TLRs及其下游炎性因子在潰瘍性結腸炎早期診斷及預后評估中的價值分析

刁凌云，皇金萍，陳洋，孫唱，王勝英，羅玉國，葛飛

(1．南京中醫藥大學徐州附屬醫院消化內科，江蘇 徐州 221000；2．揚州大學醫學院附屬海安市中醫院消化科，江蘇 海安 226600)

潰瘍性結腸炎(ulcreative colitis，UC)是一種侵襲腸道粘膜的慢性炎癥和潰瘍性病變，臨床表現包括血性腹瀉、腹痛、里急后重、嘔吐等，偶爾表現為關節炎、虹膜睫狀體炎和肝功能障礙等[1]。UC以病情遷延不愈、緩解和復發交替為特征，使臨床診斷面臨巨大挑戰。尋求準確且高效的監測手段對早期發現UC，并采取有效措施治療降低臨床復發率、改善疾病預后十分重要[2]。

免疫反應是造成炎癥加重及組織損傷的關鍵，由于核轉錄因子κB(NF-κB)核內與kB序列結合可影響多種炎性因子如腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)和IL-10表達，故NF-κB與炎性反應、細胞增殖等關系密切[3]。炎癥反應在UC的發生發展中占據主要地位，Toll樣受體家族(TLRs)分布于不同的免疫細胞表面。研究[4]發現，TLR2、TLR4在UC中表達升高，而TLR1水平則未見明顯波動。由于TLR4可通過LPS下游MyD88依賴性及非依賴性信號轉導通路來多種炎性因子分泌，故TLR4介導的信號通路被認為是UC發病的重要因素[5]。髓過氧化物酶(MPO)是存在于中性粒細胞的一種過氧化物酶，具有使過氧化氫還原的能力，可定量反應組織炎性損傷的程度[6]。本研究通過檢測UC患者TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性，分析各指標在UC早期診斷及預后評估中的價值，為臨床治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年7月至2021年6月南京中醫藥大學徐州附屬醫院收治的108例UC患者為研究對象，并設為研究組；另選102例同期于本院進行腸鏡檢查未見異常患者為對照組。研究組中，男性58例，女性50例；年齡25～65歲，平均(41.33±8.98)歲；病程5～31個月，平均(23.41±4.25)個月；主要病變位置：乙狀結腸36例，直腸34例，左半結腸22例，全結腸16例。對照組中，男性54例，女性48例；年齡24～62歲，平均(41.65±8.37)歲。本研究已獲得院倫理委員會批準，所有研究對象均簽署知情同意書。兩組患者性別、年齡等比較，差異無統計學意義(P>0.05)。UC患者參考Mayo評分[7]評估疾病臨床活動度，并分為活動期組(總分3～12分，n=70)及緩解期(評分<2分，n=38)；參考Sutherland疾病活動指數(disease activity index，DAI)[8]對活動期患者進行分級，并分為輕度組(n=21)、中度組(n=27)及重度組(n=22)，依據預后分為預后良好組(n=44)及預后不良組(n=26)。納入標準：(1)UC納入標準參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2018年，北京)》[9]；(2)入組前2月內均未接受相關系統性治療者；(3)臨床資料完整。排除標準：(1)合并其它感染性結腸炎、腸阿米巴病等；(2)合并惡性腫瘤；(3)合并重要器官功能障礙；(4)合并其它免疫系統疾病。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集所有研究對象年齡、性別、疾病活動情況、臨床表現、DAI評分、內鏡表現等。并根據蒙特利爾分型區[10]分各UC患者病變位置，其中E1代表病變僅存在于直腸；E2代表病變累及左半結腸；E3為廣泛病變累及脾曲乃至全結腸。另根據受累腸段最嚴重處的血管紋理、出血情況、糜爛和潰瘍計算潰瘍性結腸炎內鏡下嚴重程度指數(ulcerative colitis endoscopic index of severity，UCEIS)[11]評分，其中2～6分為內鏡下輕、中度活動度，7分或8分為內鏡下重度活動度。見表1。

表1 UCEIS評分細則

1.2.2 TLR2、TLR4、NF-κB 蛋白表達水平檢測 所有患者進行結腸鏡檢查，并在結腸炎癥最明顯處取活檢粘膜及適量組織，進行固定。采用免疫組織化學法檢測各組結腸組織中TLR2(美國Santa Cruzsc公司，貨號：P4052Rb-h)、TLR4(美國Santa Cruzsc公司，貨號：P4051Rb-h)、NF-κB(上海貝博生物，貨號：YT746)蛋白表達強度，連續切片5張(4～5 μM)，對石蠟切片常規脫蠟，水化，封閉，脫水，熱修復抗原，PBS液洗滌兩次(5 min/次)。滴加5%正常山羊血清，滴加均為1∶2 000稀釋的TLR2、TLR4多克隆抗體50 μL于不同切片上，PBS沖洗3次，5 min/次。將載玻片從冰箱中取出，孵育(37 ℃，30 min)，PBS沖洗3次；甩干后滴加試劑1(生物素標記山羊抗兔IgG)，再次孵育、沖洗，滴加試劑2(辣根酶標記的鏈霉卵白素工作))，PBS沖洗3次，5 min/次；最后DAB進行顯色。日本OLMPUS公司顯微攝像系統進行觀察，在所有切片上下左右及中央部位隨機選取5個視野圖片，以染色呈棕褐色或者棕黃色沉淀為陽性細胞標志， Image Pr0 Plus 6.0圖像分析系統(美國MediaCybemetics公司)進行半定量分析，測定組織TLR2、TLR4陽性細胞的IOD值。

1.2.3 炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-10水平檢測 采用放射免疫分析法檢測各組血清IL-1β、TNF-α、IL-10水平。設備為FI-2003/2008ps全自動γ放射免疫計數器，IL-1β、TNF-α、IL-10放射免疫分析試劑盒購自北京福瑞生物工程公司，貨號分別為ML-Elisa-0378、ML-Elisa-1420、BJ-R64865。嚴格按照試劑操作說明書完成試驗。

1.2.4 MPO活性檢測 參照邱重陽[12]研究方法，并進行改進。取出的結腸組織以10%甲醛固定，石蠟包埋后切為4 μL薄片，HE染色，通過過供氫體鄰連茴香胺供氫后生成黃色化合物，在460 nm處通過比色測定A產物的生成量，從而推算出MPO的活力。計算公式：MPO(u/g)=測定管OD值-對照管OD值/0.113。

1.2.5 預后隨訪 根據《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012 年廣州)》[13]對 UC 患者進行標準化治療 ，治療兩個月后由同一名醫師復查腸鏡，鉗取原病變位置組織，采用Mayo內鏡評分[9]對粘膜愈合情況進行評估，并將Mayo內鏡評分為0分者納入預后良好組，Mayo內鏡評分≥1分者納入預后不良組。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 研究組活動期和緩解期患者與對照組TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性比較

研究組活動期組、緩解期患者及對照組TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α水平及MPO活性比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，且活動期組>緩解期組>對照組；IL-10水平和活動期組<緩解期組<對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2、圖1、圖2及圖3。

表2 研究組活動期和緩解期患者與對照組TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性及比較

2.2 活動期組中不同病情程度患者TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性比較

輕度組、中度組及重度組TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α水平及MPO活性比較，差異有統計學意義(P<0.05)，且重度組>中度組>輕度組；IL-10水平與重度組<中度組<輕度組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同病情程度組患者TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性比較

2.3 影響UC患者預后的單因素分析

單因素分析結果顯示，預后不良組病理組織分級、UCEIS評分、DAI評分分級、TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性與預后良好組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；而兩組間性別、年齡、病程、病變位置比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 影響UC患者預后的單因素分析

2.4 影響UC患者預后的多因素分析

Logistics回歸分析結果顯示，UCEIS評分>6分、TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、MPO活性升高及IL-10水平降低是影響UC患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響UC患者預后不良的Logistic回歸分析

2.5 TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10、MPO活性及UCEIS評分、DAI評分分級預測UC預后不良的價值

ROC曲線分析顯示， TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10、MPO活性、UCEIS評分及DAI評分分級聯合預測UC患者預后的曲線下面積(AUC)大于單項，差異有統計學意義(P<0.05)。見表6。

表6 TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10、MPO活性、FD4水平及UCEIS評分、DAI評分分級預測UC預后不良的價值

3 討論

UC是多種因素引起的腸道免疫系統對內部菌群免疫耐受的失衡，主要累及結腸粘膜及粘膜下層[14]。目前UC的臨床診斷主要依靠臨床癥狀、輔助檢查(纖維結腸鏡檢、氣鋇灌腸雙重對比造影)及相關量表評分等[15]。UCEIS評分是評估UC內鏡下嚴重程度的一種量表型工具，可評估患者血管模式、出血和糜爛、潰瘍狀況[16]。一項最新研究[17]顯示，應用UCEIS可準確評估UC的總體內鏡下嚴重度。由于UC具有反復發作的特點，單純應用內鏡檢查對鑒別UC存在一定局限性，故尋求更多的指標評估臨床治療效果及預后對減輕患者負擔有重要意義。盡管UC的確切發病機制仍存在爭議，但細胞因子在其中發揮的作用已得到公認，這也為臨床診斷和治療提供了新的思路。

免疫異常為UC的主要因素之一，不僅可破壞患者原有的腸粘膜功能，還會引起其它腸外并發癥，嚴重影響預后。TLRs是一種跨膜受體和信號轉導受體，該受體可以通過識別保守的微生物蛋白質/DNA 基序或病原體相關分子模式，可識別不同的病原微生物。腸粘膜持續的損傷可使TLR4-CD14陽性的巨噬細胞聚集，增加UC對LPS等配體的敏感性，從而觸發TLR4/NF-κB信號通路，造成大量NF-κB的出現[18]。近年有研究[19]發現，NF-κB是腸道慢性炎癥發生和加重的因素之一，原因在于NF-κB可改變腸粘膜中致炎細胞因子和抑炎細胞因子的表達，導致炎癥反應持續發生，進而造成上皮細胞的凋亡。張穎慧等[20]探討了Toll樣受體在UC組織中的表達變化及與組織中炎性細胞因子表達的關系，發現UC患者結腸粘膜TLR2、TLR4蛋白表達陽性率遠高于正常者，認為Toll樣受體的異常表達與UC的發生及炎癥反應程度加重關系密切。本研究與上述結果相似，且多因素Logistics回歸分析結果顯示，TLR2、TLR4、NF-κB表達升高是影響UC患者預后不良的獨立危險因素(P<0.05)，進一步提示各種病原微生物觸發TLRs信號通路過度活化可能是UC發病和的始動因素之一，可通過檢測UC患者TLR2、TLR4、NF-κB表達變化對病情進展及預測預后轉歸做出預測。

UC患者由于腸道菌群失調，宿主腸黏膜對革蘭陰性菌的脂多糖的耐受性被打破，由于TLR4與革蘭陰性菌的脂多糖關系密切，導致結腸粘膜上皮細胞及固有層細胞大量表達TLR4，進而激活下游的細胞因子(NF-κB等)大量釋放自由基，加重黏膜損傷。同時，腸腔內的抗原物質亦可經上皮細胞，參與免疫反應，加劇炎癥程度，形成惡性循環，因此TLR4的表達水平與UC患者炎癥反應相關。另外，激活的NF-κB亦可激活TLR2轉錄表達，形成TLR2-NF-κB-TLR2循環。此外，細胞因子在UC患者的變化亦值得關注。本研究結果顯示，UC患者中活動期組IL-1β、TNF-α水平較對照組高(P<0.05)，IL-10水平較緩對照組低(P<0.05)，且三者水平變化與病情嚴重程度呈相關性(P<0.05)。在炎癥反應中，IL-1β、TNF-α是促炎細胞因子，IL-10則是常見的抑炎細胞因子，三者通過控制炎癥發應進展，參與UC的發生、發展。

MPO是中性粒細胞中含量較高的一種酶，腸粘膜MPO活性是監測UC活動性的常用指標之一[21]。本研究結果顯示，UC組織中MPO表達高于正常組(P<0.05)，且在重度組患者中更為顯著(P<0.05)，提示MPO活性可反映結腸組織的病理損害程度，對于UC的早期診斷及預后評估有指導意義。此外，腸粘膜屏障是保證腸道功能正常運行的重要組成部分，在感染、創傷等應激反應發生時，腸粘膜屏障將受到不同程度損傷，造成通透性的改變，引起細菌移位及炎癥反應[22]。因此，明確腸粘膜屏障功能的改變，對明確UC的發生及判斷炎癥進展有一定價值。本研究推測TLR2、TLR4、NF-κB、IL-1β、TNF-α、IL-10及MPO活性及具有預測UC預后不良的價值，經繪制ROC曲線論證，結果顯示，各指標AUC以聯合檢測最大，提示臨床在傳統手段基礎上，增加多項細胞因子的檢測可提高預測UC患者預后的靈敏度。

綜上所述，Toll-TLRs、炎性因子、NF-κB及MPO活性在UC患者中呈顯著異常表達，各指標與患者病情嚴重程度關系密切，聯合檢測各指標可作為早期診斷UC及預測患者預后的有效指標。