QuEChERS-UPLC-MS/MS測定人參中19種植物生長調節劑殘留及膳食暴露評估

彭韻潔，陳麗娜，楊明，王奇，時東方，王晶，劉春明

（長春師范大學中心實驗室，吉林 長春 130032）

植物生長調節劑（plant growth regulator，PGR）是從外部施加給植物，顯著改變植物生長發育的化學物質[1]，目前已廣泛應用于中藥材的種植栽培。與傳統農業技術相比，植物生長調節劑具有高效、低毒的特性，在促產增量、改質抗逆等方面發揮了重要的作用[2]。但使用不合理仍會導致其在中藥材里殘留，存在降低中藥材活性成分含量和危害食用者健康的風險。如丁酰肼的水解產物非對稱二甲基聯氨具有致畸、致癌的危害[3]；乙烯利過量食用后會加速衰老，腐蝕消化道，造成消化道潰瘍[4]；赤霉素會影響機體新陳代謝和內分泌系統等[5]。GB 2763—2019《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中規定了食品類產品中22種植物生長調節劑的最大殘留限量[6]，目前中藥材中植物生長調節劑的殘留限量與檢測標準尚不明確，因此該標準的建立具有緊迫性和必要性。

中藥材人參為五加科植物人參（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根和根莖，人參（人工種植）于2012年被衛生部批準為新資源食品。人參作為日常補品已融入人們的日常生活，如時下盛行的“人參養榮湯”、“人參黃精正氣茶”、“人參糕”、“參雞湯”等已被人們廣泛使用[7-8]。但由于人參的生長周期長，且根芽和種子均具有休眠特性[9]，在種植過程中人們往往會使用大量的植物生長調節劑促使其打破休眠，快速生長。近年來，利用超高效液相色譜-串聯質譜技術（ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測蔬菜、水果及糧油產品中植物生長調節劑報道較多[10-13]，但檢測人參中植物生長調節劑的報道較少。宋志峰等[14]研究了人參中4種植物生長調節劑的殘留，其中涉及的PGR種類較少，且覆蓋面窄。本試驗采用QuEChERS結合UPLC-MS/MS的方法分析了人參中19種植物生長調節劑的殘留狀況，并基于攝入風險，對檢測結果呈陽性的物質進行了膳食暴露評估，以期為植物生長調節劑在人參生產中的科學使用及食用安全性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試驗試劑

1.1.1.1 供試品

人參樣品：長白山各人參種植基地，共12批樣品。

1.1.1.2 試劑

甲醇、乙腈（色譜純）：美國Fisher Science公司；甲酸（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、C18、石墨化碳黑（graphitized carbon，GCB）：美國 Sigma 公司；0.22 μm有機系濾膜：天津美瑞泰克公司；無水硫酸鎂（分析純）：北京化工廠；氯化鈉、甲酸銨（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.1.3 植物生長調節劑標準品

甲醇中丁酰肼、甲醇中氯吡脲、甲醇中噻苯隆脫葉靈、甲苯中氯苯胺靈、丙酮中胺鮮脂、乙腈中赤霉素、甲醇中6-芐基腺嘌呤、異丙醇中矮壯素、甲苯中多效唑、正己烷中烯效唑（濃度為1 mg/mL）：北京壇墨質檢科技有限公司；萘乙酸（純度≥99.9%）、氯化膽堿（純度≥99%）、吲哚-3-乙酸（純度≥99.9%）、吲哚-3-丁酸（純度≥99.9%）、5-硝基愈創木酚鈉（純度≥99.9%）、4-氯苯氧乙酸（純度≥99.9%）、6-糠氨基嘌呤（純度≥99.9%）、異戊烯腺嘌呤（純度≥99.9%）、反玉米素（純度≥99.9%）、氘代莠去津（純度≥99.5%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.1.2 試驗儀器

超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀（Acquity Xevo TQ-S）：美國Waters公司；高速冷凍離心機（3-30K）：美國Sigma公司；實驗室純水制備系統（Milli-Q Integral 3）：美國 Millipor公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：WatersACQUITYUPLCBEHC18柱（50mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：A為0.01%甲酸水溶液，B為乙腈。梯度洗脫條件：0～2 min（95%A→90%A），2 min～5 min（90%A→50%A），5 min～8 min（50%A→25%A），8 min～9 min（25%A→5%A），9 min～10 min（5%A→95%A）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：5.0 μL。

1.2.2 質譜條件

試驗采用電噴霧離子源，正負離子掃描，多反應監測模式（multi-reaction monitoring mode，MRM），其離子源參數如下：毛細管電壓1.00 kV，源內碰撞解離電壓50 V，脫溶劑氣溫度350℃，脫溶劑氣流速700 L/h，霧化氣壓強7.0 bar（1 bar＝100 000 Pa），碰撞氣流速0.15 mL/min，離子源溫度150℃。

1.2.3 標準品溶液的制備

準確稱取氯化膽堿、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-乙酸、5-硝基愈創木酚鈉、4-氯苯氧乙酸、6-糠氨基嘌呤、異戊烯腺嘌呤、反玉米素標準品1.0 mg分別于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成100 μg/mL的儲備液，其余11種植物生長調節劑為1 mg/mL的液體標準溶液。稱取內標化合物氘代莠去津10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1 mg/mL的內標儲備溶液。上述儲備液均置于-20℃冰箱中保存。

分別準確量取一定體積的上述標準貯備液，用甲醇定容至10 mL，配制噻苯隆、4-氯苯氧乙酸、氯吡脲、氯苯胺靈濃度為10 μg/mL，5-硝基愈創木酚鈉、異戊烯腺嘌呤、赤霉素、6-芐基腺嘌呤、氯化膽堿、矮壯素、丁酰肼、吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丁酸、反玉米素、萘乙酸濃度為1 μg/mL，烯效唑、多效唑、胺鮮酯、6-糠氨基嘌呤濃度為0.1 μg/mL的混合標準溶液，使用時稀釋成一系列濃度的標準溶液，待測。

1.2.4 供試品溶液的制備

精確稱取樣品粉末2 g（過3號篩），置50 mL聚苯乙烯離心管中，加入5 mL超純水，渦旋混勻后靜置1 h，加入10 mL 0.1%甲酸-乙腈，置振蕩器上（500次/min）劇烈振蕩2 min，加入4 g無水硫酸鎂和1 g氯化鈉混合物，立即搖散，置振蕩器上劇烈振蕩2 min，于4℃下4 000 r/min離心10 min，吸取上層乙腈提取液2 mL置15 mL聚丙烯離心管中，30℃下氮吹濃縮至干，用乙腈和水（1∶9，體積比）定容 1 mL，渦旋混勻，過 0.22 μm 微孔濾膜，供UPLC-MS/MS測定，并視情況進一步稀釋。

1.2.5 樣品分析

按1.2.4中方法制備12批人參的供試品溶液，按色譜質譜條件測定，采用內標法計算人參中檢測顯陽性的植物生長調節劑的含量。每批樣品平行2份，每份溶液進樣3次。

1.2.6 膳食暴露評估

1.2.6.1 人參中各植物生長調節劑的單一危害

參照文獻[15]中的評估方法，計算各化合物的危害商（hazard quotient，HQ），當 HQ＞1時，則表明膳食暴露風險較大，反之當HQ＜1時，則表明膳食暴露風險較低。HQ的計算方法如下。

式中：殘留量為人參中檢測出的PGR含量，mg/kg；平均膳食量參照2020版《中國藥典》的規定，人參日均食用量在3 g～9 g，本研究按5 g/d計算；平均體重按60 kg計算；每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI）參照GB 2763—2019《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中的規定，mg/kg bw。

1.2.6.2 人參中各植物生長調節劑的總危害

采用各化合物的危害指數（hazard index，HI）進行評估，該方法簡單快速，多用于初級的累積風險評估。當HI＜1時，表明總的膳食暴露風險較低；當HI＞1時，則表明總的膳食暴露風險較大，這時則需推算出具有累積效應的物質基于共同作用終點的參考值，從而計算出相應的HI，然后再進行比較。具體計算方法如下。

2 結果與分析

2.1 分析條件的選擇

2.1.1 色譜條件的優化

試驗分別以乙腈、甲醇作為有機相，不同濃度甲酸銨、甲酸作為添加劑，對洗脫體系進行了考察，并進一步優化洗脫梯度，從而確定最佳洗脫條件。各化合物的提取離子流圖見圖1。

結果表明，當乙腈作為流動相時，基線噪音較低、峰形較好且響應值增高。同時大多數化合物在5mmol/L甲酸銨+0.1%甲酸溶液、0.01%的甲酸水溶液中分離較好且信號穩定。氯苯胺靈在甲酸銨溶液作為流動相時信號低，峰形差，但在0.01%的甲酸水溶液中響應度增強，且峰形得到了改善。以優先考慮受流動相影響較大的氯苯胺靈為原則，結合化合物整體分離度、離子靈敏度等因素，最終確定以乙腈-0.01%甲酸水溶液作為流動相，并采用1.2.1中梯度洗脫方式進行洗脫。

2.1.2 質譜條件的優化

試驗分別將200 ng/mL 19種PGR單一標準溶液通過針泵引入質譜系統，在電噴霧電離源（electro spray ionization，ESI）正負離子同時掃描的情況下尋找母離子，并對母離子進行子離子掃描和碰撞能優化，從而得到質譜分析參數，19種化合物的優化結果如表1所示。

表1 19種植物生長調節劑的質譜分析參數Table 1 Mass spectrum parameters for 19 plant growth regulators

結果表明不同的化合物之間結構差異較大，電離行為也有所不同，11種化合物在正離子模式下靈敏度較高、穩定性較好，8種化合物在負離子模式下有較好的靈敏度和穩定性。在兩個子離子中，靈敏度高、穩定性和重現性好的子離子為定量離子，次之的為定性離子。

2.1.3 凈化條件的優化

QuEChERS方法常用的凈化材料有 C18、PSA、GCB，為了明確凈化材料對目標待測物的影響，本試驗對每種凈化材料分別單獨進行考察。結果表明PSA對極性較大的化合物如丁酰肼、矮壯素的吸附程度高，GCB對平面結構化合物如4-氯苯氧乙酸、氯吡脲的回收率影響較大，C18主要吸附極性較弱的脂肪酸、烯烴類及甾醇等基質干擾。相比較之下C18的凈化效果優于前兩者，但回收率為80%～120%的化合物只有12種，且氯吡脲回收率幾乎為0，仍不能滿足分析需要。而未凈化提取液的回收率均在75%以上，為保證檢測結果的準確性，本試驗采取不凈化措施，提取后直接進樣檢測。這與劉佳銘等[16]和Sutcharitchan等[17]的研究結果一致。試驗表明，由于串聯質譜具有極高的專屬性和靈敏度，可以從復雜基質中有效地檢測出待測成分，滿足分析需要。但采用此種方法后續一定要定期檢查色譜柱適用性，加強儀器設備維護保養。

圖1 19種植物生長調節劑的定量離子色譜圖Fig.1 Quantitative ion chromatogram of 19 plant growth regulators

2.1.4 基質效應

基質效應（matrix effect，ME）是指除被分析物以外的樣品中其他組分對分析物的干擾，基質效應普遍存在痕量分析的物質中，常常會影響分析結果的準確性。根據基質成分對目標化合物響應強度的不同影響，可分為基質增強和基質抑制效應。本試驗采用人參空白基質標準曲線與流動相標準曲線的斜率比值評價ME，當ME在85%～115%時，則基質效應可以忽略。當ME小于85%或大于115%時，為基質抑制或增強[18]。經初步檢測，大部分植物生長調節劑存在基質抑制，應該對基質效應進行校正，故本試驗采用人參空白基質匹配標準曲線進行定量。

2.2 方法學考察

2.2.1 檢出限和定量限、線性范圍

用人參空白基質按1.2.4方法制備人參空白基質提取液，稀釋混合對照品標準溶液配制一系列濃度的基質匹配對照品溶液，以濃度為橫坐標，植物生長調節劑定量離子對峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標，進行線性回歸計算，得到相應的線性回歸方程及相關系數。以3倍信噪比對應的最小濃度作為檢出限，10倍信噪比對應的最小濃度作為定量限。結果見表2。

表2 植物生長調節劑的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，limits of detection（LOD）and limits of quantification（LOQ）of plant growth regulators

續表2 植物生長調節劑的線性方程、相關系數、線性范圍、檢出限和定量限Continue table 2 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges，limits of detection（LOD）and limits of quantification（LOQ）of plant growth regulators

結果表明19種植物生長調節劑在相應的濃度范圍內具有良好的線性關系，相關系數R2均大于0.99。由于試驗初步篩選過程中未發現氯化膽堿的人參空白藥材，故采用初始梯度溶劑進行氯化膽堿的標準曲線繪制，而實際測試過程中存在基質效應，因此氯化膽堿的方法學考察結果及定量范圍僅供參考。大部分化合物在0.025 μg/kg～5 μg/kg滿足其定量檢測要求。氯苯胺靈響應較低，定量限為50 μg/kg。

2.2.2 精密度

選取濃度為50 ng/mL的流動相混合標準溶液，按質譜、色譜條件進行進樣，連續測定6次，19種植物生長調節劑的RSD在1.09%～5.57%（n=6），結果表明該方法精密度良好。

2.2.3 加樣回收

本試驗進行了 25、50、100 μg/kg 3 個水平（n=5）的加標回收試驗，結果見表3。

表3 19種植物生長調節劑的平均回收率和相對標準偏差Table 3 Average recoveries and RSDs of 19 PGRs

所有化合物平均回收率均大于74%，RSD小于15%，滿足考察要求。

2.3 樣品測定

應用本試驗的方法對12批樣品進行了檢測，結果見圖2。12批人參樣品共檢測出氯化膽堿、矮壯素、丁酰肼3種植物生長調節劑的殘留。其中氯化膽堿在12批藥材中均有檢出，殘留最多；其次為矮壯素，10批人參樣品顯陽性；8批藥材中檢測到丁酰肼殘留。

圖2 人參樣品中的質譜多反應監測色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring chromatograms of ginseng sample

2.4 膳食評估

人參為藥食同源植物，由于各國文化背景、飲食習慣等不同，關于人參的分類也有所差異。在我國GB 2763—2019《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中將人參歸為“藥用植物”，歐盟則將人參歸類在“茶、咖啡、草本浸劑、可可和角豆樹”，食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）、韓國和加拿大將人參分在“塊根和塊莖類蔬菜”里，而人參在日本則被作為“其他蔬菜”[19]。在中國，人參作為滋補圣品，是餐桌上的“常客”，因此本研究以果蔬類的植物生長調節劑攝入風險評估作為人參的評價依托。評估結果如表4所示。

根據檢測結果可知，12批人參中矮壯素的HQ為1.20×10-4～1.50×10-3，氯化膽堿為 5.61×10-2～7.97×10-2，丁酰肼為1.88×10-6～1.33×10-5，遠低于風險值1。氯化膽堿與矮壯素同屬季銨類化合物，在結構上非常相似，兩者之間僅相差一個氯離子，因此本文擬采用矮壯素的ADI值進行評估。二者均能引起皮膚、眼睛等刺激不適，且在部分植物體內矮壯素可轉化為氯化膽堿[20]，此處氯化膽堿的高檢出極有可能是過量矮壯素在植物體內轉化而成，基于累積風險考慮，本文進一步采用HI法做了氯化膽堿、矮壯素初級的累積風險評估。結果表明估值為0.056～0.081，小于風險值1，未達到健康關注水平，因此人參膳食攝入風險較低。反觀所檢出物質的檢出率，氯化膽堿可達100%，矮壯素、丁酰肼分別為83.3%、66.7%。檢出的3種化合物均屬于植物生長延緩劑類，主要作用為抑制植物光呼吸，促進根系膨大，提高塊根和塊莖產量，由此可推測植物生長延緩劑在人參種植過程中應用十分廣泛。

我國《農藥管理條例》將PGR作為農藥而進行統一管理。不同的是PGR不以殺傷有害生物為目的，所以其毒性不強，一般為低毒或微毒。但經動物學實驗發現，即使動物每天攝入的矮壯素低于人類每日允許攝入量，也會對其生殖能力產生不良的影響。丁酰肼在植物體內較穩定，可通過食物鏈傳輸，進而影響人體健康。同時植物生長調節劑的濫用，尤其是難降解的化合物，在土壤中有富集作用，會繼續進入到后茬作物中，對其生長發育產生影響。因此不合理使用，對作物本身及人體都是有害的，相關部門對此應引起足夠的重視，及時制定相關的殘留限量標準及合理使用準則。

3 結論

本文通QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜技術同時測定了人參中19種植物生長調節劑的殘留量，方法學考察及實際樣品測定證明該方法具有簡便、快速、準確度高、成本小等優點，具有一定的推廣價值。文章進一步對檢出的3種植物生長調節劑做了膳食攝入風險評估。總體趨勢為延緩類的PGR檢出率高，但殘留量較低，未達到健康關注水平。在評估過程中本文選用的是人均人參消費量，因個體差異，消費量也有所不同，因此結果具有可參考性。在實際生活中，人們飲食多以復合結構為主，因此僅探討一類樣品在一定程度上估值會偏低，后續探究應注重檢測多品類作物（如谷類、蔬菜、水果、茶飲等）中植物生長調節劑的殘留，對于有相同毒性機制的化合物進行相應的累積風險評估，結果更能代表真實客觀情況。類似于人參這種藥食同源的植物，廣泛存在我們的餐飲及日常保健食品中，但植物生長調節劑的使用尚缺少足夠的科學研究和應用指導，使用不規范導致的殘留問題可能較其他農作物更為嚴重，應當引起足夠的重視。本文是對植物生長調節劑多殘留檢測技術及膳食風險的進一步探索，為規范人參種植過程中植物生長調節劑使用行為提供了理論支持。