核聚集相關蛋白1在腎透明細胞癌中的表達及其臨床意義*

劉雷，鄭雙英

（常德職業技術學院 醫學系，湖南 常德 415006）

腎細胞癌（renal cell carcinoma,RCC）是泌尿系統常見的惡性腫瘤，其主要病理類型包括透明細胞癌、乳頭狀細胞癌、嗜鉻細胞癌、集合管癌和未分類癌等［1］。其中，透明細胞腎細胞癌（clear cell renal cell carcinoma,CCRCC）是最常見的類型，約占RCC 總數80%［2］。CCRCC 分子機制尚未完全闡明，其發生與多種基因突變和異常表達有關。FIORENTINO 等［3］發現，APC、ERBB4、RB1、EGFR和FGFR3突變在CCRCC 中十分頻繁。CCRCC 起病隱匿，缺乏早期診斷性腫瘤標志物，約有30% 的CCRCC 患者確診時已發生轉移［4］。因此，開發新的腫瘤標志物用于CCRCC 診斷具有重要意義。

核聚集相關蛋白 1（nucleus accumbensassociated protein 1,NAC1）是一種核蛋白，屬于BTB/POZ-ZF 結構域家族成員，具有調控細胞增殖、凋亡、轉錄和細胞形態維持等功能［5］。NAC-1在前列腺癌、卵巢癌中發揮重要作用［6-7］。目前，關于NAC1 表達與CCRCC 關系的研究較少，本研究擬對此進行初步探討，以期提高CCRCC 早期診斷率，發現新的治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016 年1 月至2016 年12 月在常德職業技術學院附屬醫院連續收集的110 例患者CCRCC組織及鄰近正常組織標本。所有患者行根治性腎切除術，未進行放療、化療、靶向治療等新輔助治療，病理診斷為CCRCC。采集患者臨床及病理資料，包括年齡、性別、病理分級、臨床分期、復發或轉移情況、復發或轉移時間及生存時間。其中，男性73 例，女性37 例；平均年齡（57.32±11.05）歲；病理分級：＞Ⅱ級20 例，≤Ⅱ級90 例。按照2010 年創立的美國癌癥聯合委員會TNM 分期將RCC 患者分為Ⅰ～Ⅳ期［8］，其中Ⅰ期70 例，Ⅱ期25 例，Ⅲ期12 例，Ⅳ期3 例。平均隨訪（48.61±14.95）個月后，18 例（16.8%）患者術后復發或轉移。其中，16 例（14.5%）患者死于CCRCC 遠處轉移。平均總生存期（OS）（26.38±6.33）個月，2 年和5 年疾病特異性生存率（DSS）分別為94.5% 和85.5%。第1、2 年每年隨訪4 次，第3～5 年每年隨訪2 次。隨訪內容包括病史采集、體格檢查、胸部X 射線檢查、腹部多普勒超聲或CT 檢查交替進行，并根據腎功能血檢結果進行腎小球濾過率檢查。本研究通過常德職業技術學院附屬醫院倫理委員會批準，所有受試者簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學（IHC）和染色結果評估

切片常規脫蠟脫水，并采用檸檬酸進行抗原修復。隨后將切片放入3%過氧化氫溶液中，室溫25 min；然后放入PBS（pH 值7.4）中15 min。將BSA（3%，美國Sigma 公司）均勻加入組織中，室溫下密封30 min。用抗NAC1 抗體（ab8192，美國Abcam 公司）（1∶200 稀釋）在4℃下孵育8 h，再用二抗（HRP-conjugated Goat Anti-Mouse IgG，武漢塞維爾生物科技有限公司）在室溫下孵育50 min。然后將所有切片用DAB 處理5 min，隨后用蘇木精-伊紅反染；最后將切片分別置于無水乙醇和二甲苯中進行脫水處理。

每組中的每個切片隨機選擇＞3 個200 倍視野進行攝影。用Image-Pro Plus 6.0（Media Cybernetics,Inc.,Rockville,MD，美國）計算組織的綜合光密度（IOD）和像素面積（AREA），平均密度（MD）等于IOD 除以AREA。NAC1 表達由兩位病理學家根據IHC 圖像和相應的MD 值進行量化。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 23.0 統計軟件。相關樣本Wilcoxon 符號秩檢驗用于分析癌組織與相鄰組織間NAC1 表達的差異，獨立樣本Wilcoxon signedrank 檢驗用于比較不同臨床病理特征的CCRCC 組織間NAC1 表達情況；采用Kaplan-Meier 生存曲線和Log-rank 檢驗分析NAC1 表達與CCRCC 患者預后關系，采用Cox 回歸的單因素和多因素分析來評估CCRCC 患者預后的危險因素，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學檢測NAC1 在CCRCC 中表達

分別分析CCRCC 組織和相鄰組織的染色情況，陽性染色強度分別定義為0、1、2、3 為無染色、淺黃色、黃褐色和棕色（見圖1、圖2）。CCRCC 組織中NAC1 平均表達量為（1.06±0.88），相鄰組織為（1.91±1.02）。相關樣本Wilcoxon 符號秩檢驗顯示，NAC1 在CCRCC 組織中表達量低于相鄰組織，差異有統計學意義（Z=6.040,P＜0.001）。

圖1 CCRCC 組織中NAC1 的表達

圖2 CCRCC 癌旁正常組織中NAC1 的表達

2.2 CCRCC 中NAC1 表達與臨床病理特征的關系

采用獨立樣本Wilcoxon 符號秩檢驗比較不同年齡、性別、腫瘤病理分級和TNM 分期的NAC1表達情況。結果顯示NAC1 表達與腫瘤病理分級相關，差異有統計學意義（P＜0.05）；病理分級為≤Ⅱ級患者NAC1 表達量高于＞Ⅱ級患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。但NAC1 在CCRCC 中表達與年齡、性別和TNM 分期無關，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 CCRCC 中NAC1 表達與臨床病理特征的關系（±s）

表1 CCRCC 中NAC1 表達與臨床病理特征的關系（±s）

2.3 NAC1 表達與CCRCC 預后的關系

本研究110 例患者中，16 例患者死于CCRCC遠處 轉移，OS 為（26.38±6.33）個月。根據NAC1 表達，將患者分為NAC1 低表達組和NAC1高表達組。Kaplan-Meier 生存率和對數秩檢驗顯示，NAC1 高表達組預后優于NAC1 低表達組，差異有統計學意義（P＜0.05）見圖3。

圖3 Kaplan-Meier 曲線分析NAC1 表達與癌癥特異性生存率的關系

采用Cox 回歸單因素和多因素分析評估CCRCC 預后的風險因素，單因素Cox 回歸分析顯示，病理分級、TNM 分期和NAC1 表達是RCC 預后的風險因素（P＜0.05）。多因素Cox 回歸分析顯示，NAC1 表達和TNM 分期是RCC 患者預后的獨立危險因素（P＜0.05）。NAC1 表達量低和Ⅲ、Ⅳ期RCC 患者預后較差。見表2。

表2 CCRCC 預后因素分析參數

3 討論

RCC 是一種起源于腎小管上皮細胞的惡性腫瘤，其是泌尿系統常見的惡性腫瘤。由于RCC 一般缺乏早期癥狀，當患者出現RCC 的典型三聯征（即腰痛、血尿、腹部腫塊）時，往往已是癌癥晚期［9］。為了排除不同細胞類型對研究的影響，本研究只納入病理類型確認的CCRCC 患者。CCRCC的臨床分期主要通過增強CT 掃描確定，增強CT掃描可以評價RCC 局部浸潤、淋巴腺病變和轉移情況。本研究納入Ⅰ期70 例、Ⅱ期25 例、Ⅲ期12 例和Ⅳ期3 例。為排除手術方法對RCC 預后的影響，本研究納入患者均行根治性腎切除術。

術后隨訪是治療RCC 的重要環節，RCC 患者應接受專業泌尿外科醫生隨訪。通過對臨床癥狀和體征、腎功能、局部復發或轉移情況隨訪，可以獲得重要的預后信息。以往研究發現，接受定期隨訪患者較未接受定期隨訪患者OS 更長［10］。本研究110 例患者中，18 例復發或轉移。總復發或轉移率為16.8%，與以往研究相似。BEISLAND等［10］前瞻性地隨訪了195 例RCC 患者，31 例患者在隨訪期間出現復發或轉移，總體復發或轉移率約為15.9%。18 例復發或轉移的患者中，16 例（14.5%）患者死于CCRCC 遠處轉移，OS 為（26.38±6.33）個月，5 年疾病DSS 為85.5%。根據美國SEER 數據庫，2007―2013 年美國RCC 患者的5 年生存率約為74%。本研究預后好于以往數據，這可能與對RCC 早期診斷和治療及晚期RCC 靶向治療的原因有關。

NAC1 基因是一種腫瘤抑制基因，在DNA 損傷修復反應和維持細胞遺傳物質的穩定性方面起著重要作用。由于NAC1 表達不足，腫瘤細胞內遺傳物質不穩定性增加，導致基因突變，從而促進癌癥的發生和發展。本研究結果表明，NAC1 表達量在RCC 組織中明顯低于鄰近組織。NAC1 基因的低表達或缺失主要由基因突變引起。COMSIC數據庫對169 個腫瘤的500 多個蛋白激酶突變進行分析，發現NAC1 基因突變頻率在所有基因中排名第3 位。NAC1 在許多腫瘤組織中表達量較低或存在缺陷。FERRIS 等［11］比較了165 例非小細胞肺癌患者的肺癌組織和正常肺組織中NAC1 表達情況，結果顯示21.8% 肺癌組織中無NAC1 表達，NAC1 在腫瘤組織中表達明顯低于正常肺組織。WANG 等［12］對早期乳腺癌的回顧性研究發現，NAC1 在癌組織中表達明顯低于正常乳腺上皮組織。類似的研究表明，NAC1 在胃癌、結直腸癌和胰腺癌中表達低于正常組織［13-15］。NAC1 表達與RCC 的關系研究不多。

NAC1 表達與腫瘤的臨床病理因素相關。本研究結果發現，NAC1 表達與RCC 的病理分級有關，但與年齡、性別和臨床分期無關。NAC1 在病理＞Ⅱ級RCC 組織中表達明顯低于≤Ⅱ級RCC 組織。經過大量文獻查閱，筆者未發現關于RCC 中NAC1 表達與臨床病理數據關系的研究。然而關于NAC1 表達與其他癌癥的臨床病理間的關系有大量的文獻，結果也較相似。NAC1 在結直腸癌組織中表達量較低，且與結直腸癌的病理分級相關。NAC1 在高等級腫瘤組織中表達量明顯低于低等級腫瘤組織。NAC1 表達與包括RCC 在內的多種腫瘤組織的腫瘤分化呈正相關關系，本研究證明了這一點。

本研究結果還發現，NAC1 在RCC 中表達與RCC 患者的預后有關。NAC1 表達量低的患者總生存期較短。NAC1 表達與RCC 預后的關系報道較少。但也有報道稱，NAC1 表達與其他腫瘤的預后有關。TNM 分期和NAC1 表達是獨立預后因素。本研究發現NAC1 表達與TNM 期是RCC 預后的獨立危險因素，與上述研究結果基本一致。因此，提示NAC1 基因在RCC 中具有重要的潛在應用價值，可作為RCC 的潛在治療靶點。

本研究存在一些局限性：首先，該研究受限于相對較小的樣本；第二，一些因素可能未被納入，如腫瘤的位置；第三，雖然數據是在前瞻性維護的數據庫中仔細收集，但使用回顧性分析存在一些偏差。盡管有這些局限性，但筆者明白這項研究結果對RCC 的治療具有重要意義，然而需要更多樣本的前瞻性研究。

綜上所述，NAC1 表達水平可以作為RCC 預后的獨立風險因素。NAC1 表達水平低的患者可能有較短的總生存期。隨著對RCC 潛在致病機制的進一步了解，NAC1 可作為RCC 新的生物標志物和潛在的分子治療靶點。