基于p38 MAPK通路探討盤龍七片對膝骨關節炎模型大鼠的治療作用與可能機制

時超，譚亮*，孫春生，陳繼平，孟建國

（1. 南京中醫藥大學附屬徐州市中醫院，江蘇 徐州 221003；2. 陜西盤龍藥業集團股份有限公司，陜西 西安 710025）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是骨科的常見疾病［1］。KOA 發病率及致殘率正呈逐年增長趨勢，預計到2030年，歐洲及美國將有1/5 的人口罹患KOA［2］。目前研究認為，關節軟骨異常炎癥反應是導致KOA 患者關節組織發生病變的重要原因之一［3］。p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK）信號通路可介導炎癥通路活化，并參與KOA的發生、發展過程［4］。

盤龍七片可活血化瘀、祛風除濕、消腫止痛，臨床上常用于治療風濕性關節炎、腰肌勞損、骨折及軟組織損傷等［5］。近來研究發現，盤龍七片可通過抑制軟骨細胞凋亡、抑制炎癥因子釋放從而治療KOA［6］，但盤龍七片抑制軟骨細胞凋亡和促炎因子釋放的具體分子生物學機制尚不明確。本研究基于p38 MAPK信號通路，探討盤龍七片對KOA模型大鼠軟骨組織病變的影響與可能的分子生物學機制，以期為臨床合理用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物

清潔級SD雄性大鼠60只，體質量200～220 g，6～7 周齡，購自于斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，批號：SCXK（京）2016－0002。所有大鼠于本院動物房中飼養，實驗動物遵循3R原則。

1.1.2 主要試劑及儀器

盤龍七片（陜西盤龍藥業集團股份有限公司，批號：20190320005）；茴香霉素（上海信裕生物科技有限公司，貨號：XY－01323）；HE 染色試劑盒（上海生物公司，貨號：E677218－0200）；腫瘤壞死因子（TNF－α）及白細胞介素－1β（IL－1β）等ELISA 試劑盒（上海振譽生物科技有限公司、上海心語生物科技有限公司，貨號：EL－R0019、SY－2235）；p38 MAPK 磷酸化蛋白（pp38 MAPK）、核轉錄因子κB（NF－κB）磷酸化蛋白（p－NF－κB）等兔抗大鼠免疫組化用抗體（貨號：ab4822、ab194726）、Ⅱ型膠原（COL2）（貨號：ab168356）、解聚蛋白樣金屬蛋白酶－4（ADAMTS－4，貨號：ab84792）、基質金屬蛋白酶－13（MMP－13，貨號：ab51072）、水通道蛋白3（AQP3，貨號：ab125219）、凋亡蛋白－半胱天冬酶（Caspase－3，貨號：ab184787）抗體等（美國abcam 公司）；SMZ745光學顯微鏡（日本尼康公司）。

1.2 方法及觀察指標

1.2.1 大鼠分組、建立KOA模型及給藥

全部60 只SD 大鼠按隨機數字表分為正常對照組、模型組、盤龍七片組、p38 MAPK 抑制劑組（SB203580 組）、p38 MAPK 激動劑組（茴香霉素組）和盤龍七片+茴香霉素組，每組各10只。除正常對照組外，對其余各組大鼠進行造模。參照文獻［7］方法取大鼠，麻醉后用1 mL 注射器將50 μLⅡ型膠原酶溶液于右后側膝關節處注入關節腔內，4 d 后重復上述操作，7 d 后觀察大鼠行為變化，若大鼠右后肢出現收縮、跛行等現象，視為造模成功。正常對照組大鼠則于關節腔內注射等體積的生理鹽水。

參照文獻［7］設置盤龍七片組給藥劑量為1.29 g/kg（相當于成人等效劑量的10 倍），將盤龍七片用生理鹽水稀釋成濃度為0.129 g/mL 混懸液，按10 mL/kg 灌胃給藥；參照文獻［8］設置茴香霉素組及SB203580 組給藥劑量分別為5 mg/kg 和10 μL/只，茴香霉素及SB203580 均于大鼠右后肢膝關節處經皮下注射給藥，每3日注射1 次；盤龍七片+ 茴香霉素組大鼠給予盤龍七片混懸液10 mL/kg 灌胃，同時膝關節皮下注射茴香霉素溶液10 μL/只；正常對照組與模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，各組均連續給藥14 d。

1.2.2 大鼠一般行為觀察及LequesneMG行為學評分

末次給藥并禁食禁水12 h 后，觀察各組大鼠局部按壓疼痛反應、步態等行為學變化，并參照文獻［9］進行LequesneMG 行為學評分。評分時，由同一名不知情的非本實驗人員進行評分并記錄總分，各組大鼠取總分平均值進行比較。

1.2.3 大鼠膝關節腫脹程度測量及病理變化

采用電子數字顯示游標卡尺測量大鼠膝關節直徑，評估膝關節腫脹情況。麻醉處死大鼠，解剖膝關節，肉眼觀察關節病理變化。

1.2.4 HE染色檢測軟骨組織病理變化

迅速剝離并取出大鼠右后肢整個膝關節軟骨組織，剪取部分組織置于－80 ℃冰箱中保存，剩余軟骨組織迅速置于4%中性多聚甲醛中固定24 h 后，用乙二胺四乙酸溶液脫鈣處理并制備成5 μm切片，取部分切片按HE 試劑盒說明書進行染色，光鏡下觀察組織形態變化。參照文獻［10］用Mankin's評分表對組織病理損傷程度進行評分。

1.2.5 免疫組化染色法檢測軟骨組織中p－p38 MAPK、p－NF－κB表達水平

取剩余軟骨組織石蠟切片，脫蠟及抗原修復后，加入一抗抗體（p－p38 MAPK、p－NF－κB，1∶800）4 ℃孵育過夜，后加入羊抗兔二抗（1∶1 000）室溫孵育4 h，DAB 顯色，蘇木精復染、封片后，于光鏡下觀察拍照，用Image Pro Plus 5.0圖像分析系統分析單位面積陽性染色區的平均光密度值。

1.2.6 ELISA 法檢測軟骨組織中炎性因子IL－1β、TNF－α水平

取“1.2.4”中保存于－80 ℃的軟骨組織，4 ℃解凍后，冰上勻漿，3 000 r/min 離心分離15 min 后，取勻漿液，按ELISA 試劑盒說明書方法檢測IL－1β、TNF－α水平。

1.2.7 Western Blot 法檢測AQP3、Caspase－3、COL2、ADAMTS－4、MMP－13和IL－1β蛋白相對表達水平

取“1.2.6”中剩余勻漿液，用蛋白提取及BCA 法提取并測蛋白總濃度后，取50 μg 蛋白上樣，進行電泳和轉膜反應，加入一抗抗體（AQP3、Caspase－3、COL2、ADAMTS－4、MMP－13、IL－1β、β －actin 內 參，1∶1 000）4 ℃搖床孵育過夜，后加入HRP 羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，用增強化學發光法顯色，以化學發光儀觀察條帶并拍照，以Image－J 軟件分析測定蛋白相對表達。

1.3 統計學分析

采用SPSS22.0 軟件對所得實驗數據進行統計學分析，以均數±標準差（±s）表示計量資料，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩組間比較行SNK－q檢驗，P<0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為學評分結果比較

正常對照組大鼠跑動正常，無跛行。與正常對照組相比，模型組大鼠右后肢收縮痙攣、跛行明顯，行為學評分升高（P< 0.05）。與模型組相比，盤龍七片組及SB203580 組大鼠跛行明顯改善，行為學評分降低（P<0.05）；茴香霉素組大鼠右后肢跛行嚴重，大部分不能參與行走，行為學評分升高（P<0.05）；而盤龍七片+ 茴香霉素組上述指標變化與盤龍七片組相反（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠行為學評分結果（±s，分）

表1 各組大鼠行為學評分結果（±s，分）

注：與正常組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；與盤龍七片組比較，△P<0.05。

組別正常對照組模型組盤龍七片組SB203580組茴香霉素組盤龍七片+茴香霉素組n 10 10 10 10 10 10行為學評分0.02±0.00 4.08±0.04*2.02±0.02#2.02±0.02#5.53±0.04#△4.03±0.04△

2.2 各組大鼠膝關節腫脹程度及大體觀察結果比較

正常對照組大鼠膝關節情況正常。與正常對照組相比，模型組大鼠膝關節腫脹，關節軟骨無光澤，色稍黃，關節液增多，軟骨表面裂紋、糜爛及潰瘍增多，膝關節直徑增大（P< 0.05）。與模型組相比，盤龍七片組及SB203580組大鼠右后肢膝關節軟骨表面粗糙，呈毛刺狀，部分出現裂紋、糜爛及潰瘍，膝關節直徑減小（P< 0.05）；茴香霉素組大鼠右后肢膝關節軟骨表面裂紋、糜爛及潰瘍增多，且部分直達骨質，軟骨下骨暴露較多，膝關節直徑升高（P<0.05）；盤龍七片+茴香霉素組上述指標變化與盤龍七片組相反（P< 0.05）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠膝關節損傷大體觀察圖

表2 各組大鼠膝關節直徑檢測結果（±s，mm）

表2 各組大鼠膝關節直徑檢測結果（±s，mm）

注：與正常組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；與盤龍七片組比較，△P<0.05。

組別正常對照組模型組盤龍七片組SB203580組茴香霉素組盤龍七片+茴香霉素組n 10 10 10 10 10 10膝關節直徑11.02±0.15 12.98±0.16*11.03±0.13#11.12±0.14#13.53±0.16#△12.93±0.16△

2.3 各組大鼠軟骨組織HE染色結果比較

正常對照組大鼠軟骨組織無明顯病理學改變。與正常對照組相比，模型組大鼠軟骨組織壞死脫落，原有結構及潮線破壞，壞死區殘留少量軟骨細胞，有大量纖維組織增生，Mankin's評分升高（P<0.05）。與模型組相比，盤龍七片組及SB203580組大鼠軟骨表面局部粗糙不平、潰瘍減少，移行層水腫、變形，在壞死區兩側可見軟骨基質，染色不一，Mankin's評分降低（P<0.05）；茴香霉素組軟骨組織壞死脫落現象增多明顯，Mankin's評分升高（P<0.05）；盤龍七片+茴香霉素組上述指標變化與盤龍七片組相反（P<0.05）。見表3、圖2。

圖2 各組大鼠軟骨組織HE染色結果（×200）

表3 各組大鼠病理損傷程度Mankin's評分結果（±s，分）

表3 各組大鼠病理損傷程度Mankin's評分結果（±s，分）

注：與正常組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；與盤龍七片組比較，△P<0.05。

組別正常對照組模型組盤龍七片組SB203580組茴香霉素組盤龍七片+茴香霉素組n 10 10 10 10 10 10 Mankin's評分1.02±0.19 7.68±0.26*4.93±0.23#5.02±0.24#8.53±0.25#△7.66±0.26△

2.4 各組大鼠軟骨組織IL－1β、TNF－α水平結果比較

與正常對照組相比，模型組大鼠軟骨組織IL－1β、TNF－α 水平升高（P< 0.05）。與模型組相比，盤龍七片組及SB203580 組大鼠軟骨組織IL－1β、TNFα水平降低（P<0.05）；茴香霉素組大鼠軟骨組織IL－1β、TNF－α 水平進一步升高（P<0.05）；盤龍七片+茴香霉素組上述指標變化與盤龍七片組相反（P<0.05）。見表4。

表4 各組大鼠軟骨組織IL－1β、TNF－α水平比較（±s，n=10）

表4 各組大鼠軟骨組織IL－1β、TNF－α水平比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；與盤龍七片組比較，△P<0.05。

組別正常對照組模型組盤龍七片組SB203580組茴香霉素組盤龍七片+茴香霉素組IL－1β（pg/g）148.32±14.98 326.58±17.95*184.86±16.52#185.62±15.04#487.63±17.25#△325.13±17.93△TNF－α（pg/g）29.46±5.91 102.08±8.03*46.07±7.21#48.96±6.04#192.99±9.33#△101.39±8.02△

2.5 各組大鼠軟骨組織p－p38 MAPK、p－NF－κB陽性表達結果比較

免疫組化染色結果顯示，正常對照組大鼠軟骨組織中p－p38 MAPK、p－NF－κB 呈弱陽性表達。與正常對照組相比，模型組大鼠軟骨組織中p－p38 MAPK、p－NF－κB 陽性表達升高（P<0.05）。與模型組相比，盤龍七片組及SB203580 組大鼠p－p38 MAPK、p－NF－κB 陽性表達降低（P< 0.05）；茴香霉素組軟骨細胞p－p38 MAPK、p－NF－κB 陽性表達進一步升高（P<0.05）；盤龍七片+茴香霉素組上述指標變化與盤龍七片組相反（P<0.05）。見圖3、表5。

表5 各組大鼠軟骨組織p－p38 MAPK、p－NF－κB陽性表達比較結果（±s，n=10）

表5 各組大鼠軟骨組織p－p38 MAPK、p－NF－κB陽性表達比較結果（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P < 0.05；與模型組比較，#P < 0.05；與盤龍七片組比較，△P<0.05。

組別正常對照組模型組盤龍七片組SB203580組茴香霉素組盤龍七片+茴香霉素組p－p38 MAPK（平均光密度/mm2）0.32±0.03 2.08±0.21*1.03±0.13#1.02±0.14#2.83±0.22#△2.06±0.21△p－NF－κB（平均光密度/mm2）0.22±0.02 2.17±0.20*1.33±0.13#1.32±0.14#2.96±0.23#△2.19±0.20△

圖3 各組大鼠軟骨組織p－p38 MAPK、p－NF－κB陽性表達染色結果（×400）

2.6 各組大鼠軟骨組織COL2、ADAMTS－4、MMP－13、AQP3、Caspase－3蛋白表達結果

與正常對照組相比，模型組大鼠軟骨組織中ADAMTS－4、MMP－13、AQP3、Caspase－3 蛋白表達升高（P< 0.05），COL2 蛋白表達降低（P< 0.05）。與模型組相比，盤龍七片組及SB203580 組大鼠ADAMTS－4、MMP－13、AQP3、Caspase－3 蛋白表達均降低（P<0.05），COL2 蛋白表達升高（P<0.05）；茴香 霉 素 組 大 鼠 ADAMTS－4、MMP－13、AQP3、Caspase－3 蛋白表達升高（P< 0.05），COL2 蛋白表達降低（P< 0.05）；盤龍七片+ 茴香霉素組上述指標變化與盤龍七片組相反（P<0.05）。見圖4、表6。

表6 各組大鼠軟骨組織ADAMTS－4、MMP－13、COL2、AQP3、Caspase－3蛋白表達比較（±s，n=10）

表6 各組大鼠軟骨組織ADAMTS－4、MMP－13、COL2、AQP3、Caspase－3蛋白表達比較（±s，n=10）

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與盤龍七片組比較，△P<0.05。

組別正常對照組模型組盤龍七片組SB203580組茴香霉素組盤龍七片+茴香霉素組ADAMTS－4/β－actin 1.02±0.11 1.86±0.18*1.47±0.12#1.48±0.13#2.09±0.19#1.87±0.18△MMP－13/β－actin 1.16±0.10 1.79±0.17*1.39±0.12#1.40±0.13#2.16±0.20#1.88±0.18△COL2/β－actin 1.11±0.09 0.45±0.05*0.71±0.07#0.79±0.07#0.16±0.01#0.41±0.04△AQP3/β－actin 1.09±0.10 1.99±0.18*1.57±0.12#1.58±0.13#2.46±0.19#1.98±0.19△Caspase－3/β－actin 1.17±0.10 1.75±0.15*1.31±0.13#1.39±0.13#2.16±0.22#1.71±0.17△

圖4 各組大鼠軟骨組織ADAMTS－4、MMP－13、COL2、AQP3、Caspase－3蛋白表達免疫印跡圖

3 討論

現代醫學認為滑膜、軟骨等關節組織的退變和破壞是KOA 的主要病機［11］。西醫治療KOA 費用昂貴且效果不甚明顯，尋找經濟簡便的治愈膝骨關節炎方法尤為重要［11］。SD 大鼠膝關節腔內注射Ⅱ型膠原蛋白酶，可成功建立早期KOA 模型［12］。本研究成功建立SD 大鼠KOA 模型后發現，KOA 大鼠右后肢痙攣收縮等行為嚴重、膝關節腫脹程度增加，肉眼觀察可見關節軟骨無光澤、關節液增多，光鏡觀察可見軟骨組織壞死、纖維組織增生、炎性浸潤等病理損傷，軟骨組織IL－1β、TNF－α 等炎性因子分泌增加。中醫學將KOA 歸屬于“骨癖”“膝痹”“鶴膝風”等范疇，并認為KOA 病機為“虛”“邪”“瘀”所致，風寒濕毒蓄積于骨節、四肢、髓間，是造成患者痛如虎噬的主要原因，針對KOA 的病因，宜采用活血化瘀療法改善患者疼痛癥狀［13］。盤龍七片由龍七、當歸、壯筋丹、丹參、五加皮等29 味中草藥組成，具有活血化瘀、消腫止痛的功效，對慢性炎性疼痛類疾病有較好的治療作用［14］。本研究發現，經盤龍七片治療后，大鼠右后肢痙攣收縮、行走困難等行為減少，膝關節腫脹、軟骨組織壞死、纖維組織增生、炎性浸潤等病理損傷減輕，軟骨組織中IL－1β、TNF－α 炎性因子水平降低，提示盤龍七片對KOA 的療效確切，但其具體的分子生物學機制還不甚明確。

目前研究發現，抑制關節軟骨細胞凋亡和炎癥反應是緩解KOA 軟骨病變的主要機制。p38 MAPK 可直接或間接調控NF－κB 炎性通路活化，誘導TNF－α、IL－1β 等炎性細胞因子釋放，促進基質金屬蛋白酶如MMP－13 及ADAMTS－4 等表達，導致COL2 降解，引發軟骨細胞凋亡，加速KOA 進程［15］。此外，除了介導炎性因子表達和促進細胞炎性損傷，p38 MAPK 還能調控水分子跨膜轉運相關蛋白如AQP3 等蛋白表達，破壞細胞內外滲透壓平衡，使細胞因吸水膨脹而破裂凋亡［16］。TAN 等［17］及劉欣等［18］發現，通過抑制炎性因子表達或阻斷p38 MAPK 激活來下調AQP3 表達，對緩解KOA 軟骨退變有重要意義。本研究發現，模型組大鼠軟骨組織中的p－p38 MAPK 活化途徑被激活，用茴香霉素進一步激活p－p38 MAPK 活化途徑后，p38 MAPK 介導的炎性反應及凋亡途徑相關通路蛋白即p－NF－κB、ADAMTS－4、MMP－13 及Caspase－3 表達升高，COL2 蛋白表達降低，水通道調控蛋白AQP3等蛋白表達升高，大鼠關節腫脹、軟骨組織炎性壞死等KOA 癥狀進一步加重。反之，阻斷p－p38 MAPK 介導的炎性反應及AQP3表達后，大鼠KOA 癥狀明顯緩解，提示p38 MAPK 通路激活，可能是KOA 軟骨損傷加重的關鍵原因之一。盤龍七片組大鼠軟骨組織中p38 MAPK/NF－κB/AQP3 通路處于抑制狀態，而在p38 MAPK 激動劑茴香霉素的影響下，盤龍七片的上述治療作用可被逆轉。這些結果均提示，盤龍七片發揮KOA 大鼠軟骨組織炎性損傷及退變的抑制作用，可能與抑制p38 MAPK/NF－κB/AQP3通路活化有關。

綜上所述，盤龍七片可通過抑制p38 MAPK/NFκB/AQP3 通路活化來緩解KOA 大鼠軟骨組織炎性損傷癥狀，這為盤龍七片治療KOA 可能的分子生物學機制提供了一定的理論依據。但中醫藥治療疾病具有多靶點、多途徑作用，p38 MAPK 通路還可能與氧化應激及自噬等因素有關，盤龍七片治療KOA 的其他機制，還有待后續深入研究。