復合乳酸菌發酵改性姜渣膳食纖維

杜京京，楊松，朱倩，伍玉菡，郭家剛，江艦

（安徽省農業科學院農產品加工研究所，安徽 合肥 230001）

膳食纖維（dietary fiber，DF）主要是植物的細胞壁多糖，不能被人體消化道的內源酶消化[1]。膳食纖維通常分為可溶性膳食纖維（soluble dietary fiber，SDF）和不溶性膳食纖維（insoluble dietary fiber，IDF），主要包括纖維素、木質素和非淀粉多糖[2]（如半纖維素、果膠和阿拉伯木聚糖低聚糖）。膳食纖維在人體小腸內不能被消化吸收，故其能夠以基本完整的形式進入結腸，從而增加糞便的黏度和體積[3]。飲食干預研究表明，補充膳食纖維可以有益地改變腸道的微生物群，保護腸道屏障功能，對維持機體正常生理功能具有重要作用[4-5]。

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是姜科植物，在世界各地被用作香料[6]、調味品[7]和傳統草藥[8]。生姜中主要含有淀粉、脂肪、蛋白質、纖維素、維生素等多種成分[9]。生姜加工過程中剩余的姜渣中含大量的膳食纖維，但由于主要成分是不溶性膳食纖維，姜渣與蛋白、淀粉等結合程度較差，不利于作為食品原料進行加工，從而導致其利用率較低。通過利用酸堿化學法[10]、酶法[11]、生物發酵法[12]等方法對果蔬殘渣進行改性處理，可以有效提高果蔬殘渣中可溶性膳食纖維含量，增加了果蔬殘渣作為食品原料的可操作性[13]。微生物發酵法改性果蔬殘渣中膳食纖維是一種相對高效且低成本的手段[14]。因此，本文采用保加利亞乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌復合菌種發酵改性姜渣膳食纖維，以提高姜渣中可溶性膳食纖維的含量，制備高品質的姜渣膳食纖維，提高姜渣的利用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 試驗材料與試劑

山東泥姜：市售；脫脂奶粉：雀巢（中國）有限公司；果葡糖漿：邢臺平安糖業有限公司；保加利亞乳酸桿菌、嗜熱鏈球菌（商業凍干粉100億cfu/g，食品級）：鄭州百益寶生物技術有限公司。

1.1.2 試驗設備

破壁機（L12-Y3）：九陽股份有限公司；紗布：常州富羽萊貿易有限公司；智能恒溫培養箱（HW-80）：遼寧賽亞斯科技有限公司；電熱恒溫干燥箱（DHG-9203A）：甘易儀器設備（上海）有限公司；高壓滅菌鍋（BKQ-B50II）：鑫貝西科學儀器（山東）有限公司；高速離心機（TGL-16）：浙江納德科學儀器有限公司；X射線衍射（X’Pert MP）：荷蘭Nalytical公司；掃描電鏡（SU8220）：日本日立公司；固體核磁共振（Bruker AVANCE III 400 WB）：瑞士布魯克公司。

1.2 姜渣發酵過程

取一定量的山東泥姜，切碎。稱取500 g姜碎和2 000 mL 蒸餾水，用破壁機攪碎（20 min），煮沸 5 h，用紗布（4層）過濾。過濾后得到的姜渣在60℃下干燥48 h。稱取干燥姜渣5.0 g和蒸餾水按照一定的料液比調配均勻，將脫脂奶粉1.0 g和果葡糖漿1.0 g加入到液料中，攪拌溶解，裝于發酵罐中，置于高壓滅菌鍋中，120℃滅菌20 min。冷卻后，接種2%保加利亞乳酸桿菌和嗜熱鏈球菌（1∶1，質量比），在一定條件下進行發酵，發酵結束后，加入樣本3倍體積的95%乙醇，靜置12 h，過濾并收集濾渣。將濾渣在60℃下干燥24 h，即得到改性后的姜渣。

1.3 單因素試驗

根據GB 5009.88—2014《食品安全國家標準食品中膳食纖維的測定》[15]，以姜渣中可溶性膳食纖維（SDF）得率為考察指標，分別對發酵溫度、發酵時間、料液比3個因素進行單因素試驗。初步確定復合菌種發酵姜渣的最佳工藝條件。

1.4 響應面優化發酵工藝提高姜渣SDF得率

采用Design-Expert 12.0軟件中Box-Behnken試驗設計方案，根據前期試驗研究結果，選取發酵時間（A）、發酵溫度（B）和料液比（C）3個條件進行響應面優化，試驗安排見表1。

表1 響應面設計因素水平Table 1 The factors and levels of response surface for ginger dregs

1.5 發酵對姜渣加工性能及結構的影響

1.5.1 姜渣持水力的測定

取發酵前后的姜渣各1.00 g分別置于100 mL燒杯中，分別加入50 mL蒸餾水，在室溫（27℃）下用磁力攪拌器攪拌30 min，4 000 r/min離心20 min，除去上層水分，稱取殘留物的質量（g），按照式（1）計算持水力，并比較兩者之間持水力的變化。

1.5.2 姜渣溶脹力測定

取發酵前后的姜渣各1.00 g，加入20 mL量筒中，搖動樣品，使其在量筒中平鋪均勻，記錄下此時干樣品的體積（mL），分別加入10 mL蒸餾水，均勻振蕩后，在室溫（25℃）下靜置24 h后，分別記錄此時樣品的體積（mL），比較兩者溶脹力的變化并按式（2）計算。

1.6 發酵對姜渣的形貌及結構的影響

1.6.1 光學顯微鏡（optical microscope，OPM）觀察

取少量發酵前后的姜渣置于凹槽載玻片上，用乙醇∶甘油（2∶1，體積比）分散，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察。

1.6.2 掃描電鏡（scanningelectronmicroscope，SEM）觀察

取發酵前后的姜渣，用棉棒沾取少量，分別放于導電膠上，噴鍍，采用SEM觀察。

1.6.3 X-射線衍射（X-ray diffraction，XRD）測定

XRD的主要掃描參數如下：Cu靶，測試電壓40kV，電流 40 mA；掃描速度 2°/min，掃描范圍 3°～40°。

1.6.413C固體核磁共振波譜（solid-state nuclear magnetic resonance spectrometer，CP MAS NMR）測試

13C CP MAS NMR測試的操作頻率為75.5 MHz。樣品放入4 mm的ZrO2回轉管中，轉速是5 kHz，補償時間20 ms，接觸時間1 ms，2個脈沖之間延遲3 ms。

1.7 數據處理

試驗數據均平行測定3次，以平均值±標準差的方式表示最終的結果。數據采用origin 9.0統計軟件進行分析。響應面試驗數據采用Design-Expert 12.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 發酵溫度對姜渣中SDF得率的影響

準確稱取5.0 g未發酵的姜渣置于50 mL發酵培養液中，在發酵液料中加入2%的發酵劑，然后分別在38、40、42、44、46 ℃的培養溫度下培養 48 h，測定 SDF得率，結果如圖1所示。

圖1 發酵溫度對姜渣中SDF得率的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on the yield of SDF in ginger dregs

由圖1可知，隨著發酵溫度的逐漸升高，SDF得率不斷增加，當發酵溫度為42℃時，姜渣中SDF得率達到最大。發酵溫度繼續增加，SDF得率顯著下降，這可能是因為過高的發酵溫度抑制了復合菌種的反應活性。因此，選擇42℃為最佳發酵溫度。

2.1.2 發酵時間對姜渣中SDF得率的影響

準確稱取5.0 g未發酵的姜渣置于50 mL發酵培養液中，在發酵液料中加入2%的發酵劑，在42℃下分別培養 24、36、48、60、72、84 h，測定 SDF 得率，結果如圖2所示。

圖2 發酵時間對姜渣中SDF得率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the yield of SDF in ginger dregs

由圖2可知，姜渣中SDF得率隨發酵時間的增加先增加后減少，在48 h達到最大值。處于較短的發酵時間時，菌種處于生長期，菌種的數量和活力均較低。隨著發酵時間的增加，菌種生長到達穩定期，姜渣中SDF得率逐漸達到最大值。持續發酵后，菌種的活力下降，發酵產生的次級代謝產物不斷增加，部分SDF被分解，造成得率下降。因此，選擇48h為最佳的發酵時間。

2.1.3 料液比對姜渣中SDF得率的影響

按照料液比 1∶3、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）將未發酵的姜渣與發酵液混合，分別在液料中加入2%的發酵劑，在42℃下培養48 h，測定SDF得率，結果如圖3所示。

圖3 料液比對姜渣中SDF得率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on the yield of SDF in ginger dregs

由圖3可知，隨著溶劑添加量增加，菌種與姜渣的接觸更加充分，姜渣中SDF得率增加，在料液比為1∶15（g/mL）時達到最大值。但當溶劑添加量大于1∶10（g/mL）后，姜渣中SDF的含量變化趨勢平緩后下降，可能是由于隨著水體積的繼續增大，反應底物被稀釋。因此，選擇1∶10（g/mL）為最佳發酵液料比。

2.1.4 響應面結果與分析

根據單因素試驗結果，選取發酵時間、發酵溫度、料液比3個因素的最優試驗條件，采用Box-Benhnken試驗設計對姜渣發酵條件進行3因素3水平的響應面分析試驗，包括17個析因試驗和5個中心試驗。運用Design-Expert 12.0軟件中Box-Behnken程序對各個試驗點的響應值進行回歸分析，試驗結果見表2。利用ANOVA分析表2數據，結果見表3。

表2 Box-Behnken試驗設計及相應結果Table 2 Box-Behnken design and the experimental results

表3 回歸方程中回歸系數的估計值及方差分析Table 3 Results of the Box-Behnken design regression analysis

該試驗回歸方程為：R1=9.412+0.05125A+0.03375B+0.032 5C-0.017 5AB+0.005AC+0.035BC-0.099 75A2-0.247 5B2-0.176 725C2。

該模型的復相關系數的平方R2=99.63%，說明回歸方程的擬合程度良好，失擬較小，可以用該方程進行模擬分析。失擬項的P=0.127 5，沒有顯著性影響，信噪比為15.838遠大于4，說明數據中沒有異常點，回歸方程擬合度和可信度較高，模型適當。

通過表3中P值可知：方程中A2、B2、C2對SDF得率的影響達到極顯著水平，BC、AB為影響顯著，表明試驗因子的二次項對響應值影響較大，這和模型回歸中的線性和平方項影響顯著相對應。當姜渣SDF得率最大時，A=0.021；B=0.01；C=0.01；從而分析得到姜渣發酵的最佳工藝條件為發酵溫度42.02℃，發酵時間48.01 h，料液比 1∶10.01（g/mL），得到姜渣 SDF 得率為9.416%。根據實際操作性，發酵工藝采用發酵溫度42 ℃、發酵時間 48 h、料液比 1∶10（g/mL），實際測得SDF得率為9.42%，兩者相對誤差很小。因此，Box-Behnken試驗設計所得的最佳工藝參數準確可靠，具有實用價值。

各個因子交互作用的響應面的3D和等值線分析如圖4～圖6所示。

圖4 發酵時間和發酵溫度對SDF得率響應面分析Fig.4 The analysis on response surface of fermentation time and fermentation temperature

圖5 發酵時間和料液比對SDF得率響應面分析Fig.5 The analysis on response surface of fermentation time and solid-liquid ratio

圖6 發酵溫度和料液比對SDF得率響應面分析Fig.6 The analysis on response surface of fermentation temperature and solid-liquid ratio

由圖4可知，圖形略呈橢圓形，說明發酵時間和發酵溫度的具有一定的交互作用。發酵溫度的軸向等高線變化比發酵時間軸向等高線的變化相對密集。因此，發酵溫度對響SDF得率的影響較發酵時間影響大。

由圖5可知，當發酵溫度位于中心水平時，圖形呈圓形，發酵時間和發酵溫度的交互作用不強。

由圖6可知，圖形呈現橢圓形，說明發酵時間和料液比的交互作用顯著。發酵溫度的軸向等高線的密集程度顯著高于料液比軸向等高線的變化。因此，發酵溫度對SDF得率的影響較料液比影響大。

2.2 發酵對姜渣加工性能及結構的影響

2.2.1 發酵對姜渣持水力和溶脹力的影響

發酵對姜渣持水力和溶脹力的影響如表4所示。

表4 發酵對姜渣的膨脹力和持水力的影響Table 4 Effect of fermentation on swelling power and water holding capacity of ginger dregs

由表4可知，發酵后姜渣的膨脹力和持水力分別增加了35.96%和9.97%。姜渣中含有大量的膳食纖維素。這些膳食纖維素存在著無定形區，當吸水后，無定區變大，膳食纖維表現出膨脹。膳食纖維的大分子中含有許多—OH，可以與H2O分子形成配位鍵，形成持水力。發酵后姜渣的膨脹力和持水力均提高，說明發酵促使姜渣中形成了更多聚合度低、具有無定型結構的可溶性膳食纖維，同時，姜渣膳食纖維的結構更加疏松，更多親水基團（如—OH）暴露出來。姜渣的持水力增加，加工性能提升，可用于食品工業中食品品質改性，如改善食品黏度與質構特性等。

2.2.2 發酵對姜渣結構的影響

在光學顯微鏡下觀察發酵對姜渣結構的影響，結果如圖7所示。

圖7 姜渣發酵前和發酵后的顯微鏡圖片（20×20倍）Fig.7 The microscope images of ginger dregs before fermentation and after fermentation

從圖7可以看出，發酵前姜渣中的纖維素等交錯重疊，呈現面積較大的團聚物。發酵后，團聚物體積減小，纖維結構的交錯減少，碎片結構增加。發酵促使姜渣的團聚減小、比表面積增大，增加了纖維中的親水基團暴露率，提高姜渣的持水力和膨脹力。

2.2.3 發酵對姜渣微觀結構的影響

在掃描電鏡下觀察發酵對姜渣微觀結構的影響，結果如圖8所示。

圖8 姜渣發酵前后的SEM圖片Fig.8 SEM images of ginger dregs before and after fermentation

圖8A1～A2顯示了未發酵的姜渣有完整清晰的纖維結構，纖維聚集在一起，形成網絡空腔結構，團聚的顆粒表面也具有大量褶皺。圖8B1～B2顯示，發酵在一定程度上分解了姜渣纖維的微結構、切斷其大分子結構，形成了分子量較小、鏈長較短的結構。圖8B2顯示發酵后姜渣中的物質干燥后粘結成片層狀，說明水溶性物質增多，樣品干燥后更易粘結。

2.2.4 發酵對姜渣晶體結構的影響

在XRD下觀察發酵對姜渣晶體結構的影響，結果如圖9所示。

圖9 姜渣發酵前后的XRD圖片Fig.9 XRD pictures of ginger dregs before and after fermentation

圖9顯示，姜渣發酵后，14°和16°左右的峰消失，說明姜渣中體積較大的晶體結構減少。20°和22°的峰的分辨率下降，說明發酵后姜渣中無定型物質（如SDF等）增加。

2.2.5 發酵對姜渣13C CP MAS NMR圖譜的影響

在13C CP MAS NMR下觀察發酵對姜渣晶體結構的影響，結果如圖10所示。

圖10 姜渣發酵前后的13C CP MAS NMR圖片Fig.10 13C CP MAS NMR images of ginger dregs before and after fermentation

由圖10可知，發酵前姜渣的結構中C1的信號峰位于 92×10-6～108×10-6；C2、C3 和 C5 的信號峰出現在65×10-6～75×10-6之間；C4 和 C6 的信號峰則分別位于75×10-6～85×10-6和 55×10-6～62×10-6處。發酵對姜渣的核磁共振圖譜的分辨率的差異主要在C1位置。姜渣經過發酵處理后，C1位置出現了兩個顯著的峰形，說明發酵后纖維的聚集程度降低，結構更加松散，原本重疊的信號峰被區分出來。

3 結論

采用接種2%復合菌種，發酵制備姜渣SDF的最佳工藝參數如下：發酵溫度42℃、發酵時間48 h、料液比1∶10（g/mL），該條件下發酵姜渣中SDF的得率為9.42%。發酵后的姜渣的SDF含量顯著提升，膨脹力和持水力增加。通過顯微觀察和結構測定發現發酵后姜渣的表面結構改變，無定型物質增多，膳食纖維結構更加規整。乳酸菌復合發酵法可以提高姜渣中SDF的含量，但是對于發酵后姜渣膳食纖維的物質組成及結構變化有待進一步研究。