超聲波結合酶法提取葡萄皮渣原花青素工藝優化及其抗氧化活性

王彥平，陳月英*，孫瑞琳，李東，湯高奇，呂全軍

（1.河南農業職業學院，河南 鄭州 451450；2.鄭州大學，河南 鄭州 451001）

原花青素（proanthocyanidins，PC）是由黃烷醇衍生而來的天然多酚類化合物，由不同數量的兒茶素或者表兒茶素結合而成，是一種天然抗氧化劑[1]。研究表明，原花青素具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖、抗疲勞、抑菌消炎、預防老年癡呆和保護心血管等作用[2-8]。在葡萄酒和葡萄汁生產的過程中產生的葡萄皮渣，主要有葡萄梗、葡萄籽、葡萄皮和酒泥等物質。據文獻報道，釀酒過程中產生的副產物葡萄皮渣中不僅含有花青素、原花青素，還含有包括單寧、酒石酸以及果膠等生物活性物質[9]。目前，葡萄皮渣一般被當做飼料、肥料，甚至被當做廢料舍棄，其中所含有的多種有效成分未被利用，造成了環境污染和資源浪費。

原花青素的親水性較好，易溶于多種有機溶劑中，如甲醇、乙醇、丙酮等。因此，原花青素的提取方法有很多，包括直接浸提法、有機溶劑提取法、超聲波輔助提取法、酶提取法以及微波輔助提取法等[10-13]。其中有機溶劑提取法耗時較長且得率不夠高，微波輔助提取容易使原花青素遭到破壞而使得率降低。而酶法提取利用纖維素酶使植物的細胞壁及細胞間質的纖維素、半纖維素等物質發生水解，從而有效促進活性成分地溶出。同時超聲波輔助提取法可以通過空化效應、同熱效應和機械效應破碎細胞，實現對生物活性物質的快速提取[13]。超聲波輔助提取法和酶提取法在不同植物原料提取原花青素中均有所應用，然而，超聲波結合酶法在原花青素提取的研究中并不多見，應用該技術提取釀酒葡萄皮渣中的原花青素的工藝報道較少。

本試驗采用超聲波結合酶法進行釀酒葡萄皮渣中原花青素的提取，研究纖維素酶添加量、酶解時間、酶解溫度、超聲時間、超聲功率對原花青素提取的影響，在此基礎上利用正交試驗優化確定超聲波結合酶法提取原花青素的最佳工藝參數，并測定其體外抗氧化活性，為葡萄皮渣的綜合利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019年赤霞珠葡萄釀酒皮渣：河南省農業高新科技園。

1.2 材料與試劑

1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH，純度99%）：美國 Sigma-Aldrich公司；原花青素標準品（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶（500 000 U/g）：浙江一諾生物科技有限公司；無水乙醇、甲醛、香草醛、硫酸、雙氧水、硫酸亞鐵（均為分析純）：中國醫藥集團有限公司；一次性有機濾器（0.45 μm）：南通市衛寧實驗器材有限公司。

1.3 儀器與設備

GWB-1E實驗室專用超純水機、UV1901PCS雙光束紫外可見光分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；SCIENTZ-ⅡDM微波光波超聲波萃取儀：寧波新芝有限公司；BSA423S-CW分析天平：德國賽多利斯集團；D5-R2離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司；202-3AB電熱恒溫鼓風干燥箱、HH-2數顯恒溫水浴鍋：上海喬躍電子科技有限公司；RE2000旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；L18-YJ08靜音真空破壁機：杭州九陽生活電器有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 葡萄皮渣預處理

葡萄皮渣于45℃恒溫箱烘48 h，破壁機粉碎后過50目篩，加入乙醚采用索氏抽提法進行脫脂處理，保存備用。

1.4.2 原花青素標準曲線的繪制

采用香草醛-硫酸法進行處理并實現對原花青素濃度的測定[12]，將質量濃度（mg/mL）作為自變量，在500 nm處測定吸光度，并將吸光度A作為因變量進行線性回歸分析，得到原花青素標準曲線，如圖1所示。

圖1 原花青素標準曲線Fig.1 Standard curve of procyanidins

原花青素標準曲線回歸方程：y=0.931 0x+0.002 5，R2=0.999 1。說明原花青素在質量濃度為0.1 mg/mL～0.5 mg/mL的范圍內有著良好的線性關系。

1.4.3 葡萄皮渣原花青素的提取

準確稱取5.000 0 g葡萄皮渣粉于250 mL錐形瓶中，加入一定量纖維素酶和50 mL蒸餾水，在pH5.0和一定酶解溫度條件下進行酶解反應，酶解后加入50 mL無水乙醇，放入超聲波萃取儀，在一定功率下超聲處理一定時間后，在75℃水浴中提取4 h。將處理過的提取液以6 000 r/min的速度進行離心，處理15 min之后取上清液進行減壓蒸餾，再將其用95%的乙醇溶液定容至25 mL。

1.4.4 葡萄皮渣原花青素得率的測定

將處理之后的原花青素提取液先進行稀釋處理，之后按1.4.2加入香草醛和硫酸對提取液進行處理，并測定吸光度A500nm。原花青素的得率計算公式如下所示。

式中：C表示溶液中原花青素的質量濃度，mg/mL；X用來表示稀釋處理的倍數；V用來表示樣品液體積，mL；m表示稱取葡萄皮渣粉末的質量，g。

1.4.5 葡萄皮渣原花青素提取的單因素試驗設計

1.4.5.1 纖維素酶添加量對原花青素得率的影響

按照1.4.3提取方法，在50℃條件下酶解120 min，用300 W的功率超聲處理30 min，選擇纖維素酶添加量分別為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%，分析纖維素酶添加量對原花青素得率的影響。

1.4.5.2 酶解時間對原花青素得率的影響

按照1.4.3提取方法，纖維素酶的添加量為0.20%，酶解溫度為50℃，用300 W的功率超聲處理30 min，選擇酶解時間分別為 30、60、90、120、150 min，分析酶解時間對原花青素得率的影響。

1.4.5.3 酶解溫度對原花青素得率的影響

按照1.4.3提取方法，纖維素酶的添加量為0.20%，酶解120 min，用300 W的功率超聲處理30 min，選擇酶解溫度分別為 35、40、45、50、55、60 ℃，分析酶解溫度對原花青素得率的影響。

1.4.5.4 超聲功率對原花青素得率的影響

按照1.4.3提取方法，纖維素酶的添加量為0.20%，在50℃條件下酶解120 min，超聲處理30 min，選擇超聲功率分別為 100、150、200、250、300 W，分析超聲功率對原花青素得率的影響。

1.4.5.5 超聲時間對原花青素得率的影響

按照1.4.3提取方法，纖維素酶的添加量為0.20%，在50℃條件下酶解120 min，超聲功率為300 W，選擇超聲時間分別為 10、20、30、40、50 min，分析超聲時間對原花青素得率的影響。

1.4.6 葡萄皮渣原花青素提取工藝正交試驗

在單因素試驗的基礎上，設計纖維素酶添加量、酶解時間、超聲時間、超聲功率四因素三水平L9（34）的正交試驗，將不同條件下的原花青素得率作為正交試驗的評價指標，以實現對超聲波結合酶法工藝條件的優化，具體的正交試驗因素及水平如表1所示。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5 抗氧化性測定

取最佳工藝條件下制得的葡萄皮渣原花青素提取液，參照文獻 [14-16]的方法分別測定其總還原力、DPPH·清除率、·OH清除率，并以維生素C做陽性對照進行比較。

1.6 數據分析

試驗結果均采用平均數±標準差表示，使用Microsoft Office Excel 2016和origin 9.0軟件進行數據處理及圖表制作。

2 結果與分析

2.1 葡萄皮渣原花青素提取工藝單因素試驗

2.1.1 纖維素酶添加量對原花青素得率的影響

纖維素酶添加量對葡萄皮渣原花青素得率的影響如圖2所示。

圖2 纖維素酶添加量對原花青素得率的影響Fig.2 Effect of cellulose addition on procyanidins yield

由圖2可知，隨著纖維素酶添加量的不斷增加，原花青素得率不斷升高，當纖維素酶添加量為0.25%時原花青素得率達到最大；纖維素酶添加量繼續增大到0.30%時，原花青素得率反而下降，可能是由于酶濃度過高時，底物濃度不能飽和，降低了酶作用效率[17]。故選擇纖維素酶添加量0.20%、0.25%、0.30%做進一步優化。

2.1.2 酶解時間對葡萄皮渣原花青素得率的影響

酶解時間對葡萄皮渣原花青素得率的影響如圖3所示。

圖3 酶解時間對原花青素得率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis time on procyanidins yield

從圖3中可以看出，利用這種提取方式得到的原花青素得率先隨著時間升高，到90 min時升高到最高點，此時原花青素得率達到最大。超過90 min得率開始逐漸下降，可能是由于隨著酶解時間的進一步延長，溶出的原花青素被空氣中的氧氣氧化，或有其他雜質溶出，從而導致葡萄皮渣原花青素得率降低[18]。故選擇酶解時間60、90、120 min做進一步優化。

2.1.3 酶解溫度對葡萄皮渣原花青素得率的影響

酶解溫度對葡萄皮渣原花青素得率的影響如圖4所示。

圖4 酶解溫度對原花青素得率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on procyanidins yield

由圖4可知酶解溫度對提取試驗中原花青素得率的影響，隨著酶解溫度升高原花青素的得率先升高后下降，而當酶解溫度升高到55℃時，原花青素得率達到最大，而當酶解溫度繼續升高，酶的活性將受到酶解溫度影響，酶解反應無法充分進行，原花青素得率也會有一定的下降，因此選擇55℃為最佳酶解溫度。

2.1.4 超聲功率對葡萄皮渣原花青素得率的影響

超聲功率對葡萄皮渣原花青素得率的影響如圖5所示。

圖5 超聲功率對原花青素得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on procyanidins yield

由圖5可知超聲功率對提取試驗中原花青素得率的影響，隨著超聲功率增大原花青素的得率先升高后下降，當超聲功率升高到250 W時，原花青素得率達到最大。而當功率繼續升高，超聲處理所帶來的熱效應可能會直接導致原花青素的降解，同時提取液的移動速度也會受到影響，導致原花青素溶出減少，得率降低[19]。故選擇超聲功率200、250、300 W做進一步優化。

2.1.5 超聲時間對葡萄皮渣原花青素得率的影響

超聲時間對葡萄皮渣原花青素得率的影響如圖6所示。

圖6 超聲時間對原花青素得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time on procyanidins yield

由圖6可知，原花青素的得率隨著超聲時間的增加而升高，超聲時間達到30 min時，原花青素得率最大。主要由于超聲時間增加，葡萄皮渣細胞壁的破碎程度增加，原花青素得率逐漸升高，當達到一定時間后，可能會使原花青素結構發生改變，導致得率略下降[20]。故選擇超聲時間為25、30、35 min進一步優化。

2.2 葡萄皮渣原花青素提取工藝正交試驗

葡萄皮渣原花青素提取正交試驗結果如表2所示。

表2 葡萄皮渣原花青素提取的正交試驗結果Table 2 The orthogonal experiment results of extracting procyanidins of grape pomace

由表2可知，可以通過對正交試驗結果中的極差進行分析得到各因素對原花青素得率產生的影響，極差順序為 RC＞RB＞RD＞RA，各因素影響大小排序為超聲時間＞酶解時間＞超聲功率＞纖維素酶添加量。對葡萄皮渣原花青素進行提取的最佳工藝為A3B2C2D2，即纖維素酶添加量0.30%、酶解時間90 min、超聲功率200 W、超聲時間30 min。為確定最佳提取工藝條件的穩定性和可靠性，按照此條件做驗證試驗，重復3次，此條件下葡萄皮渣原花青素得率為（14.22±1.13）mg/g，高于正交試驗中所有試驗結果，說明該工藝條件穩定可靠。

2.3 葡萄皮渣原花青素體外抗氧化活性

2.3.1 葡萄皮渣原花青素的總還原能力

葡萄皮渣原花青素的總還原能力如圖7所示。

圖7 葡萄皮渣原花青素的總還原能力Fig.7 Total reducing power of grape pomace procyanidins

由圖7可知，隨著葡萄皮渣原花青素質量濃度的增大，總還原能力逐步增強。在試驗質量濃度范圍內，葡萄皮渣原花青素總還原能力與質量濃度存在良好的劑量-效應關系，相同濃度下原花青素總還原能力強于維生素C。

2.3.2 葡萄皮渣原花青素對DPPH·的清除作用

葡萄皮渣原花青素對DPPH·的清除作用如圖8所示。

圖8 葡萄皮渣原花青素對DPPH·的清除作用Fig.8 DPPH·removal effect of grape pomace procyanidins

通過圖8中的曲線可以發現，在試驗的質量濃度范圍內DPPH·的清除率和質量濃度成正比，也就是說葡萄皮渣原花青素的DPPH·清除能力對其濃度有較強的濃度依賴性，葡萄皮渣原花青素的濃度增加，對DPPH·的清除能力也相應增強。通過線性回歸方程分析，葡萄皮渣原花青素對DPPH·的半數清除率IC50為0.130 mg/mL，而維生素C對DPPH·的半數清除率IC50為0.247 mg/mL，表明葡萄皮渣原花青素對DPPH·的清除能力顯著優于維生素C。

2.3.3 葡萄皮渣原花青素對·OH的清除作用

葡萄皮渣原花青素對·OH的清除作用如圖9所示。

圖9 葡萄皮渣原花青素對·OH的清除作用Fig.9·OH removal effect of grape pomace procyanidins

通過圖9中的曲線可以發現，在試驗的質量濃度范圍內對·OH的清除率和質量濃度成正比，質量濃度越大，對·OH的清除效果越好。通過線性回歸方程分析，葡萄皮渣原花青素對·OH的半數清除率IC50為0.228 mg/mL，而維生素C對·OH的半數清除率IC50為0.375 mg/mL，說明葡萄皮渣原花青素對·OH的清除能力顯著優于維生素C。

3 結論

試驗表明，釀酒葡萄皮渣原花青素超聲波結合酶法提取的最佳工藝條件為纖維素酶（500 000 U/g）添加量0.30%、酶解溫度55℃、酶解時間90 min、超聲功率400 W、超聲時間30 min、75℃水浴中提取4 h，在此條件下，葡萄皮渣原花青素的得率為（14.22±1.13）mg/g。抗氧化試驗表明，釀酒葡萄皮渣中原花青素的總還原能力、清除DPPH·和·OH的能力顯著高于維生素C，因此葡萄皮渣原花青素具有良好的抗氧化活性。本試驗的研究成果可應用于釀酒產業中，為實現工業化提取葡萄皮渣中原花青素提供理論支持，有較好的發展前景。