APG對(duì)糖尿病難治性潰瘍創(chuàng)面中MMP-1、MMP-9及IMP-1水平的影響

張靜，鄧娟

棗莊礦業(yè)集團(tuán)中心醫(yī)院老年病科，山東棗莊 277000

糖尿病的并發(fā)癥之一就是糖尿病潰瘍，臨床上治療糖尿病潰瘍的方法是局部潰瘍傷口敷料和壞死組織清創(chuàng)，但仍有約14%～20%的糖尿病性潰瘍患者在治療后被截肢[1-4]。因此,仍然需要不斷尋找一種更有效的療法來幫助治療糖尿病潰瘍。自體富血小板凝膠法主要是以患者自身的外周靜脈血為原料制得的富含自體血小板的血漿,再與凝血酶和鈣劑以特定比例進(jìn)行混合而成制得[5-6]。

近年來烷基糖苷(alkyl polyglycoside，APG）對(duì)糖尿病難愈性潰瘍慢性創(chuàng)面的愈合作用的治療研究逐漸增多，有研究表明，APG可用于治療糖尿病難愈性潰瘍[7]，但鮮見APG對(duì)創(chuàng)面蛋白水解環(huán)境影響的相關(guān)報(bào)道，其機(jī)制也不夠明確，有待進(jìn)一步研究。該研究共選取2019年6月—2020年5月在該醫(yī)院治療的糖尿病皮膚潰瘍的患者26例，旨在進(jìn)一步研究APG治療糖尿病難愈性潰瘍的相關(guān)影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在該院進(jìn)行因糖尿病皮膚潰瘍而住院的患者26例，根據(jù)隨機(jī)數(shù)表法將其隨機(jī)分為APG組和標(biāo)準(zhǔn)治療組。其中能夠獲取觀察到的時(shí)間節(jié)點(diǎn)完整肉芽組織的病例有25例(男15例，女10例)，其中APG組13例，標(biāo)準(zhǔn)治療組12例。兩組患者在接受診斷時(shí)首先采取了胰島素治療控制體內(nèi)血糖，在飲食治療方面進(jìn)一步嚴(yán)格控制高血壓及血脂并且在臨床研究期間定期進(jìn)行監(jiān)測(cè)，同時(shí)還要給予抗血小板、抗感染、營養(yǎng)神經(jīng)、促進(jìn)微循環(huán)改善等藥物治療；標(biāo)準(zhǔn)治療組對(duì)局部創(chuàng)面進(jìn)行切除腐壞性組織、切開腔隙引流減壓、使用敷料等手段進(jìn)行處理;APG組在標(biāo)準(zhǔn)治療的基礎(chǔ)上增加APG進(jìn)行治療，以創(chuàng)面愈合、轉(zhuǎn)骨科行皮瓣移植或截肢、自動(dòng)術(shù)后出院作為觀測(cè)終點(diǎn)，總觀測(cè)期為3個(gè)月。該課題的研究已得到了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的審核，所有受試者都同意且已簽署了相應(yīng)的知情同意書。

1.2 試劑與儀器

APG由該院制備。人MMP-1、MMP-9檢測(cè)試劑盒購自艾美捷Abnova公司;人TIMP-1 ELISA檢測(cè)試劑盒購自Abcam;BCA蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)；超聲均漿器購自美國Cole-Parmer;全波長酶標(biāo)儀儀器購自芬蘭thermoelectronoy;低溫離心機(jī)購自2008年美國版(beckman)。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)本收集及潰瘍面積測(cè)量APG組的患者，在其治療后的第0、3、6、9、15天分別取其創(chuàng)面內(nèi)的肉芽組織，標(biāo)準(zhǔn)治療組的患者在其治療后的第0、6、15天分別取其創(chuàng)面內(nèi)的肉芽組織。同時(shí)，在以上各個(gè)時(shí)間段進(jìn)行測(cè)量潰瘍表皮層的面積。將制作好的肉芽小塊組織快速置于-80℃冰箱中冷凍保存,備用。

1.3.2組織蛋白含量和MMP-1、MMP-9、TIMP-1測(cè)定使用BCA法進(jìn)行組織蛋白測(cè)定。組織在勻漿后取上清液，采用酶聯(lián)免疫法分別測(cè)定其中MMP-1、MMP-9及TIMP-1的濃度，具體根據(jù)試劑盒的說明進(jìn)行檢測(cè)，將其所測(cè)得的濃度除以該組織中的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算各100μg的組織中MMP-1、MMP-9及TIMP-1的蛋白質(zhì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)都進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理分析，資料以（±s）表示，非正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)經(jīng)對(duì)數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換后進(jìn)行t檢驗(yàn)。相關(guān)性的關(guān)系使用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般情況

APG組患者一共13例，其中男的有8例，女的有5例；平均年齡（57.4±17.3）歲；糖尿病平均病程(6.7±5.2)年；皮膚潰瘍病程(29.8±21.4)d；糖化血紅蛋白(HbA1c)為(11.3±3.7)%；13例臨床患者中發(fā)現(xiàn)有頸部潰瘍1例，腘窩膿瘍2例，糖尿病手2例，糖尿病足踝部潰瘍8例(Wagner2級(jí)2例，3級(jí)1例，4級(jí)5例)。臨床標(biāo)準(zhǔn)治療組12例，男8例，女4例；平均發(fā)病年齡(61.7±11.4)歲；糖尿病的平均病程(7.9±6.5)年；皮膚潰瘍病程(42±50.1)d；HbA1c(9.1±2.4)%；12例患者中有褥瘡3例，糖尿病足潰瘍9例(分別有Wagner 2級(jí)4例，Wagner 3級(jí)3例，Wagner 4級(jí)2例)。兩組臨床患者在發(fā)病年齡、糖尿病病程、皮膚潰瘍發(fā)展情況及HbA1c的一般數(shù)據(jù)資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05），數(shù)據(jù)資料呈非相對(duì)正態(tài)分布，經(jīng)過對(duì)數(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換后數(shù)據(jù)分析)。兩組患者于當(dāng)日入院后，血糖、血壓、血脂均基本可以有效控制并達(dá)到一個(gè)正常值，肝腎各項(xiàng)正常功能都基本可以有效控制并達(dá)到正常。

2.2 兩組患者治療效果比較

APG組有11例患者全部痊愈，2例患者病情好轉(zhuǎn)后轉(zhuǎn)骨科進(jìn)行了皮瓣移植術(shù)；標(biāo)準(zhǔn)治療組中有5例患者痊愈，4例病情好轉(zhuǎn)，2例因治療未見有效而自動(dòng)出院，1例因治療失敗轉(zhuǎn)骨科截肢/趾。

2.3 治療前后兩組患者的潰瘍愈合面積比較

兩組患者治療前口腔潰瘍面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。APG組的患者經(jīng)過APG治療后隨著其處理時(shí)間的增長而使?jié)兠娣e逐步減少，且其各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的潰瘍面積之間的對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；標(biāo)準(zhǔn)治療組患者在進(jìn)行治療后的第6天和第15天的口腔潰瘍面積均相對(duì)于治療前明顯縮小，且與APG組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 APG組及標(biāo)準(zhǔn)治療組在治療前后潰瘍面積比較[（±s），cm2]

表1 APG組及標(biāo)準(zhǔn)治療組在治療前后潰瘍面積比較[（±s），cm2]

注：*為與治療前比較，P＜0.05；#為APG組內(nèi)治療后各時(shí)間點(diǎn)比較，P＜0.05；&為與同組治療前和治療6 d比較，P＜0.05

組別治療前治療后3 d 6 d 9 d 15 d APG組（n=13）標(biāo)準(zhǔn)治療組（n=12）t值P值12.01±13.16 13.06±18.29 0.240 0.813（11.24±13.47）*# （10.47±11.75）*#10.42±14.18 0.015 0.988（9.47±11.49）*# （8.57±12.30）*#（9.54±10.11）&0.308 0.761

2.4 兩組在治療前后肉芽組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的濃度及MMP-9/TMP-1R的比較

APG組與標(biāo)準(zhǔn)治療組患者相比，治療前兩組患者的潰瘍內(nèi)肉芽組織中MMP-1、MMP-9及TIMP-1蛋白質(zhì)的濃度水平基本相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；標(biāo)準(zhǔn)治療組患者在進(jìn)行治療后第15天的潰瘍?nèi)庋拷M織中MMP-1水平明顯高于治療APG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩組間隔中MMP-9及TIMP-1水平分別在不同治療時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

在APG組中，肉芽組織中的MMP-1的蛋白質(zhì)濃度在治療后第3天 時(shí)有所降低，第6天時(shí)MMP-1蛋白質(zhì)水平略有輕微回升，至第15天時(shí),MMP-1蛋白質(zhì)水平明顯減少與第6天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在臨床治療過程中MMP-9濃度表現(xiàn)為隨著時(shí)間的延長而逐步下降的趨勢(shì)，但各個(gè)治療時(shí)間地點(diǎn)之間的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TIMP-1水平從第3天 開始在APG進(jìn)行治療后 開始逐步升高，第6天可以達(dá)到最大值，然而與治療前相比，從第6天 開始逐步下降，下跌至第15天 時(shí)其濃度略高于治療前的水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

標(biāo)準(zhǔn)治療組中，第6天 肉芽組織內(nèi)MMP-1蛋白濃度在治療后較治療前明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，肉芽組織內(nèi)的MMP-1蛋白的濃度于第15天明顯降低，但仍然遠(yuǎn)高于APG組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第15天MMP-9蛋白的濃度相對(duì)于治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；TIMP-1的濃度在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上基本保持相等的水平，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 兩組患者各時(shí)期創(chuàng)面肉芽組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的濃度及MMP-9/TIMP-1比較（±s）

表2 兩組患者各時(shí)期創(chuàng)面肉芽組織中MMP-1、MMP-9、TIMP-1的濃度及MMP-9/TIMP-1比較（±s）

注：*與同組第6天比較，P＜0.05；#與同組第0天比較，P＜0.05；&為與同時(shí)段的APG組比較，P＜0.05

組別指標(biāo)治療后0 d 3 d 6 d 9 d 15 d APG組（n=13）2.05±0.74 13.47±11.52 1.39±0.96 13.65±13.13 3.75±2.66 16.35±8.64 1.73±1.59 14.38±10.55標(biāo)準(zhǔn)治療組（n=12）MMP-1（ng/100μg）MMP-9（ng/100μg）TIMP-1（ng/100μg）MMP-9/TIMP-1 MMP-1（ng/100μg）MMP-9（ng/100μg）TIMP-1（ng/100μg）MMP-9/TIMP-1 t MMP-1值P MMP-1值t MMP-9值P MMP-9值t T1MP-9值P TIMP-9值t MMP-9/TIMP-1值P MMP-9/TIMP-1值2.68±1.89 21.54±14.76 1.18±0.53 18.25±13.92 2.46±1.27 19.83±10.92 1.24±0.73 18.37±11.66 0.355 0.363 0.340 0.369 0.232 0.410 0.024 0.491 3.75±2.66 15.37±13.58（2.49±0.86）#（11.69±13.13）#（4.52±2.73）#17.06±16.73 1.41±1.13 15.69±10.85 0.718 0.240 0.275 0.393 2.656 0.008 0.849 0.202（1.87±1.52）*13.28±10.04 1.88±1.37（9.69±7.63）#（3.54±2.03）&（12.25±6.73）#1.45±0.33（10.23±7.77）#2.297 0.017 0.313 0.379 1.170 0.130 0.176 0.431

2.5 兩組潰瘍?nèi)庋拷M織中MMP-9／TIMP-1比值的變化及與潰瘍愈合的關(guān)系

APG組患者的肉芽中的MMP-9／TIMP-1比值在治療后第6天 和15天 的濃度均明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在標(biāo)準(zhǔn)治療組中，MMP-9／TIMP-1濃度比值在治療后第15天 時(shí)明顯降低且濃度遠(yuǎn)低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但在不同治療時(shí)間點(diǎn)組間的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義(P>0.05)。肉芽細(xì)胞組織中的MMP-9／TIMP-1比值與潰瘍面積的大小之間呈現(xiàn)正相關(guān)的關(guān)系（r=0.315，P=0.001），提示MMP-9／TIMP-1比值與潰瘍的愈合程度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的關(guān)系。

3 討論

糖尿病的主要臨床并發(fā)癥之一的便是糖尿病潰瘍，同時(shí)它也是臨床上面臨的重要挑戰(zhàn)。目前，糖尿病潰瘍的診斷與分類標(biāo)準(zhǔn)主要依據(jù)wagner分類體系和德克薩斯大學(xué)糖尿病傷口分類體系[8]。局部潰瘍傷口敷料和壞死組織反復(fù)清創(chuàng)是糖尿病潰瘍的典型臨床治療方法，但是此方法的預(yù)后不理想[9]。基于炎癥或生長因子，已開發(fā)出幾種方法來治療糖尿病性傷口潰瘍[4]。臨床及非臨床科學(xué)研究表明，這些治療方法能夠有效地解決糖尿病傷口愈合患者生活中的多種因素，包括血管的形成、細(xì)胞增殖及新陳代謝生長因子的釋放等，但傷口創(chuàng)面愈合主要是由于多種因素的影響，需要發(fā)揮生長因子、細(xì)胞分裂、炎癥因子及其他細(xì)胞外基質(zhì)之間的平衡交互作用[10]。在該文中，進(jìn)一步探討當(dāng)使用APG治療糖尿病潰瘍時(shí)，肉芽組織中3種因子(MMP-1、MMP-9和TIMP-1)水平隨時(shí)間發(fā)展的變化。結(jié)果表明,兩組肉芽組織中MMP-1、MMP-9和TIMP-1水平在研究前均處于同一水平。經(jīng)APG治療后,與標(biāo)準(zhǔn)治療組患者相比，MMP-1水平有所降低,并且在第15天時(shí)明顯減少；MMP-9水平在APG組中出現(xiàn)了逐漸下降的變化趨勢(shì)，而在標(biāo)準(zhǔn)治療組中則出現(xiàn)了明顯的下降，兩組間的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；APG組的TIMP-1水平逐步增高，在第6天 達(dá)到了最高水平，而標(biāo)準(zhǔn)治療組的TIMP-1在整個(gè)治療期間幾乎都是處于同一個(gè)水平，兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；MMP-9／TIMP-1的水平有明顯減少，并且該比值與潰瘍面積呈正相關(guān)（r＝0.319）。

APG是一種可以通過離心、分析和濃縮患者外周靜脈血而獲得的富血小板(PRP)血漿，它是從整個(gè)全血中提取出，由PRP與一定比例鈣和凝血酶結(jié)合組成的凝聚物[11]。許多研究表明，APG可通過增加各種生長因子的濃度來促進(jìn)慢性傷口的愈合[12-13]。APG是一種廉價(jià)且免疫學(xué)上安全的生長因子來源(GFs)。APG可以有效地加速愈合的過程，因此APG已被廣泛應(yīng)用于傷口修復(fù)領(lǐng)域[14]。作為第二代血小板源制劑，APG還具有一些其他優(yōu)點(diǎn)，例如易于獲得材料，生產(chǎn)簡單，成本低，無不良反應(yīng)[15]。越來越多的證據(jù)表明，APG對(duì)慢性傷口比標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理/常規(guī)治療更有效[16]。有研究結(jié)果表明，與標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理/常規(guī)治療相比，APG可顯著提高糖尿病皮膚潰瘍患者的治愈率，縮短治愈時(shí)間并減少患者感染的發(fā)生率[17]。此外,APG的治療有可能會(huì)大大縮短患者的住院時(shí)間，減少住院成本，并在一定程度上減少不良事件的發(fā)生率[17]。該研究與上述研究一致，共說明APG對(duì)糖尿病難愈性潰瘍有一定的療效。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)實(shí)際上是一個(gè)工蛋白大家庭,因人類需要Ca2+、Zn+等離子來作為其輔助因子而得名，主要是由結(jié)締組織細(xì)胞,上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞合成和分泌[18]。在其功能上，Ca2+、Zn+不僅使患者可以在生理和病理過程中有效地抑制和降解幾乎所有的人體細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的成分,還可以有效地調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附，并直接或間接地參與正常的人體生理過程，例如胚胎的發(fā)育,組織重塑和傷口修復(fù)[19]。該文研究結(jié)果與相關(guān)報(bào)道的結(jié)果一致，共同說明MMP-1、MMP-9和TIMP-1對(duì)糖尿病的潰瘍起作用[20]。

已經(jīng)有一些研究發(fā)現(xiàn)APG可能對(duì)糖尿病慢性潰瘍中蛋白水解酶的失衡有潛在調(diào)控作用。許多研究表明，APG可通過增加各種生長因子的濃度來維持MMPs系統(tǒng)的平衡，并提供纖維蛋白網(wǎng)狀支架[21]。在一些糖尿病性潰瘍中，可能主要是由于細(xì)胞內(nèi)的生長因子降低，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解酶的活性普遍提升和特異性抑制藥物的降低[22]。研究中發(fā)現(xiàn)經(jīng)APG治療后，MMP-1和MMP-9均出現(xiàn)了逐漸降低的趨勢(shì),而TIMP-1逐漸升高，MMP-9/TIMP-1的共同作用導(dǎo)致比值降低。

在該文的研究中，在APG組和標(biāo)準(zhǔn)治療組中，肉芽組織中基質(zhì)蛋白水解平衡在進(jìn)行治療時(shí)的變化趨勢(shì)相似，但是使用APG對(duì)患者進(jìn)行治療并未顯著地表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。因此，此類研究仍需更多樣本量來證實(shí)這一觀點(diǎn)。此外，機(jī)體的修補(bǔ)過程還很有可能會(huì)涉及除了MMP-1、MMP-9外，其他一些MMPs以及中性白細(xì)胞彈性蛋白酶、絲氨酸蛋白酶等蛋白水解酶及其一些蛋白酶抑制劑，這些因子可能在糖尿病潰瘍的修補(bǔ)過程中也許發(fā)揮了一定的功效。因此，只是通過這項(xiàng)研究得出APG治療雖然可能對(duì)糖尿病慢性潰瘍中蛋白水解酶喪失的潛在影響有益，但是更多這種復(fù)雜的作用仍有待于進(jìn)一步的探索和研究。