只有各個影響因素都處于最適狀態，酒質才能最大程度的提高。同時，退化窖泥、正常新窖泥及優質老窖泥的理化因子差異與細菌總量亦有相關性[5]。窖泥中微生物的種類和白酒的風味密切相關[6]，總而言之，白酒的發酵是一個多微共酵的過程，只有各個影響因素均處于最優狀態，原酒質量才能穩定提升。