酶水解法在大曲淀粉檢測上的應用研究

王軍凱，王衛東，蔣 明，代利平，黃祖耀

(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223700)

淀粉是一種高分子碳水化合物，是由葡萄糖聚合而成的多糖。在釀酒生產中，淀粉質糧食是重要的釀酒原料。作為釀酒生產的糖化發酵劑，大曲以大麥、小麥等為原料，粉碎后由人工控制適當的水分、溫度、疏松度等條件來選擇、富集有益微生物培育而成[1]。大曲的淀粉含量反映了大曲發酵的成熟程度，是評判大曲質量好壞的一個重要指標[2]。傳統的淀粉含量檢測方法為酸水解法。酸水解法檢測淀粉含量需用強酸作催化劑，檢測過程中還需用強堿中和多余的酸。在水解過程中，強酸會使半纖維素等一些非淀粉多糖水解為還原糖。因此，酸水解法更適用于淀粉含量較高的樣品[3]。

糖化酶，又稱葡萄糖淀粉酶，是一種單鏈酸性糖苷鍵水解酶，在發酵過程中通過水解糖苷鍵將淀粉逐步降解為葡萄糖，具有性能穩定、水解安全的優點[4-6]。根據糖化酶的水解原理，本研究通過對比大曲淀粉經酸水解和酶水解后的結果發現，酶水解法檢測大曲淀粉含量操作簡單，結果可靠，避免了強堿強酸的使用，可應用于大曲淀粉的日常檢測。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：大曲為釀酒車間使用曲，糖化酶（10萬U/g）由無錫市雪酶酶制劑科技有限公司提供。

試劑及耗材：斐林氏甲液、乙液、1 g/L 葡萄糖標準溶液、20 %（V/V）鹽酸溶液、20 %（W/V）氫氧化鈉溶液、可溶性淀粉。所用化學藥品均為分析純，均由國藥集團化學試劑有限公司提供。

儀器設備：TCS-100 型標準COD 消解器、分析天平、三角瓶、容量瓶、量筒、電爐、酸式滴定管。

1.2 酸水解法

1.2.1 檢測原理

淀粉在強酸和高溫作用下，葡萄糖苷鏈裂解，生成不同分子量的糖類聚合物，最終生成葡萄糖。酸水解后的溶液用堿中和至微酸性，按斐林氏法測定還原糖含量，最后折算為淀粉含量。

1.2.2 檢測步驟

1.2.2.1 試樣酸水解

準確稱取大曲樣品5.0 g 于250 mL 三角瓶中，加入20 %鹽酸溶液100 mL，將三角瓶放于消解器中高溫消解2 h。消解完成后取出三角瓶并冷卻，用20 %的氫氧化鈉溶液中和至微酸性（pH 試紙驗證），脫脂棉過濾至500 mL 容量瓶，濾液搖勻并定容。

1.2.2.2 試樣測定

空白試驗：準確吸取斐林氏甲液、乙液各5.0 mL于100 mL 三角瓶中，預先向三角瓶內加入葡萄糖標準溶液9.0 mL左右，混合均勻后將三角瓶放于電爐上加熱，沸騰后，緩慢滴入葡萄糖標準溶液，待三角瓶內藍色消失，記錄空白試驗消耗葡萄糖標準溶液量。

樣品試驗：樣品預滴定：準確吸取甲液、乙液各5.0 mL 以及1.0 mL 樣品濾液于100 mL 三角瓶中，混合均勻后將三角瓶放于電爐上加熱，沸騰后，緩慢滴入葡萄糖標準溶液，待三角瓶內藍色消失，記錄葡萄糖標準溶液消耗量；樣品滴定：準確吸取甲液、乙液各5.0 mL 以及1.0 mL 樣品濾液于100 mL三角瓶中，預先加入比預滴定少1.0 mL左右的葡萄糖標準溶液，混合均勻后將三角瓶放于電爐上加熱，沸騰后，緩慢滴入葡萄糖標準溶液，待三角瓶內藍色消失，記錄樣品試驗消耗葡萄糖標準溶液量。計算：

式中：V0——空白試驗消耗葡萄糖標準溶液量，mL；

V——樣品試驗消耗葡萄糖標準溶液量，mL；

C——葡萄糖標準溶液的濃度，g/L；

500——樣品濾液定容體積，mL；

1——滴定時溶液的取樣量，mL；

0.9——葡萄糖換算成淀粉的系數；

m——試樣質量，g。

1.3 酶水解法

1.3.1 檢測原理

糖化酶為糖苷鍵水解酶，在其最適反應條件下，促使淀粉中的糖苷鍵斷裂，最終生成葡萄糖。本試驗所使用的糖化酶由黑曲霉優良菌種經深層發酵精制而成，在其最適反應條件下，能將淀粉逐步水解轉化為葡萄糖，糖化效率高。為加速淀粉糖化，首先對淀粉進行加熱糊化，當淀粉糊化完全時，淀粉天然的半結晶結構完全轉變為無定型結構，此時淀粉更易被糖化酶水解。酶水解完成后，按斐林氏法測定還原糖含量，最后折算為淀粉含量。

1.3.2 檢測步驟

1.3.2.1 試樣酶水解

準確稱取大曲樣品5.0 g 于250 mL 三角瓶中，加入蒸餾水100 mL。樣品前處理采用高溫加熱，加快淀粉降解。待大曲溶液冷卻后，加入適量糖化酶（使用量按產品使用說明添加），將三角瓶放于恒溫水浴鍋中，調節水溫至糖化酶的最適反應溫度進行糖化（大曲溶液pH 值接近于糖化酶的反應pH 值）。糖化完成后（碘液驗證），脫脂棉過濾至500 mL容量瓶，濾液搖勻并定容。

1.3.2.2 試樣測定

操作步驟同1.2.2.2。

2 結果與分析

為了比較兩種方法檢測大曲淀粉結果的精密度和準確度，將大曲樣品平均分成6 份，即為樣品1、樣品2……樣品6。采用兩種方法分別檢測，每個樣品檢測2 次，并以各組數據的算術平均值作為樣品的真實值。檢測結果如表1所示。

表1 大曲淀粉檢測結果對比表 (%)

2.1 精密度的比較

精密度反映了重復檢測樣品時檢測結果的重現性，常用相對標準偏差來反映精密度的高低。相對標準偏差越小，說明重復檢測結果間的誤差越小。兩種方法檢測6 個樣品結果的絕對偏差如圖1所示。

圖1 大曲淀粉檢測結果絕對偏差對比圖

由圖1 可以看出，酶水解法檢測結果的絕對偏差低于酸水解法。其中酸水解法的相對標準偏差為1.83 %，酶水解法的相對標準偏差為1.38 %，說明酶水解法的精密度高于酸水解法。

2.2 準確度的比較

準確度是反映檢測結果接近于真實值的程度，常用相對誤差來表示準確度的高低。相對誤差越小，說明檢測結果越接近于真實值。兩種方法檢測6個樣品結果的相對誤差如圖2所示。

圖2 大曲淀粉檢測結果相對誤差對比圖

由圖2 可以看出，酶水解法檢測的6 組數據的相對誤差比酸水解法低，說明酶水解法的準確度要高于酸水解法。

2.3 加標回收試驗驗證

為進一步考察酶水解法的準確性，隨機選取3個大曲樣品，分別加入不等量的可溶性淀粉（烘干至恒重）做加標回收試驗。試驗結果如表2所示。

由表2 可以看出，酶水解法檢測結果的平均回收率為93.94%±1.12%，表明此方法檢測大曲淀粉含量的準確性較高。

表2 大曲淀粉回收結果對比表

2.4 實用性驗證

由表1 可知，酸水解法測定的淀粉含量為59.16 %±1.08 %，酶水解法測定的淀粉含量為58.67 %±0.81 %，相差為0.49 %。為分析酶水解法與酸水解法在檢測時產生的誤差是由偶然因素引起或是系統因素引起的,隨機選取10 個樣品，采用兩種方法分別檢測，檢測結果如圖3所示。

圖3 大曲淀粉檢測結果對比圖

由圖3 可以看出，酶水解法檢測結果與酸水解法檢測結果的誤差沒有規律性。為考察兩種方法檢測結果之間誤差的顯著性，采用MINITAB 軟件對10 組數據進行差異顯著性分析。結果如表3所示。

從表3 可以看出，在0.05 水平上，兩種方法差值的顯著性結果P 值為0.541，大于0.05，表明兩種方法檢測結果的差異性并不顯著，產生的誤差不是由方法本身帶來的。說明酶水解法檢測大曲淀粉含量可以用于實際生產上的檢測應用。

表3 差異顯著性分析結果

3 結論

通過對酸水解法和酶水解法在大曲淀粉檢測結果對比可以看出，在檢測精密度上，酶水解法的相對標準偏差小于酸水解法，檢測結果再現性更好；在檢測準確度上，酶水解法相對誤差小于酸水解法。兩種方法檢測結果的差異性并不顯著，酶水解法不存在系統誤差。在實際生產中，酶水解法避免了強酸強堿的使用，符合現代環保檢測的要求，在檢測大曲淀粉含量應用上具有重要的實用意義。