“邵氏五針法”配合雙側“足三里”對慢性哮喘模型大鼠肺組織中SP、VIP蛋白表達影響的研究

胡曉京，邵素菊，華金雙，王培育，張君，任重，徐寧，田麗

（河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南 鄭州 450000）

支氣管哮喘是一種常見的慢性呼吸系統異質性疾病，特征為由多種細胞及細胞組分參與的慢性炎癥，同時伴有可變的氣流受限和氣道高反應性，隨著病程的延長和病情的加重，可導致氣道重構［1］。目前中國約有3 000 萬人罹患哮喘［2］，14 歲以上的人群中哮喘患病率為1.24%，城區的總體控制率為28.5%［3］，給個人和社會造成了巨大的經濟負擔。如何防治哮喘已成為全球醫學界所面臨的重要課題［4］。針灸治療哮喘具有操作簡便、療效顯著的特點，“邵氏五針法”是邵經明教授在多年臨床實踐中不斷探索總結出的一種安全有效的哮喘防治方法［5］。本實驗以慢性哮喘模型大鼠為對象探究哮喘的神經源性炎癥機制，從興奮性神經和抑制性神經入手，通過觀察慢性哮喘模型大鼠肺組織中的非腎上腺素能非膽堿能（NANC）興奮性神經肽P 物質（SP）、NANC 抑制性神經肽血管活性腸肽（VIP）蛋白的表達，探討“邵氏五針法”治療哮喘的作用機制，為針灸治療哮喘提供更科學的實驗支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康雄性SPF 級SD 大鼠40只，體質量180～200 g（河南省實驗動物中心提供），實驗動物許可證號：SYXK（豫）2017－0001。將大鼠置于溫濕度適宜的環境中適應性喂養5 d，根據計算機統計軟件產生的隨機數字表將大鼠隨機分為空白組、模型組、艾灸組和針刺組，每組10 只。大鼠分籠飼養，編號稱重。本實驗已通過動物倫理審查（倫理編號：DWLL201710327）。

1.2 主要試劑與儀器

卵蛋白（北京索萊寶科技有限公司，批號：20180521）；氫氧化鋁干粉（上海麥克林生化科技有限公司，批號：20180411）；4%多聚甲醛（大連美侖生物技術有限公司，批號：MA0192－Apr－14D）；SP 抗體（Bioss，批號：AG07171868）；VIP 抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：ZP3878BP78）；一次性毫針（φ0.30 mm × 13 mm，北京中研太和醫療器械有限公司）；細艾條（φ0.7 cm×12 cm，臨湘市湖香艾生物科技有限責任公司）；彩色圖像分析系統（西安華海電子有限公司）。

1.3 模型制備

實驗第1天和第8天時向模型組、針刺組和艾灸組大鼠腹腔內注射10%的復合OVA抗原液1 mL致敏，空白組大鼠注射1 mL生理鹽水。實驗第15天，將大鼠置于密閉的霧化箱內，模型組、針刺組、艾灸組用霧化器噴入1%的卵蛋白溶液20 min激發哮喘，空白組用霧化器噴入0.9%的生理鹽水20 min激發哮喘，隔日1次，連續6 周。大鼠出現呼吸急促或節律不齊，抓耳撓腮，煩躁不安，輕度紫紺，甚則四肢癱軟，俯伏不動，連續激發后大鼠毛色失去光澤，反應遲鈍即為造模成功。

1.4 治療

針刺組：實驗第15 天起，采用φ0.30 mm × 13 mm毫針直刺大鼠雙側“肺俞”、“大椎”、雙側“風門”、雙側“足三里”，針刺深度分別為6、5、6、7 mm。每10 min行針1 次，采用平補平瀉手法，共留針20 min。起針后激發，隔日1次，連續6周。

艾灸組：實驗第15 天起，采用細艾條在大鼠雙側“肺俞”、“大椎”、雙側“風門”、雙側“足三里”上方2～3 cm處施灸。“肺俞”“大椎”“風門”采用回旋灸，“足三里”采用溫和灸，每次施灸10 min。灸后激發，隔日1次，連續6周。

空白組、模型組每次均給相同力度抓握刺激，不做任何治療。隔日1次，連續6周。

1.5 指標檢測

1.5.1 取材

末次治療后24 h內，用10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，迅速消毒，打開胸腔，充分暴露肺和心臟，取右肺中下葉（包括肺門），立即放入裝有新鮮配制的4%多聚甲醛溶液的玻璃瓶中，用濾紙與脫脂棉置于瓶口，使組織充分浸潤于多聚甲醛中，做好標記，固定1周，石蠟包埋。

1.5.2 HE染色

將肺組織蠟塊進行切片、烤片，依次經過二甲苯Ⅰ5 min→二甲苯Ⅱ5 min→二甲苯Ⅲ10 min 脫蠟；無水乙醇Ⅰ3 min→無水乙醇Ⅱ3 min→95%乙醇Ⅰ3 min→95%乙醇Ⅱ3 min→90%乙醇3 min 水化；蘇木素染色5 min→1%鹽酸乙醇（2～3 s）→流水沖凈肥皂水反藍15 min→伊紅染色8 min 進行染色；80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇Ⅰ1 min、95%乙醇Ⅱ分別1 min→無水乙醇Ⅰ3 min→無水乙醇Ⅱ3 min 脫水；二甲苯Ⅰ2 min→二甲苯Ⅱ2 min透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察各組肺組織情況。

1.5.3 肺組織免疫組織化學染色

將肺組織蠟塊進行烤片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3%H2O2氧化，抗原修復，5%BSA封閉液封閉，一抗（用PBS 按1∶200 比例稀釋的SP、VIP 抗體）孵育，二抗（生物素標記山羊抗兔IgG）孵育，SABC（親和素從鏈霉菌）孵育，DAB 顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察肺組織中SP、VIP 陽性信號，隨機在每個切片中選取5 個高倍視野（× 400），測定每個視野中陽性表達的光密度值，取其平均值，記錄數據。

1.6 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計分析軟件進行處理。計量資料采用均數±標準差（±s）表示。首先進行方差齊性檢驗，若符合正態分布且方差齊，則進行單因素方差分析。若方差不齊，采用非參數檢驗進行分析，以P<0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠行為體征情況

空白組大鼠無異常表現，呼吸均勻，毛色光潔，反應靈敏，飲食、二便均正常，霧化吸入0.9%生理鹽水激發后無明顯變化；模型組大鼠激發后，出現嗆咳、呼吸急促、抓耳撓腮、煩躁等情況，多次激發后，大鼠精神不振，反應遲緩，呼吸喘促，皮毛蓬松無光澤，飲食量減少，糞便顆粒變小，質地干硬；針刺組、艾灸組大鼠致敏后皆出現模型組相同癥狀，如呼吸急促、抓耳撓腮、煩躁不安、嗆咳等，經過針刺或艾灸治療后，與模型組相比，大鼠呼吸較平穩、嗆咳癥狀明顯減輕，精神尚可，活動較靈敏，飲食、二便基本正常。

2.2 各組大鼠肺組織HE染色形態學觀察比較

空白組大鼠肺組織結構完整，肺泡壁清晰完整，支氣管管腔規則，平滑肌和血管壁未見明顯增厚，少見炎性細胞浸潤。模型組大鼠肺組織結構紊亂，肺泡壁不完整，氣道黏膜上皮脫落，支氣管管壁增厚狹窄，腔內見黏性分泌物及脫落的上皮細胞，氣管周圍及肺間質內大量炎性細胞浸潤，平滑肌增厚。針刺組大鼠肺泡壁清晰，平滑肌及支氣管壁輕度增厚，腔內極少量黏液及脫落的上皮細胞，血管及支氣管附近少量炎性細胞浸潤。艾灸組大鼠氣道黏膜上皮組織基本完整，平滑肌及支氣管壁增厚不明顯，炎性細胞浸潤較少。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織形態學比較（HE染色，×400）

2.3 各組大鼠肺組織中SP蛋白表達情況比較

與空白組相比，模型組大鼠肺組織內SP 蛋白陽性表達明顯增多（P< 0.01）；與模型組相比，針刺組、艾灸組大鼠肺組織內蛋白陽性表達均明顯減少（P <0.01）；針刺組和艾灸組相比，SP 蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表1、圖2。

圖2 各組大鼠肺組織中SP蛋白表達比較（×400）

表1 各組大鼠肺組織中SP蛋白表達情況比較（±s）

表1 各組大鼠肺組織中SP蛋白表達情況比較（±s）

注：各組間比較，F = 138.442，P = 0.000 < 0.01；與空白組相比，△P<0.01；與模型組相比，▲P<0.01。

組別空白組模型組針刺組艾灸組n 10 10 10 10 SP平均光密度值0.106±0.030 0.388±0.041△0.201±0.032▲0.223±0.019▲

2.4 各組大鼠肺組織中VIP蛋白表達情況比較

與空白組相比，模型組大鼠肺組織內VIP蛋白陽性表達明顯減少（P<0.01）；與模型組相比，針刺組、艾灸組大鼠肺組織內VIP 蛋白陽性表達均明顯增多（P<0.01）；針刺組和艾灸組相比，VIP蛋白表達差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表2、圖3。

表2 各組大鼠肺組織中VIP蛋白表達情況比較（±s）

表2 各組大鼠肺組織中VIP蛋白表達情況比較（±s）

注：各組間比較，F = 85.950，P = 0.000 < 0.01；與空白組相比，△P<0.01；與模型組相比，▲P<0.01。

組別空白組模型組針刺組艾灸組n 10 10 10 10 VIP平均光密度值0.320±0.029 0.117±0.035△0.239±0.029▲0.228±0.020▲

圖3 各組大鼠肺組織中VIP蛋白表達比較（×400）

3 討論

哮喘是以發作性喉中哮鳴有聲，呼吸困難，甚則喘息不得平臥為主要表現的頑固發作性肺系疾病。中醫學認為哮喘的病因病機是臟腑虛弱，宿痰伏肺，復因外邪侵襲、飲食不節、情志過激等觸發，導致氣滯痰阻，氣道攣急，發為哮喘［6－7］。哮喘為本虛標實之病，發作期以邪實為主，未發時以肺、脾、腎等臟腑虛弱之證候為主。哮喘的治療遵循“發則治標，緩解治本，發作期與緩解期并重”的原則。本實驗選取慢性哮喘模型大鼠，運用邵經明教授所創“邵氏五針法”，以“肺俞”“大椎”“風門”為主穴，同時選取“足三里”作為配穴［8－10］。肺俞屬于足太陽膀胱經，內應肺臟，是肺之精氣輸注于背部的處所，具有調理肺氣，止咳平喘，實腠固衛之功，可統治呼吸系統內傷外感諸疾，為治療肺病之主穴。《針灸資生經》記載：“凡有喘與哮者，為按肺俞，無不酸痛”。大椎穴為“諸陽之會”，是督脈與手足三陽經交會之處。《針灸甲乙經》言大椎為“三陽督脈之會”，治療哮喘可祛風散寒、宣肺平喘、理氣降逆。風門屬足太陽膀胱經穴，在肺俞上方，亦內應肺臟，為風邪入侵機體之門戶，針之有疏散風邪、調理肺氣之功［11－13］。哮喘多為慢性疾病，往往遷延難愈，患者病久體虛，配合足三里可以健脾和胃、扶正祛邪，與主穴合用，可健脾化痰、培土生金。

哮喘發病機制復雜，氣道的慢性炎癥貫穿于哮喘的整個過程，其中非腎上腺素能非膽堿能（NANC）神經介導的神經源性炎癥機制受到越來越多的關注，該神經無法被膽堿和腎上腺素拮抗劑阻斷［14］。P 物質（SP）是NANC興奮神經系統釋放的收縮支氣管平滑肌的感覺神經肽［15］，多見于支氣管壁和肺泡壁，可引起支氣管平滑肌收縮、黏液分泌增多等［16］。SP 具有強大的致炎作用，可激活巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞，釋放IL－1、IL－6 和TNF－α 等細胞因子。血管活性腸肽（VIP）是NANC 抑制神經系統釋放的舒張支氣管平滑肌的神經介質，含VIP 免疫反應的神經纖維分布于人體的氣道平滑肌、氣道上皮及黏膜下腺周圍，具有較強的舒張支氣管、抑制炎癥和抗損傷作用［17－18］。SZEMA 等［19］發現VIP 在調節氣道收縮和哮喘炎癥反應中起著重要的生理作用，肺組織中VIP 的缺乏可導致哮喘的發生。

本次實驗結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠肺組織中神經肽SP表達明顯增加，VIP表達明顯減少，使氣道收縮痙攣，肺組織炎性浸潤加重，從而發生哮喘；與模型組相比，針刺組、艾灸組肺組織中SP 表達均明顯減少，VIP 表達均明顯增加，可見針刺、艾灸“肺俞”“大椎”“風門”均可下調肺組織中SP 的表達、上調VIP的表達，使支氣管舒張，緩解氣道平滑肌痙攣，改善肺組織炎癥情況，從而緩解哮喘。故調節SP、VIP的失衡可能是針灸治療哮喘的途徑之一。