固態發酵黑洋蔥多糖對2型糖尿病大鼠肝臟和腎臟的保護

李躍華，周寧，王麗媛，云月英，寧月寶*

（1.內蒙古科技大學生命科學與技術學院，內蒙古 包頭 014010；2.包頭市腫瘤醫院，內蒙古 包頭 014010）

根據統計，在中國約有1.1億糖尿病患者，還有約600萬處于糖尿病前期[1-3]。因為2型糖尿病患者發病機理復雜，常伴隨著腎臟、肝臟、心臟和血管等多個器官功能的衰竭，糖尿病最主要的并發癥為糖尿病肝病和糖尿病腎病，主要癥狀為長期的高血糖、高血壓和蛋白尿，嚴重時將惡化為肝硬化和腎衰竭，嚴重危害人類健康，尚無根治藥物。近年來科研人員發現，從天然藥用植物中提取出的植物多糖可以產生良好的降血糖效果[6-8]，且此類藥物對比當前糖尿病臨床藥物來講無毒副作用，開發潛力大，是當前研究的熱點[9-10]。黑洋蔥是將新鮮的洋蔥在特殊條件下發酵30 d制得的食品[11]。可以保留洋蔥的營養成分，減少刺激性氣味，提升洋蔥的口感，并且有效活性成分含量顯著提高[12]。本實驗以黑洋蔥中提取的粗多糖為研究對象，探究黑洋蔥粗多糖對2型糖尿病SD大鼠的降血糖和降血脂效果。

將新鮮洋蔥放置在恒溫恒濕發酵箱中，讓其自然發酵4周，洋蔥發酵過程中的顏色逐漸變黑，是因為生成了類黑素，發生了美拉德反應。黑洋蔥與洋蔥相比有效成分明顯提高，黑洋蔥粗多糖具有較強活性功能，如抗氧化、抗衰老、增強免疫力等，研究表明，黑洋蔥多酚具有清除機體自由基、增加抗氧化酶活性、減少衰老細胞堆積和增強細胞再生能力等重要作用[22]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮洋蔥：市售；SD大鼠（體重270 g～300 g，雄性）：斯貝福北京生物技術有限公司；四氧嘧啶：博美生物科技有限公司。

GA-3型血糖儀：三諾生物傳感股份有限公司；601超級恒溫水浴鍋：金壇市醫療儀器廠；Laborota 4000 efficient旋轉蒸發儀：德國Heidolph公司；MDS-6G型多通量微波消解/萃取儀：上海新儀微波化學科技有限公司；SHB循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；UV-7504紫外可見分光光度計、L-550大容量高速離心機、GZH-GF-101-3-5電熱恒溫鼓風干燥箱：上海躍進醫療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 黑洋蔥粗多糖的制備

（1）將發酵好的黑洋蔥放入50℃烘箱中干燥2周后取出。

（2）干燥的黑洋蔥在研磨缽中研磨成粉末，過60目篩，得到黑洋蔥粉。

（3）稱取20 g研磨后篩出的黑洋蔥粉末于500 mL燒瓶中，向燒瓶中注入20倍體積超純水，80℃水浴3h，3 000 r/min高速離心15 min去除其中的黑洋蔥粉末，留取上清，上述步驟進行3次，獲得黑洋蔥的水提液，將3次獲得的水提液合并。

（4）將水提液移入旋轉蒸發儀中使其濃縮至原體積的1/5。

（5）Sevage法除去黑洋蔥水提液中的蛋白質，采用Sevage法[13-14]：三氯甲烷與正丁醇按體積比5∶1配制溶液，以濃縮提取液的1/5體積加入濃縮提取液中，將混合液120 r/min振蕩15 min使其混勻，充分混合后4 000 r/min離心10 min，取上清液體。

（6）用玻璃棒攪拌注入上清液3倍體積的95%乙醇溶液，4℃放置16 h，使黑洋蔥粗多糖沉淀。

（7）4 200 r/min離心 15 min，倒掉上清液，固體沉淀用無水乙醇與丙酮各清洗3次，置于50℃烘箱中干燥12 h。

（8）將干燥后的沉淀取出，研磨成粉末，即得黑洋蔥粗多糖粉末[15]，黑洋蔥粗多糖提取率采用下式計算。

1.2.2 蒽酮-硫酸法葡萄糖標準曲線的繪制

取80 mL濃硫酸，注入少量超純水將其定容到100 mL。避光環境下稱取分析純蒽酮0.1 g，加入配制好的80%硫酸溶液100 mL并不斷攪拌，使其溶于硫酸溶液中，完全溶解后放置于棕色瓶中待用，現用現配。

（1）取適量的分析純葡萄糖藥品于鼓風干燥箱中105℃干燥2 h。精確稱取105℃干燥至恒重的葡萄糖藥品100 mg，以少量超純水溶解后定容至100 mL得到濃度為1 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。

（2）用移液器分別精確取上述配制好的1 mg/mL葡萄糖對照品溶液 0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mL 于100 mL容量瓶中，7只瓶各注入超純水定容至100 mL。

用移液器精確吸取配制的濃度呈階梯狀葡萄糖標準溶液2.0 mL于10 mL試管中，向7只試管中各加入蒽酮硫酸溶液6 mL，將各試管沸水浴加熱15 min，之后立即置于冰水浴中15 min。

（3）以加入0.0 mL葡萄糖標準品的溶液為空白，每組做3次平行試驗取平均值。記錄各組溶液在625 nm波長處的吸光度，以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制蒽酮-硫酸法葡萄糖標準曲線。

1.2.3 多糖含量的測定

以黑洋蔥粗多糖作溶質，超純水作溶劑配制溶液。使用分光光度計測得黑洋蔥粗多糖溶液在625 nm處的吸光度，根據蒽酮-硫酸法葡萄糖標準曲線，計算所得黑洋蔥粗多糖中的多糖含量。

1.2.4 動物實驗

1.2.4.1 SD大鼠高血糖模型的建立

將實驗動物分組，隨機分為對照組10只和實驗組30只，并測得平均體重為270 g。在避光環境下，取四氧嘧啶1.3 g置于棕色瓶中，向棕色瓶內加入65 mL生理鹽水，反復吹打至溶解，即配制完成濃度為2%的四氧嘧啶溶液，將所有SD大鼠禁食不禁水12 h后，給建模組的SD大鼠腹腔注射四氧嘧啶溶液，劑量為180 mg/kg[16-17]，腹腔注射結束72 h后將SD大鼠禁食不禁水12 h，測定SD大鼠的空腹血糖值，空腹血糖濃度大于7.0 mmol/L的SD大鼠視為建模成功[19-20]。正常對照組SD大鼠的腹腔注射等量的生理鹽水[18]。

1.2.4.2 測定SD大鼠血糖值并分組

隨機選取10只建模成功的SD大鼠作為模型組。測定血糖后，按照血糖濃度的差異將剩余糖尿病大鼠分為中高血糖組與高血糖組，血糖值在7.0 mmol/L～15.0 mmol/L的10只為中高血糖組，15.0 mmol/L以上的10只記為高血糖組。

1.2.4.3 SD大鼠灌胃及生化指標檢測

每天用發酵黑洋蔥粗多糖溶液給大鼠灌胃，持續4周，各組具體給藥情況見表1。

表1 實驗大鼠分組及給藥情況Table 1 Grouping and administration of experimental rats

灌胃實驗開始后，分別在第7、14、21、28天測SD大鼠的晨起空腹血糖值，共計4次，記錄數據并進行統計。測試后的大鼠進行麻醉處死，動脈取血進行生化指標的檢測。然后將大鼠解剖后取肝臟以及腎臟組織進行病理檢測。用含有促凝劑的生化負壓管對大鼠進行股動脈取血，取血后待血液自然凝固，于4℃、4 000 r/min離心10 min得到血清，后置于4℃冰箱中冷藏備用。采用日立全自動生化分析儀進行肝功能、腎功能、血脂水平的檢測。

1.2.4.4 標本制備

解剖取血后大鼠的肝臟以及腎臟。取出的肝臟以及腎臟用4℃生理鹽水進行清洗處理，清洗后的組織置于多聚甲醛溶液中，置于4℃冰箱中保存備用。包埋切片，將組織從多聚甲醛中取出，置于通風櫥內進行修整處理。修整后的組織采用濃度75%、85%、90%、95%的乙醇溶液進行脫水處理，脫水時間分別為4、3、2、1 h。之后按照如下脫水劑及脫水時間依次處理：無水乙醇（30 min、30 min）、醇苯（10 min）、二甲苯（10 min、10 min）、蠟（1 h、1 h、1 h）。將融化的蠟置于包埋框中，迅速將脫水處理后的組織置于包埋框中，待蠟凝固后置于切片機中切成4 μm厚的薄片。利用蘇木精-伊紅染色法，使組織切片伊紅染色與脫水：在切好的組織切片中加入伊紅染液并且充分染色3 min。染色完成后的組織切片經80%乙醇溶液（5 s），95%乙醇溶液（2 min），無水乙醇（2 min）進行脫水處理。脫水后的組織切片在二甲苯中浸泡4 min，持續2次，然后將組織切片進行風干處理，并使用中性樹脂封片。

1.2.4.5 SD大鼠生化指標水平的檢測數據

對大鼠進行采血，離心取得血液的上清液，測大鼠血清中的谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、甘油三酯（triglyceride，TG）、血清總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、高密度脂蛋白膽固醇 (high-density lipoprotein，HDLC)、肌酐（creatinine，Cre），之后對血脂指標進行 t檢驗用以檢查其是否具有顯著性差異。

1.3 數據的統計與分析

采用SPSS 19.0統計分析軟件對數據進行統計與分析[21]。各組數據結果以平均值±標準差表示，兩組間均值比較采用t檢驗分析方法。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 蒽酮-硫酸法繪制標準曲線

蒽酮-硫酸法繪制的標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

由圖1可知，標準曲線方程為y=8.431 4x-0.040 5。R2為 0.992 6。

2.2 黑洋蔥粗多糖提取率

用200 g黑洋蔥粉末提取粗多糖，得到黑洋蔥粗多糖23.35 g，即黑洋蔥粗多糖提取率為11.68%。

2.3 多糖含量的測定結果

取樣品黑洋蔥粗多糖稀釋處理后，于625 nm處測定吸光度，其吸光度為0.7，根據蒽酮-硫酸法測得出的標準曲線方程，計算出多糖含量為8.7 mg/100 mL。

2.4 SD大鼠血糖水平的變化

大鼠灌胃持續4周，灌胃前后血糖值變化見表2。

表2 灌胃前后大鼠血糖水平Table 2 Blood glucose levels of rats before and after gavage

對大鼠進行灌胃黑洋蔥粗多糖4周后可觀察到，中高血糖組大鼠血糖值下降，有極顯著差異（P<0.01）。

2.5 SD大鼠灌胃前后生化指標變化

大鼠灌胃持續4周，灌胃前后生化指標變化如表3。

表3 灌胃前后生化指標變化Table 3 Changes of biochemical indexes before and after gavage

對大鼠進行灌胃黑洋蔥粗多糖4周后可觀察到中高血糖組、高血糖組中AST、ALT與模型組相比明顯降低（P<0.01），說明對肝臟功能有明顯效果。中高血糖組、高血糖組中CRE水平比模型組相比明顯降低（P<0.01），說明對腎臟功能有效果。TG、TC、LDL水平升高，HDL-C水平降低是高脂血癥指標，高脂血癥能夠引起糖尿病、脂肪肝、腦血栓等疾病，經過對大鼠進行灌胃黑洋蔥粗多糖4周后可觀察到中高血糖組、高血糖組中 TG、TC、LDL-C 數值降低（P<0.01），HDL-C 數值升高（P<0.01），有極顯著差異，說明高脂血癥和糖尿病得到一定恢復。

2.6 黑洋蔥粗多糖對2型糖尿病大鼠肝組織病理切片的影響

圖2為對照組、模型組、中高血糖組以及高血糖組大鼠肝臟的病理切片圖。

圖2 各組大鼠肝臟組織病理切片分析Fig.2 Histopathological analysis of liver tissues of rats in each group

由圖2可知，對照組肝細胞形態正常、排列規則、組織結構完整、形態清晰、無明顯病理變化。而模型組大鼠的肝細胞出現明顯的水腫、組織結構紊亂、排列不規則。中高血糖組大鼠的肝細胞形態正常、排列規則，與對照組相似。高血糖組大鼠肝細胞形態有一定的恢復，但排列較亂，并且仍可見少量的細胞發生脂肪性病變。

模型組大鼠的肝細胞出現明顯的水腫、排列不規則，肝小葉結構紊亂，中央靜脈縮小結構模糊。黑洋蔥粗多糖對中高血糖組和高血糖組大鼠的肝臟組織均呈現出不同程度的保護作用。根據對對照組、模型組、中高血糖組、高血糖組的肝臟病理切片觀察與對比，可明顯看出中高血糖組肝臟細胞恢復正常，高血糖組肝臟細胞有一定程度的改善，表明黑洋蔥粗多糖對肝臟可產生一定的保護作用。

2.7 黑洋蔥粗多糖對2型糖尿病大鼠腎組織病理切片的影響

圖3為對照組、模型組、中高血糖組以及高血糖組大鼠腎臟組織病理。

圖3 各組大鼠腎臟組織病理切片分析Fig.3 Pathological section analysis of renal tissue of rats in each group

對照組腎小球大小正常、各細胞核清晰、結構完整、細胞大小均勻。模型組大鼠的腎小球形態不完整，腎小球上皮細胞空泡樣變性。中高血糖組大鼠腎小球基本正常，與對照組相似。高血糖組大鼠腎小球形態較完整，但腎小囊與對照組相比較腫大。

但從黑洋蔥粗多糖灌胃的中高糖組以及高糖組大鼠的生化指標來看，相比于模型組大鼠，肌酐已經顯著降低。病理學分析也顯示，中高血糖組大鼠腎小球基本正常，與對照組相似。高血糖組大鼠腎小球形態較完整，這說明黑洋蔥粗多糖對糖尿病大鼠的腎臟組織具有一定的保護和修復作用。

3 討論與結論

本實驗進行了黑洋蔥粗多糖對2型糖尿病大鼠降血糖和降血脂的研究，連續4周對高血糖大鼠灌胃黑洋蔥粗多糖，發現其有良好的降血糖及降血脂效果，其中，中高血糖組大鼠血糖值恢復至正常水平；高血糖組大鼠血糖下降明顯。中高血糖組、高血糖組中AST、ALT與模型組相比差異極顯著（P<0.01），說明肝臟功能得以恢復。中高血糖組、高血糖組中CRE數值比模型組相比差異極顯著（P<0.01），中高血糖組、高血糖組中TG、TC、LDL-C數值與模型組相比差異極顯著（P<0.01），HDL-C數值與模型組相比差異極顯著（P<0.01），說明高脂血癥和2型糖尿病得到一定的恢復。黑洋蔥粗多糖能顯著降低由四氧嘧啶誘導的高血糖大鼠的血糖及血脂。

綜上所述，洋蔥粗多糖灌胃高糖高脂2型糖尿病大鼠，可顯著改善大鼠肝臟和腎臟的結構和功能。黑洋蔥粗多糖可治療高脂高糖引起的2型糖尿病。但目前機理尚不明確，今后需要進一步的機理研究。