HPLC-MS對不同青錢柳保健酒的成分鑒定分析

謝 洪，陸步詩，伍 強，李新社，王婧璇

（1.邵陽學院食品與化學工程學院，湖南邵陽 422000；2.生態釀酒技術與應用湖南省重點實驗室，湖南邵陽 422000）

青錢柳為胡桃科青錢柳屬植物，該屬僅有青錢柳一種，是集綠化、保健、藥用于一身的珍稀樹種[1]，被譽為植物界的大熊貓，醫學界的第三棵樹。對于其成分研究，目前報道的主要有無機類、黃酮類、多糖類和三萜類。無機類成分包括鉀鈣鎂等人體必要的常量元素等[2]；黃酮類包括黃酮醇及其苷類化合物[3-4]等；多糖類包括糖醛酸、β-糖苷鍵，并且有少量多糖和蛋白結合[5]；三萜類包括阿江欖仁酸、青錢柳酸A 和青錢柳酸B 等[6]。關于黃酮類化合物，其泛指兩個苯環(a 環與b 環)通過中央三碳鏈相互連接所構成，基本的結構主要為6C-3C-6C 的一系列化合物。據文獻報道，黃酮類化合物具有很多的生物活性功能，包括抗炎作用[7-8]、清除自由基和抗氧化作用[9]、酶抑制作用[10-12]、抗腫瘤作用[13]、對中樞神經系統的作用[14-15]、調脂作用[16]、抗病毒藥理作用和抗菌作用等[17-18]。從藥理學角度分析，黃酮類物質具有的效果包括抗抑郁、抗腫瘤、擴張血管等藥理活性[19]。關于三萜類化合物，目前其對人體的功效主要有溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低膽固醇等作用。另外，青錢柳具有天然的降三高作用，主要包括了降低人體血壓、血糖、血脂的功能，其作用機理是通過恢復病變胰島細胞機構和功能，增加外圍組織的胰島素受體，被醫學界稱之為“天然胰島素”[20-21]。

目前，對于青錢柳葉中成分的分析，主要有陳張金[22]采用UPLC-MS 法確定了其中含有蘆丁、金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷、異槲皮苷、槲皮苷、槲皮素6種黃酮類成分；李俊秀等[23]總結了青錢柳黃酮單體46種。

關于青錢柳保健酒中的成分研究，鮮有報道。因此，本試驗采用單因素與響應面結合試驗，獲得青錢柳保健酒的最佳浸泡條件，并在最佳條件下[24]，采用液質聯用法（HPLC-MS）對制得的兩種青錢柳保健酒進行成分鑒定分析，為青錢柳保健酒的生產提供有利參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：青錢柳老葉、青錢柳嫩葉，武岡青錢柳有限公司提供。

酒樣：62%vol 二鍋頭白酒，北京順鑫農業股份有限公司。

試劑及耗材：蘆丁標準品，安徽酷爾生物工程有限公司；NaNO2（分析純），天津市永大化學試劑有限公司；Al(NO3)3·9H2O（分析純），成都金山化學試劑有限公司；甲酸（色譜純），聊城通達化工有限公司；甲醇（分析純），天津市瑞明威化工有限公司。

儀器設備：傾斜式高速萬能粉碎機；電熱恒溫水浴鍋；高速離心機；電子天平；電子式液體密度計；超聲波清洗器；液相色譜（安捷倫1290uplc）；質譜（安捷倫qtof6550）。

1.2 液質聯用條件

流動相A：0.1%甲酸水溶液；流動相B：甲醇溶液；流速：0.3 mL/min；進樣量20 μL；色譜柱：安捷倫extend C182.1×50 mm 1.7 μm；流動相比例：0～3 min 5 % B；3～12 min 為5 %～95 % B；12～15 min 為95%B；15～20 min為5%B。

質譜掃描范圍：一級100～1500 m/z；Gas Temp 150 ℃；drying gas 15 L/min；sheath gas temp 350 ℃；sheath gas flow 12 L/min；ESI-模式：電壓4000 V。

2 結果與分析

2.1 青錢柳保健酒鑒定結果

青錢柳葉保健酒中含有酯類、酸類、羥基化合物、醛類化合物等，其中主要有效成分是黃酮類和三萜類等。采用液相色譜（安捷倫1290uplc）與質譜（安捷倫qtof6550）聯用，在設定的液質聯用條件下分別對青錢柳嫩葉與老葉保健酒有效成分進行分析。其總離子色譜圖見圖1 和圖2，成分鑒定結果見圖3。

圖1 青錢柳嫩葉保健酒總離子色譜圖

圖2 青錢柳老葉保健酒總離子色譜圖

圖3 成分鑒定結果

由圖3 可知，青錢柳嫩葉保健酒在1.2 的液質條件下，鑒定出的物質有164 種，其中通過分析得出的黃酮類物質有11 種，三萜類物質有20 種。青錢柳老葉保健酒鑒定出的物質有91 種，其中黃酮類物質有7種，三萜類物質有15種。

由此可見，青錢柳嫩葉保健酒中的成分比老葉保健酒中的有效成分更多，且成分更為復雜。嫩葉之所以成分種類比老葉多，原因是老葉在時間的積累下，很多成分已被分解利用，導致成分種類的減少，但根據鑒定結果分析，部分成分老葉峰面積大于嫩葉，原因是老葉雖然部分成分被分解利用，但也有部分成分在時間的積累下不斷地積累。另外，從圖中可以看出，兩種保健酒中均含有三萜類、黃酮類等有效成分，故通過浸泡制作青錢柳保健酒是可行的，此法能將青錢柳葉中有效成分溶解到白酒中，是因為白酒中含有乙醇，而乙醇對于部分類化合物是一種良好的有機溶劑。研究結果表明：從黃酮類及三萜類物質成分種類分析，嫩葉保健酒中含有的黃酮類成分更多，保健效果更佳。

2.2 不同青錢柳保健酒中黃酮類成分對比分析

采用液質聯用法對兩種青錢柳保健酒中的黃酮類物質進行鑒定，并通過相關文獻進行歸納分析，得出的結果見表1。

表1 青錢柳嫩葉保健酒黃酮類物質分析結果

由表1 可知，青錢柳嫩葉保健酒中含有11 種黃酮類物質，其中屬黃酮苷類物質種類較多；青錢柳老葉保健酒中含有7 種黃酮類物質，同樣，大部分屬黃酮苷類。其中，青錢柳嫩葉保健酒中含有的黃酮類物質囊括了老葉保健酒。原因是在植物生長過程中，生長初期，代謝不旺盛，光合作用弱，黃酮含量相對較少或變化不大。到了生長期，光合作用強，代謝旺盛，植物中黃酮含量不斷上升。但隨著葉片的衰老，植物的光合作用減弱，黃酮類含量也就相應減少，但黃酮類參與植物的生長，這就導致部分黃酮類物質被損耗而未能得到足夠的補充，從而導致黃酮含量逐漸減少。

研究結果表明，青錢柳老葉保健酒中除了3,4',5,7-四羥基黃酮-3-L-鼠李糖苷這種黃酮類物質峰面積高于嫩葉保健酒，其他黃酮類物質成分，峰面積均小于青錢柳嫩葉保健酒。故從黃酮類成分上進行對比，嫩葉保健酒中的黃酮類成分更多，對人體更具有保健作用。

2.3 不同青錢柳保健酒中三萜類成分對比分析

采用液質聯用法對兩種青錢柳保健酒中的三萜類物質進行鑒定，并通過相關文獻進行歸納分析，結果見表2。

表2 青錢柳嫩葉保健酒三萜類物質分析結果

由表2 可以看出，青錢柳嫩葉保健酒中所含有的三萜類化合物的種類以及大部分三萜類化合物的相對含量，均高于青錢柳老葉保健酒。其原因一是時間對植物生長過程中三萜類化合物的影響。三萜類化合物在生長過程中，含量首先是逐漸上升的狀態，然后開始下降，隨后略微上升，最后三萜類化合物含量呈現逐步下降。故對比青錢柳嫩葉保健酒與老葉保健酒中三萜類化合物的成分種類以及大部分物質的相對含量時，前者均高于后者，這與其本身葉片中所含有的三萜類物質之間存在一定的聯系。二是在植物生長的過程中，萜類物質對植物的生長起著重要作用，如部分三萜類物質參與生長激素等的合成，這也就導致其含量的減少，從生長過程分析，這也是青錢柳嫩葉保健酒中三萜類成分及種類高于青錢柳老葉保健酒的重要原因之一。但部分三萜類物質，隨著生長過程中時間的積累，含量會逐漸升高。總體而言，從三萜類物質的分析可以看出，嫩葉保健酒對人體更具有保健作用。

3 結論

通過液質聯用的鑒定結果表明，青錢柳嫩葉保健酒中含有11 種黃酮類物質，青錢柳老葉保健酒中含有7 種黃酮類物質，青錢柳老葉保健酒中含有的黃酮類物質，在青錢柳嫩葉保健酒中均含有。另外，在兩種保健酒中，青錢柳嫩葉保健酒中三萜類物質的成分以及大部分三萜類物質的相對含量，均高于青錢柳老葉保健酒。故從黃酮類及三萜類成分種類的角度分析，青錢柳嫩葉用于保健酒的制作優于青錢柳老葉，且所得的青錢柳嫩葉保健酒的保健效果優于青錢柳老葉保健酒。與此同時，通過液質聯用的方法對青錢柳保健酒的鑒定分析，證明了青錢柳保健酒中含有多種三萜類和黃酮類，而這兩種成分能對人體起到良好的保健作用，故表明用青錢柳葉制取保健酒可行，且為青錢柳保健酒具有保健效果提供有力依據。