miR-146a通過靶向調控Notch1抑制晶狀體上皮細胞間質轉化作用

劉文蘭，王莉，楊揚，閆瑾，朱丹，李怡琛

(西安醫學院醫學技術學院，陜西 西安 710021)

白內障指眼部晶狀體混濁，是世界上致盲的主要因素，占所有致盲病例的47.8%[1-3]。囊外晶狀體纖維摘除和人工晶狀體植入等手術是治療白內障的主要手段[4-5]。然而，白內障手術后可能導致繼發性晶狀體混濁，也稱為后囊膜混濁(posterior capsule opacification，PCO)，是術后最常見的并發癥[6-8]。術后殘留在前囊膜周邊部和赤道部的晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)增殖并遷移到后囊，并且進行上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是PCO發展中的一個關鍵過程[9-10]。LECs在EMT過程中失去上皮細胞的特征，包括上皮細胞的標志物E鈣粘蛋白(E-cadherin)的下調和間質標記物如α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)水平上升，從而獲得間充質特性，并合成細胞外基質[11]。因此，抑制EMT是治療PCO的關鍵環節。目前，microRNAs參與調節多種生理和病理過程已被學界普遍認同[12]。此外，最近的證據[13]表明，許多miRNA在晶狀體發育和白內障發生中發揮著重要作用。據報道[14-15]，MicroRNA-146a(miR-146a)是許多腫瘤包括胃癌、前列腺癌和乳腺癌的已知腫瘤抑制因子，并參與調節細胞增殖、遷移、凋亡和EMT等多種細胞生理和代謝機制。本研究擬探討miR-146a在調節LEC細胞EMT中的關鍵作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器設備

HLE-B3購自上海賽百慷公司；Dulbecco’s改良鷹培養基(Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM)培養基(Gibco，USA)、miR-146a的模擬物(miR-146a mimics)和陰性對照模擬物(miR-NC)均購自上海生工生物有限公司；轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、總核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取試劑盒(Tiangen，Beijing)、M-MLV逆轉錄酶、SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒、實時定量聚合酶鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)擴增產物由上海生工生物設計合成；放射免疫沉淀分析(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解緩沖液(Beyotime，Beijing)、抗Notch1抗體(Abcam公司)、抗α-平滑肌肌動蛋白抗體(美國CST公司)、抗E-鈣粘蛋白抗體(美國CST公司)、抗波形蛋白抗體(美國CST公司)、抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)的抗體(美國Proteintech)HRP標記二抗(北京Solarbio公司)、DAPI一抗(美國CST公司)、pmirGLO載體(Promega，USA)購自試劑代理公司。

1.2 細胞培養及細胞轉染

人晶狀體上皮細胞HLE-B3細胞株在10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM培養基、37 °C和5% CO2的MCO-18AC細胞培養箱中培養，待匯合度達到80%左右進行實驗。實驗分為對照組(Control組)、TGF- β處理組(TGF-β組)、TGF-β處理+miR-NC轉染組(TGF-β+miR-NC組)和TGF-β處理+miR164a mimics轉染組(TGF-β+miR146a mimics組)。miR-146a mimics序列為5’-CTT TGA GAA CTG AAT TCC ATG GGT TGT GTC AGT GTC AGA CC-3；miR-NC序列為5’-CAG CAG TTC TAT TAG ACT GTG TAT CTA AGC TTT GTT GTC CCT A-3。嚴格按照產品說明書進行規范操作，以Lipofectamine 2000對TGF-β+miR-NC組和TGF-β+miR14a mimics組的兩組HLE-B3細胞分別進行miR-NC和miR-146a mimics的轉染，轉染4 h后，根據分組需要將兩組轉染細胞和TGF-β組細胞與含有10 ng/mL TGF-β的HLE-B3細胞孵育48 h。單獨TGF-β誘導則以10 ng/mL TGF-β處理HLE-B3細胞48 h，收集細胞進行下一步的檢測和分析。

1.3 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)

收集處理的培養細胞，按照說明書操作步驟，以總RNA提取試劑盒提取總RNA，以M-MLV逆轉錄酶將提取的100 ng 總RNA逆轉錄為cDNA樣本。cDNA第一鏈的合成按照說明書進行，cDNA擴增的PCR反應程序：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒進行RT-qPCR，擴增體系20 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min，40個PCR循環(95 ℃ 10 s；55 ℃ 20 s；72 ℃ 34 s)。相關基因的mRNA表達以GAPDH為內參基因，micro-RNA以U6內參基因，讀取每個基因的Ct值，以2-ΔΔCt表示基因相對表達量。引物序列如表1所示。

表1 Real-time PCR 引物序列

1.4 Western blot

以含有蛋白酶抑制劑苯甲磺酰氟的RIPA裂解緩沖液對培養的LECs細胞進行細胞裂解物制備，參照既往研究中Western blot的標準流程進行操作[16]，根據BCA 蛋白定量試劑盒定量，然后在SDS-PAGE凝膠凝膠上進行電泳、分離，再轉入聚偏氟乙烯[poly(1,1-difluoroethylene)，PVDF]膜上轉膜，5%脫脂奶溶液室溫封閉2 h，添加一抗：抗Notch1(1∶1 000)、抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA，1∶500)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin，1∶500)、波形蛋白(1∶500)、抗GAPDH(1∶500)，4 ℃孵育過夜，次日PVDF膜恢復室溫后用TBST洗膜3次，每次8 min，分別加入二抗HRP標記二抗(1∶3 000)，室溫下孵育1 h，再次用TBST 洗膜3次，每次8 min，最后加電化學發光(electrochemiluminescence，ECL)顯影液顯影。GAPDH作為內參，采用Image J軟件分析結果。蛋白表達水平以與內參比值的平均灰度表示。

1.5 免疫熒光分析

處理培養后的LECs細胞在室溫下依次以4%多聚甲醛固定15 min，用0.1% tritonX-100通透處理30 min，再以1%山羊血清封閉15 min，與相應DAPI一抗(1∶200)以及抗α-SMA抗體(1∶200)4 ℃下孵育過夜，然后與相應的Cy3標記的二級抗體在37 ℃下孵育1 h。以DAPI進行核復染后，用抗熒光淬滅封片劑對細胞進行熒光猝滅，在400倍放大的熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.6 雙熒光素酶報告基因分析

通過使用TargetScan(http://www.targetscan.org)和miRDB(http://www.mirdb.org)生物信息學數據庫檢索miR-146a靶向目的基因Notch1的結合位點。在HEK 293 T細胞中構建雙熒光素酶基因報告分析。通過PCR擴增Notch1的野生型(WT)3′-UTR序列，并將其克隆到pmirGLO載體中，采用點突變法擴增Notch1突變株(MUT)3′-UTR序列(突變位點位于3′-UTR 序列242-263 region)，并克隆到pmirGLO載體中。使用Lipofectamine 2000試劑將pmirGLO-Notch1-3′-UTR-WT或pmirGLO-Notch1-3′-UTR-MUT與miR-146amimics或miR-NC共轉染到293 T細胞中。轉染48 h后，按照試劑盒說明書操作流程，通過雙熒光素酶報告試劑盒測量相對熒光素酶活性。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 TGF-β誘導的LECs細胞中miR-146a和Notch1表達變化

與正常對照組LECs細胞相比，TGF-β誘導LECs細胞后miR-146a表達水平降低，而Notch1的轉錄和蛋白表達水平增高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

2.2 microRNA-146a可抑制TGF-β誘導的LECs細胞EMT

Western blot檢測結果表明，TGF-β處理LECs細胞后，促進LECs細胞的間質標志物α-SMA、Vimentin表達上升，而上皮標志物E-cadherin表達下降(P<0.05)；而轉染miR-146a mimics后可抑制TGF-β誘導的α-SMA、Vimentin蛋白表達上升，并提升E-cadherin的表達水平(P<0.05)。見圖2。免疫熒光法發現，TGF-β誘導α-SMA在LECs細胞中的免疫反應性顯著增加，轉染miR-146a mimics后可顯著逆轉TGF-β誘導的EMT反應變化。見圖3。TGF-β可誘導LECs細胞的EMT，而miR-146a抑制了TGF-β誘導的LECs細胞EMT。

2.3 miR-146a通過靶向調控Notch1的表達

通過利用TargetScan Human 7.2(http://www.targetscan.org)生物信息學數據庫進行檢索發現，Notch1 mRNA的3′-UTR序列242-263預測是miR-146a的結合序列，提示Notch1可能是miR-146a的靶基因之一。采用雙熒光素酶報告基因進行靶向分析，結果顯示：當pmirGLO-Notch1-3′UTR-WT和miR-146a模擬物共轉染時，相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。此外，pmirGLO-Notch1-3′UTR-MUT和miR-146a模擬物共轉染不抑制熒光素酶的相對活性，確認miR-146a直接靶向Notch1 mRNA的3′UTR。見圖4。

3 討論

本研究利用TGF-β誘導LECs細胞建立PCO細胞模型，證明TGF-β誘導后LECs細胞發生EMT。早有研究[17]報道，TGF-β、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)等多種細胞因子可觸發EMT。且TGF-β被發現在白內障術后的房水中顯著升高，活化后的TGF-β對術后殘留LECs的增生、遷移和轉分化等細胞過程中起著關鍵性作用，是LECs在各種生理、病理過程中最重要的調節因子之一[18]。Zavadil等[19]報道，TGF-β呈劑量和時間依賴性地誘導LECs細胞通過TGF-β/Smad信號通路的激活，促使LECs細胞的EMT發生。而本研究顯示LECs細胞經TGF-β誘導后胞漿中的間質標記物α-SMA顯著表達上升，利用Western blot進一步分析細胞蛋白表達水平，結果發現TGF-β誘導后LECs細胞中不僅間質標記物α-SMA、Vimentin表達上升，且上皮標志物E-cadherin顯著下降，表明LECs細胞表現出失去細胞極性而向間質纖維化轉變，獲得間質特征。綜合既往研究結果，提示TGF-β在LECs細胞EMT中發揮關鍵作用，從而參與PCO的發生。

miR-146a通常被認為涉及調控腫瘤細胞的分化、增殖、遷移和凋亡等多種生理過程[20]。但也有越來越多的證據[21]表明，miR-146a參與包括白內障等在內的各種眼部疾病發病和進展機制。有研究[22]顯示，miR-146a與血管性眼科疾病有關，在濕性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)患者的視網膜內皮細胞中miR-146a顯著上調，并通過參與調節補體因子H(complement factor H，CFH)介導的炎癥影響發揮作用[23]。而Poe等[24]通過整合轉錄組和蛋白質組分析揭示了miR-146a通過Notch信號在人角膜緣上皮中介導傷口愈合、炎癥、干細胞維持和分化等調節作用。而本研究首次發現，miR-146a在TGF-β誘導的LECs細胞中表達下降，而轉染miR-146a mimic能明顯抑制TGF-β誘導的LECs細胞中EMT相關蛋白的表達，提示miR-146a可能參與白內障術后PCO的發生過程，并且miR-146a通過抑制TGF-β誘導的LECs-EMT來發揮關鍵作用。

此外，本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗發現，Notch1是miR-146a的靶基因之一。Notch1屬于Notch蛋白家族，Notch1蛋白激活可通過介導多種EMT相關基因的表達從而誘導EMT的發生[25]。抑制Notch1激活可減弱TGF-β誘導的EMT，表現為E-cadherin表達減少，而α-SMA、snail等表達增加[26]。Notch信號在PCO發病機制中也起著重要作用。Han等[27]表明，miR-34a通過靶向Notch1能抑制LECs細胞的EMT發生，并且利用Notch1的小分子抑制劑DAPT也可以有效抑制TGFβ誘導后LECs細胞中α-SMA、Vimentin、纖連蛋白(fibronectin，FN)的表達上升，從而減輕LECs細胞中TGFβ誘導的EMT。而本研究發現，當利用TGFβ刺激LECs細胞后，不但miR-146a表達水平下降，且Notch1的轉錄和表達水平均明顯上升，提示miR-146a和 Notch1可能參與TGF-β誘導的LECs-EMT。結合miR-146a可以通過靶向調控Notch1，推測miR-146a抑制TGF-β誘導的LECs-EMT發生，可能是通過靶向調節Notch1的表達水平來實現。

綜上所述，miR-146a通過靶向調節Notch1的表達，抑制Notch1信號通路的激活，從而阻斷TGF-β誘導的LECs-EMT，為臨床預防和治療白內障術后PCO發生提供了一個新的理論策略途徑。