不同乳酸菌發(fā)酵葡萄酵素過程中代謝產(chǎn)物及其抗氧化特性分析

梁紅敏，郭亞蕓，史紅梅

（山東省葡萄研究院，山東 濟南 250100）

根據(jù)國際葡萄與葡萄酒組織（International Organisation of Vine and Wine，OIV）2018 年數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2017年全球用于釀酒的葡萄占比52%，中國的葡萄主要以鮮食為主（占比83%），鮮食是釀酒的7.5倍[1]。鮮食葡萄如巨峰葡萄一般粒大汁甜、營養(yǎng)豐富，廣受消費者喜愛，然而由于其皮薄、含糖量高、果實硬度低，極易受機械損傷以及微生物污染等特點，不易儲存和運輸，葡萄產(chǎn)后流通環(huán)節(jié)薄弱，導(dǎo)致我國鮮食葡萄年損耗率達27%，從而制約了鮮食葡萄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2-6]。目前，我國酵素產(chǎn)業(yè)正處于高速發(fā)展時期，酵素生產(chǎn)水平不斷提高，生產(chǎn)規(guī)模也在不斷擴大，現(xiàn)在產(chǎn)品出口量增多，正在打開國際市場。將鮮食葡萄制作成酵素產(chǎn)品，不僅能減少我國鮮食葡萄的損耗，并且能夠極大地提高產(chǎn)品的附加值。

在酵素食品行業(yè)里，常用的微生物有乳酸菌類、酵母菌及其復(fù)配菌等。通過選擇不同益生菌發(fā)酵酵素飲料，可以獲得不同營養(yǎng)價值和風(fēng)味的酵素產(chǎn)品。乳酸發(fā)酵是最古老、最經(jīng)濟的發(fā)酵方法和最有價值的生物技術(shù)方法之一，用于維持或改善水果的營養(yǎng)、感官、安全和保質(zhì)期[7]。楊志鵬等[8]對海棠果酵素中的益生菌菌株進行篩選，優(yōu)選出鼠李糖乳桿菌217-3為發(fā)酵菌株。葛瑞宏等[9]選擇益生菌（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌）為發(fā)酵菌種制備桂圓酵素，獲得的桂圓酵素原液營養(yǎng)豐富且具有一定的抗氧化活性。馬曉偉等[10]以產(chǎn)乳酸芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌、植物乳桿菌為發(fā)酵菌株制備火龍果酵素，得到的酵素飲品不僅具有清雅和諧的果香和發(fā)酵香味，而且營養(yǎng)豐富。

本研究以巨峰葡萄為發(fā)酵原料，選擇干酪乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌4種乳桿菌分別進行發(fā)酵，跟蹤檢測不同乳酸菌發(fā)酵葡萄酵素過程中代謝組分及抗氧化活性的變化，為鮮食葡萄深加工提供數(shù)據(jù)支撐和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巨峰葡萄采自山東省葡萄研究院仲宮試驗基地，位于濟南市歷城區(qū)仲宮鎮(zhèn)臥虎山水庫南岸。

副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

乳酸菌通用培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基）參照文獻[11]配制。蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、磷酸氫二鉀2 g、檸檬酸氫二銨2g、乙酸鈉5g、葡萄糖20g、吐溫801mL、MnSO40.25 g、MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH6.2～6.4，121℃高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min。固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.8%瓊脂。

1，1-二苯-2-三硝基苯肼 （1，1-dipheny1-2-picryhydrazyl，DPPH）、2，2'-聯(lián)氮雙（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2'-azino-bis-（3-ethylbmzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS]、6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸（6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid，Trolox）、2，4，6-三 （2-吡啶）-1，3，5-三嗪[2，4，6-Tris（2-pyridyl）-5-triazine，TPTZ]、沒食子酸（gallic acid，GAE）標(biāo)準(zhǔn)品、福林酚試劑：美國Sigma公司；氫氧化鈉、鄰苯三酚、福林酚、三氯化鐵、無水乙醇、乙酸鈉、濃鹽酸（均為分析純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試盒：蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TDL-5型高速離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；UV5200紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司；BPC-生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-ZD雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；ML204/2型電子天平、FE20pH計：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；THZ-C-1型臺式恒溫振蕩器：蘇州培英實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及生長曲線的繪制

菌種活化參照文獻[12]的方法，并略作修改。從安瓿瓶中取出菌種，接入MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃培養(yǎng)24 h，再繼代培養(yǎng)2次后，活化液在4 000 r/min，4℃條件下離心10 min，收集微生物菌體，用0.1%的無菌生理鹽水進行洗滌，制成種子液（濃度1×109cfu/mL）。

乳酸菌生長曲線的繪制：將活化后的副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌種子液分別接入100 mL MRS的液體培養(yǎng)基，接種量為3%，發(fā)酵溫度為37℃，從接種開始計時，每隔2 h分別測量其活菌數(shù)，連續(xù)測量20 h。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，生物量OD660nm值為縱坐標(biāo)，分別繪制副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的生長曲線。

1.3.2 葡萄酵素的制備

將葡萄洗凈瀝干，破碎，加入干凈的玻璃壇中，65℃滅菌15 min，冷卻后在無菌操作臺中按1×108cfu/mL接種量分別加入4種乳酸桿菌，進行密封發(fā)酵，每天無菌條件下攪拌1次，連續(xù)發(fā)酵15 d，在發(fā)酵的過程中前7 d每天連續(xù)取樣，然后每隔1 d取樣。

1.3.3 發(fā)酵過程中微生物生長的變化

參考Yang等[13]的方法，采用菌落計數(shù)法測定發(fā)酵過程中微生物（乳酸菌）的生長情況。在不同的時間間隔提取發(fā)酵的葡萄酵素樣品，然后立即進行微生物培養(yǎng)。在一系列的稀釋過程中，用擴散平板法將樣品接種到MRS平板培養(yǎng)基上。接種后，將平板倒置，在37℃培養(yǎng)72 h。然后計算菌落總數(shù)，結(jié)果顯示為log10轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)。將周圍有透明帶的菌落計數(shù)為總?cè)樗峋⒂涗浢看芜B續(xù)稀釋時3個平板的平均值。

1.3.4 pH值的測定

pH值由酸度計直接進行測定。

1.3.5 總酸的測定

參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》對樣品進行總酸含量測定，結(jié)果以乳酸（g/L）計。

1.3.6 SOD酶活力的測定

將葡萄酵素液在4000r/min離心10min后，取上清液，根據(jù)SOD測試盒說明書進行SOD酶活力的測定。

1.3.7 總酚含量的測定

參考王華等[14]的方法，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別對4種不同乳酸菌發(fā)酵樣品，再按照制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進行操作。沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為 y=0.000 9x+0.007 9，R2=0.999 1，其中：y 為吸光度，x為沒食子酸濃度（μg/mL）。

1.3.8 對DPPH自由基清除作用的測定

參考 Espín 等[15]的方法，稱取 0.039 4 g DPPH，用無水乙醇定容至100 mL，再用無水乙醇配制成濃度為1×10-4mmol/L的DPPH溶液。取發(fā)酵過程中不同時間間隔的樣品溶液以10 000×g離心5 min，去除發(fā)酵樣品中的不溶性殘渣。取上清液0.5 mL分別加入3.5 mL DPPH乙醇溶液中，避光反應(yīng)2 h，測量其在波長517 nm處的吸光度值（Ai）。取0.5 mL無水乙醇與3.5 mL DPPH溶液反應(yīng)，避光反應(yīng)2 h，波長517 nm處測吸光度值（A0），按照下列公式計算自由基清除率。

以水溶性維生素E類（Trolox）為標(biāo)準(zhǔn)品，以不同Trolox濃度對清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以每升（L）發(fā)酵樣品中 Trolox（μmol）的量表示[17]。DPPH 乙醇體系標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=0.403 4x+1.444 7，R2=0.999 2。

1.3.9 對ABTS+自由基清除作用的測定

參考MARFIL等[16]的方法配制ABTS反應(yīng)儲備液，使用時用無水乙醇將其稀釋至吸光度值為0.70±0.02，取發(fā)酵過程中不同時間間隔的樣品溶液以10 000×g離心5 min，去除發(fā)酵樣品中的不溶性殘渣，取上清液200 μL分別加入6.0 mL ABTS工作液中，避光反應(yīng)30 min，以乙醇溶劑作空白對照，測量其在波長734 nm處的吸光度值（Ai）。取200 μL無水乙醇與6.0 mL ABTS工作液反應(yīng)，避光反應(yīng)30 min，波長734 nm處測吸光度值（A0），按照下列公式計算自由基清除率。

以Trolox（水溶性維生素E類）為標(biāo)準(zhǔn)品，以不同Trolox濃度對清除率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以每升（L）發(fā)酵樣品中 Trolox（μmol）的量表示[17]。ABTS 乙醇體系標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為y=0.168 4x-0.146，R2=0.999 6。

1.3.10 鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）測定

參考Suárez B等[18]的方法，略作修改，取發(fā)酵過程中不同時間間隔的樣品溶液以10 000×g離心5 min，去除發(fā)酵樣品中的不溶性殘渣，取上清液200 μL分別加入4.0 mL TPTZ工作液（由0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液25 mL，10 mmol/L TPTZ 溶液 2.5 mL，20 mmol/L FeCl3溶液2.5 mL組成）。混勻后37℃反應(yīng)10 min，波長593 nm測定吸光度值。

以水溶性維生素E類（Trolox）為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以不同Trolox濃度對吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以每升發(fā)酵樣品中Trolox（μmol）的量表示。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程為 y=0.002 1x+0.176，R2=0.999 6。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果為平行試驗的平均值表示。采用Origin 8.6軟件處理數(shù)據(jù)、作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種乳酸菌生長曲線的繪制

4種乳酸菌經(jīng)過3代活化的生長曲線見圖1。

圖1 不同乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of different lactic acid bacterial strains

由圖1可知，在0～2 h，4種乳桿菌在發(fā)酵溫度為37℃的恒溫培養(yǎng)條件下，增長速度相對平緩，這是由于剛剛進入新的培養(yǎng)液，菌種需要一段適應(yīng)的過程，此段時期屬于延滯期；通過延滯期的調(diào)整，菌體適應(yīng)生長環(huán)境后，進入對數(shù)生長期，此階段菌體數(shù)目呈幾何增長，不同乳桿菌處于對數(shù)生長期時間長短不同，副干酪乳桿菌與植物乳桿菌在2 h～12 h處于對數(shù)生長期，干酪乳桿菌在2 h～10 h處于對數(shù)生長期，鼠李糖乳桿菌在2 h～16 h處于對數(shù)生長期；隨著時間的延長，不同乳桿菌分別進入穩(wěn)定期。因此，在后續(xù)的試驗中，對于副干酪乳桿菌與植物乳桿菌選定培養(yǎng)12 h作為接入發(fā)酵液的時間，干酪乳桿菌選定培養(yǎng)時間為10 h，鼠李糖乳桿菌選定為16 h。

2.2 發(fā)酵過程中微生物的生長變化

在發(fā)酵過程中，微生物的生長可以為發(fā)酵的特性提供重要的信息。以發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)，活菌數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制微生物總數(shù)的變化曲線，如圖2所示。

圖2 不同乳酸菌發(fā)酵過程中菌落總數(shù)的變化Fig.2 Changes of total bacterial count during fermentation by different lactic acid bacterial strains

由圖2可知，4種乳酸菌在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中經(jīng)過活化培養(yǎng)后按1×108cfu/mL接種量接種到發(fā)酵液中，第1天測定4種乳酸菌數(shù)量明顯降低，這是由于將乳酸菌接種到新的壞境中需要一個適應(yīng)過程，從第2天開始，不同乳酸菌數(shù)量迅速增加，干酪乳桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌在第4天達到最大值，其后略有下降，在5d～13d達到穩(wěn)定。副干酪乳桿菌在第5天達到最大值，其后略有下降，在6d～13d達到穩(wěn)定。在13d后4種乳酸菌數(shù)量都降低，可能是由于發(fā)酵過程中pH值的變化，pH值不斷降低，在一定程度上能夠抑制微生物的生長[19]。

2.3 發(fā)酵過程中pH值和總酸的變化

在乳酸菌發(fā)酵過程中，pH值和總酸可間接反映乳酸菌在發(fā)酵液中的生長狀況以及乳酸菌作為飲料發(fā)酵菌種的潛質(zhì)[20]。因此pH值和總酸是乳酸菌發(fā)酵特性的重要指標(biāo)。不同乳酸菌發(fā)酵對pH值和總酸變化的影響見圖3。

圖3 不同乳酸菌發(fā)酵過程中pH值和總酸的變化Fig.3 Changes in pH and total acid during fermentation by different lactic acid bacterial strains

由圖3（a）可知，發(fā)酵液最初pH值約為4.10。在15 d內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，4種乳酸菌在發(fā)酵過程中pH值變化規(guī)律一致，均呈下降趨勢；其中，在發(fā)酵第15天時干酪乳桿菌、植物乳桿菌發(fā)酵液的pH值最低，分別為3.01和3.04。由圖3（b）可知，初始總酸含量約為2.50 g/L，在15 d的發(fā)酵時間內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，4種乳酸菌在發(fā)酵過程中總酸含量變化趨勢一致，均呈增加趨勢，在0～7 d這種增加趨勢尤為明顯，7 d～15 d，總酸含量較為穩(wěn)定。不同菌種的產(chǎn)酸能力不同，這4種乳酸菌在葡萄發(fā)酵液中的產(chǎn)酸能力大小依次為干酪乳桿菌﹥植物乳桿菌﹥副干酪乳桿菌﹥鼠李糖乳桿菌，這與圖3不同乳酸菌pH值的變化相符合，干酪乳桿菌發(fā)酵15 d時總酸含量最大，達到8.40 g/L。陳曉維等[21]用不同乳酸菌發(fā)酵冬瓜汁也得到相似結(jié)果。pH值和總酸含量的變化可能是由于乳酸菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機酸濃度增加，尤其是乳酸的產(chǎn)生。

2.4 發(fā)酵過程中總酚含量的變化

不同乳酸菌發(fā)酵對總酚含量變化的影響見圖4。

圖4 不同乳酸菌發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.4 Changes in total phenol content during fermentation by different lactic acid bacterial strains

由圖4可知，總酚含量在發(fā)酵前約為2.63 mg/mL。在15 d的發(fā)酵時間內(nèi)，隨著發(fā)酵時間的延長，不同乳酸菌在發(fā)酵過程中總酚含量變化趨勢一致，均呈先增加后減少的趨勢，干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在發(fā)酵第7天總酚含量達到最大，分別為3.53、3.49 mg/mL和3.59 mg/mL，植物乳桿菌在發(fā)酵第9天達到最大，為3.62 mg/mL。有研究表明，微生物的轉(zhuǎn)化以及一些化合物解聚作用能夠解釋在發(fā)酵過程中總酚含量的增加[22]，另外，在發(fā)酵過程中，一定濃度的酚類物質(zhì)又可以起到抑菌作用，而乳酸菌為了保持生長會降解酚類，這一活動可能會導(dǎo)致總酚含量的降低[23]。

2.5 發(fā)酵過程中SOD酶活力的變化

SOD是最重要的抗氧化酶之一，一些乳酸菌能在發(fā)酵過程中產(chǎn)生SOD，提高系統(tǒng)的抗氧化活性。不同乳酸菌發(fā)酵對SOD酶活力變化的影響見圖5。

圖5 不同乳酸菌發(fā)酵過程中SOD酶活力的變化Fig.5 Changes in SOD activity during fermentation by different lactic acid bacterial strains

由圖5可知，在發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，不同乳酸菌在發(fā)酵過程中SOD酶活力變化趨勢一致，均呈先增加后減少的趨勢，干酪乳桿菌在發(fā)酵第6天SOD酶活力達到最大，為284.57 U/mL，副干酪乳桿菌在發(fā)酵第7天達到最大，為274.26 U/mL，植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在發(fā)酵第9天達到最大，分別為262.22 U/mL和272.33 U/mL。有研究表明，發(fā)酵期超氧化物歧化酶（SOD）活性的增加可能與菌株的生長有關(guān)，SOD是一種胞內(nèi)酶，可通過微生物的細胞裂解而釋放[24]。SOD活性的降低可能是在發(fā)酵溫度條件下SOD本身的不穩(wěn)定性引起的，也有可能是由于乳酸菌的生長受環(huán)境（例如pH值、壓力）變化的影響，進而影響SOD 酶活力[25]。

2.6 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率變化

DPPH自由基是較穩(wěn)定的自由基，與其他測定抗氧化能力的方法相比，DPPH自由基清除法可以短時間內(nèi)評價抗氧化活性。不同乳酸菌在發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率的變化見圖6。

圖6 不同乳酸菌發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力變化Fig.6 Changes in DPPH radical scavenging activity during fermentation by different lactic acid bacterial strains

由圖6可知，在發(fā)酵期內(nèi)，不同乳酸菌在發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。副干酪乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在發(fā)酵第7天達到最大，分別為158.34、162.98 μmol Trolox/L和164.09 μmol Trolox/L。植物乳桿菌在發(fā)酵第9天達到最大，為164.08 μmol Trolox/L。結(jié)合圖4中總酚含量的變化曲線圖，有研究認(rèn)為酚類物質(zhì)可以提供出一個氫離子，并通過共振雜化而穩(wěn)定，影響自由基清除率[26]。

2.7 發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除能力的變化

ABTS+自由基清除能力是評價體外抗氧化能力應(yīng)用較為廣泛，也是較為簡單的方法。不同乳酸菌在發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除能力的變化見圖7。

圖7 不同乳酸菌發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除能力的變化Fig.7 Changes in ABTS+radical scavenging activity during fermentation by different lactic acid bacterial strains

由圖7可知，在發(fā)酵期內(nèi)，不同乳酸菌在發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除能力變化曲線與DPPH自由基清除率的變化曲線相似，均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。副干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌在發(fā)酵第7天達到最大，分別為 334.35、338.53 μmol Trolox/L。干酪乳桿菌與植物乳桿菌在發(fā)酵第9天達到最大，分別為41.44、346.97 μmol Trolox/L。

2.8 發(fā)酵過程中鐵離子還原能力（FRAP）的變化

抗氧化物質(zhì)可以通過自身的還原作用破壞自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，并給出電子清除自由基，還原力是物質(zhì)提供電子的能力，物質(zhì)的還原能力與多種抗氧化機制有關(guān)。不同乳酸菌在發(fā)酵過程中還原力的變化見圖8。

圖8 不同乳酸菌發(fā)酵過程中還原力的變化Fig.8 Changes in reducing power during fermentation by different lactic acid bacterial strains

由圖8可知，在發(fā)酵期內(nèi)，不同乳酸菌在發(fā)酵過程中鐵還原能力變化均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。干酪乳桿菌在發(fā)酵第6天達到最大，為220.19μmolTrolox/L、副干酪乳桿菌在發(fā)酵第7天達到最大，為219.87μmolTrolox/L。鼠李糖乳桿菌與植物乳桿菌在發(fā)酵第9天達到最大，分別為224.636μmolTrolox/L和222.41μmolTrolox/L。這4種不同乳酸菌發(fā)酵葡萄酵素抗氧化能力測定指標(biāo)DPPH自由基、ABTS+自由基和FRAP變化趨勢大致相同，在6 d～9 d達到最大值，這與Yang等[13]對乳酸菌發(fā)酵蔬菜水果混合飲料抗氧化性能分析相一致。

3 結(jié)論

本試驗以巨峰葡萄為原料，通過比較4種不同乳酸菌發(fā)酵葡萄酵素過程中pH值、總酸、菌落總數(shù)、總酚、SOD酶活力以及抗氧化活性的動態(tài)變化，得出結(jié)論：本試驗選擇的4種乳酸菌均能在發(fā)酵過程中較好的生長且均能產(chǎn)酸，總酸含量變化趨勢一致，均呈增加趨勢，不同菌種的產(chǎn)酸能力不同，這4種乳酸菌在葡萄發(fā)酵液中的產(chǎn)酸能力大小依次為干酪乳桿菌﹥植物乳桿菌﹥副干酪乳桿菌﹥鼠李糖乳桿菌。不同乳酸菌在發(fā)酵過程中總酚含量、SOD酶活力變化均呈先增加后減少的趨勢，抗氧化性測定指標(biāo)DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和FRAP變化趨勢與總酚變化趨勢大致相同，表明抗氧化活性的大小與總酚含量具有一定的相關(guān)性，這4種乳酸菌均能用于葡萄酵素的發(fā)酵。