Skp2/p27軸在結直腸癌發生發展中的作用機制研究

王海娟 鄭雅賓 張靜

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見腫瘤，死亡率位居各種腫瘤中第5位，5年生存率僅為50%，嚴重威脅人們的生命健康[1]。腫瘤的發生與癌基因的突變和抑癌基因的失活密切相關，上調p21、p27、p57基因表達，可增強結腸癌細胞凋亡并抑制細胞生長[2]。S期激酶相關蛋白2(S-phase kinase-associated protein 2，Skp2)在多種人類癌癥中過表達[3]，例如CRC組織[4]。Skp2過表達和p27的低表達與乳腺癌、黑色素瘤、鼻咽癌、前列腺癌和CRC的不良預后密切相關[5]。在CRC中，Skp2過表達可負向影響p27，p27在多種細胞中具有強大的生長抑制作用[6]。細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶調節亞基1(cyclin-dependentprotein kinase regulatory subunit 1，CKS1)基因的表達惡性腫瘤密切相關[7]。本研究通過干擾Skp2，觀察其對CRC細胞LS513生長及遷移侵襲能力的影響。

對象與方法

一、對象

2020年9月～10月我院普外科切除的16例CRC組織及距離其邊緣5 cm的癌旁組織，其中男9例，女7例，年齡40～62歲。術前均無腫瘤病史、放化療及免疫治療史。所有組織于離體5分鐘內置于液氮罐中保存。人正常結腸上皮細胞CCD841CoN(ATCC CRL-1790TM)購自美國模式培養物集存庫；人CRC細胞系LS513(目錄號：TcHu237)購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；人CRC細胞系SW480、HT29和SW620均由上海消化外科研究所贈與。本研究經醫學倫理委員會批準和病人知情同意。

二、方法

1.主要試劑及儀器：BALB/c雌性裸鼠(4-6周齡，許可證號：SCXK(京)2016-0009)購于北京維通利華實驗動物技術有限公司。含10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的DMEM/F12培養基購自美國Giboc公司；CCK-8試劑盒購自MCE公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自美國Genecopoeia公司；pSUPER-siRNA NC(RNA干擾空載體)、pSUPER-siRNA Skp2(RNA干擾Skp2載體)均由上海生工生物有限公司構建；Skp2、p27和GAPDH引物均由上海生工生物工程有限公司合成；Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；Matrigel基質膠、PVDF膜、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)和GAPDH鼠抗均購自美國Sigma公司；ECL顯色試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒均購自北京中山金橋生物科技有限公司；Skp2、p27、p21、p57、CKS1鼠抗和辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG二抗均購自美國Abcam公司；酶標儀Fax-20100購自美國INStat公司；尼康SMZ745光學顯微鏡購自于上海普赫生物科技有限公司；TL988 qRT-PCR儀購自西安天隆科技有限公司；全能型凝膠成像分析系統ChemiDoc-MP購自山東三瑞科技有限公司；轉膜儀和電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。

2.細胞培養：分別將各個細胞株接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，放于37 ℃,5% CO2培養箱中培養，當細胞培養至密度達80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶消化細胞進行傳代培養。

3.qRT-PCR檢測Skp2和p27在CRC組織、癌旁組織及不同細胞系中的表達：使用RNA提取試劑盒分別提取CRC組織、癌旁組織以及不同細胞的總RNA，逆轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA，以cDNA為模板，按照qRT-PCR試劑盒說明書配置PCR反應體系：2×SYBR mix 10 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl。反應條件設定為：95 ℃預變性5分鐘、95 ℃變性15 s、60 ℃退火50 s、40個循環、72 ℃延伸10分鐘。分別以GAPDH為內參，根據2-ΔΔCt算法，計算Skp2和p27 mRNA表達水平。Skp2、p27及GAPDH引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

4.細胞轉染及分組：取生長密度達50%～60%的LS513細胞，使用Lipofectamine 2000轉染試劑盒轉染pSUPER-siRNA NC(siRNA NC組)、pSUPER-siRNA Skp2(siRNA Skp2組)，另取未轉染LS513細胞(LS513組)作為對照，各組細胞轉染或培養24小時后，檢測各項指標。

5.CCK-8法檢測各組細胞增殖活性：收集轉染或培養24小時后的各組細胞，每孔100 μl接種至96孔板中，加入濃度為10%的CCK-8溶液，繼續培養2小時后，于酶標儀上檢測各孔在450 nm波長下的OD值，OD值越大表明細胞增殖活性越高。

6.Transwell小室法檢測各組細胞遷移侵襲能力：取各組細胞，用不含FBS的DMEM/F12培養基，制成濃度為1×108個/ml的細胞懸液，取100 μl細胞懸液接種到Transwell小室上室，取600 μl含20% FBS的DMEM/F12培養基至Transwell小室下室，37 ℃培養24小時后，下室用4%多聚甲醛室溫固定20分鐘，PBS洗滌3次，甲醇固定15分鐘，0.1%結晶紫室溫染色40分鐘。沖洗多余染液、晾干后，光學顯微鏡下觀察并計數穿過微孔膜的細胞。檢測侵襲能力時，需在Transwell小室上室鋪50 μl普通Matrigel膠工作液(Matrigel膠∶培養基=1∶8)，并置于37 ℃恒溫培養箱過夜，待Matrigel膠凝固后，其余步驟與細胞遷移能力檢測實驗相同。穿膜細胞數越多表明細胞遷移或侵襲能力越強。實驗重復6次。

7.裸鼠成瘤實驗檢測各組細胞在動物體內成瘤能力：參考唐丹等[8]所用方法收集培養24小時后的各組細胞，使用PBS重懸細胞，調整細胞濃度為2×106個/ml，取100 μl分別皮下接種于裸鼠右前肢腋下，觀察腫瘤形成情況并于第20天時使裸鼠吸入過量乙醚后實施安樂死，仔細分離瘤體并稱重。瘤體越重表明細胞成瘤能力越強。實驗重復6次。

8.Western Blot法檢測細胞中Skp2、p27、p21、p57、CKS1蛋白表達水平：收集置于液氮中的不同組織及培養24小時后的各組細胞，采用蛋白抽提試劑盒提取不同組織和細胞總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，依次進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉PVDF膜、抗體封閉、1∶1 000濃度稀釋后的p27、p21、p57、CKS1鼠抗4 ℃過夜孵育、TBST緩沖液洗膜，然后置于含辣根過氧化物酶綴合的二抗(1∶2 000)中室溫孵育2小時、洗膜，用ECL試劑盒顯色，全能型凝膠成像分析系統拍照，以GAPDH為內參，分析各組蛋白表達水平。

三、統計學分析

結果

1.Skp2和p27在CRC組織、癌旁組織和細胞系中的表達：與癌旁組織相比，CRC組織中Skp2 mRNA和蛋白表達水平顯著升高，p27 mRNA和蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1和表2。與人正常結腸上皮細胞CCD841CoN相比，LS513、SW480、HT29和SW620癌細胞中Skp2 mRNA和蛋白表達水平顯著升高，p27 mRNA和蛋白表達水平顯著降低差異有統計學意義(P<0.05)。見表3和圖1。其中，LS513癌細胞中Skp2表達水平最高，所以后續將選擇LS513細胞進行RNA干擾載體轉染實驗。

注：A 癌旁組織；B CRC組織；C CCD841CoN正常結腸上皮細胞；D SW480癌細胞；E HT29癌細胞；F SW620癌細胞；G LS513癌細胞

表2 CRC組織和癌旁組織中Skp2和p27 mRNA和蛋白表達水平比較

表3 正常結腸上皮細胞細胞和癌細胞中Skp2和p27 mRNA和蛋白表達水平比較

2.干擾Skp2對LS513癌細胞增殖活性的影響：與LS513組比較，siRNA NC組細胞Skp2蛋白表達水平、細胞增殖活性比較差異無統計學意義(P>0.05)；與LS513組和siRNA NC組比較，siRNA Skp2組細胞Skp2蛋白表達水平和細胞增殖活性顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 干擾Skp2對LS513癌細胞增殖活性的影響

3.干擾Skp2對LS513癌細胞遷移侵襲能力的影響：與LS513組相比，siRNA NC組細胞遷移和侵襲能力差異無統計學意義(P>0.05)；與LS513組和siRNA NC組相比，siRNA Skp2組細胞遷移和侵襲能力顯著降低(P<0.05)。見圖2和表5。

圖2 Transwell檢測LS513癌細胞遷移侵襲圖(結晶紫染色×200)

表5 干擾Skp2對LS513癌細胞遷移侵襲能力的影響

4.干擾Skp2對LS513癌細胞成瘤能力的影響：與LS513組比較，siRNA NC組細胞動物體內成瘤能力比較差異無統計學意義(P>0.05)；與LS513組和siRNA NC組比較，siRNA Skp2組細胞動物體內成瘤能力顯著降低(P<0.05)。見表6。

表6 干擾Skp2對LS513癌細胞成瘤能力的影響

5.干擾Skp2對LS513癌細胞p27、p21、p57和CKS1蛋白表達水平的影響：與LS513組比較，siRNA NC組細胞p27、p21、p57和CKS1蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與LS513組和siRNA NC組相比，siRNA Skp2組細胞p27、p21、p57蛋白表達水平顯著升高，CKS1蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3和表7。

圖3 各組細胞中p27、p21、p57和CKS1蛋白Western Blot圖

表7 干擾Skp2對p27、p21、p57和CKS1蛋白表達水平的影響

討論

CRC是消化系統最常見的惡性腫瘤之一，發病率呈上升趨勢，目前世界范圍內發病率排名第3[9]。癌癥的發生主要是由于癌基因和抑癌基因相互作用導致細胞周期調控失調所引起[10]。其中，Skp2基因是與細胞周期調控密切相關的基因，編碼的蛋白質由436個氨基酸組成，分子量約47 kDa，Skp2通過對多種靶蛋白的泛素化降解而與細胞周期調控及腫瘤的發生、發展和預后密切相關[11]。Zhou等[12]研究發現，Skp2在CRC組織和細胞系中高表達，敲除Skp2在體外和體內均可降低CRC細胞的生長，且Skp2高表達與CRC預后差相關聯。本研究發現，與癌旁組織和人正常結腸上皮細胞相比，CRC組織及LS513、SW480、HT29和SW620癌細胞中Skp2 mRNA和蛋白表達水平顯著升高，p27 mRNA和蛋白表達水平顯著降低，其中LS513癌細胞中Skp2表達水平最高，所以后續將選擇LS513細胞進行RNA干擾。

Skp2在多種人類腫瘤中均過表達，具有潛在的致癌效應，調控多種細胞生物進程，包括細胞周期、生長、分化、增殖、轉移和凋亡[13]。其中，Skp2的過表達可促進肝癌細胞HepG2的增殖，凋亡和侵襲，而siRNA Skp2可以降低HepG2細胞的增殖和侵襲，誘導細胞凋亡[14]，另外，Skp2抑制劑也可降低多發性骨髓瘤細胞的生存和增殖能力，誘導細胞凋亡[15]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)能高效特異干涉目標靶基因的表達，產生類似基因敲除的效應。本研究采用siRNA Skp2處理后發現，與siRNA NC組相比，siRNA Skp2組細胞Skp2蛋白表達水平、細胞增殖活性、遷移侵襲能力及動物體內成瘤能力顯著降低。Skp2在骨肉瘤細胞中主要發揮癌基因的作用，通過調控其信號通路中p21和p27的表達影響細胞生長、侵襲和遷移等惡性生物學行為[16]。提示Skp2在CRC細胞中也發揮癌基因作用，干擾Skp2可抑制CRC癌細胞的生長和遷移侵襲，但其中的機制尚需進一步研究。

Skp2參與p27、p21、p57等抑癌蛋白的降解，在細胞周期調控、細胞生長、分化、增殖、轉移和凋亡等方面發揮重要作用[17]。精確地細胞周期調節是防止異常細胞增殖和癌癥進展的關鍵，p21、p27和p57均為典型的細胞周期抑制蛋白，其過度降解可能導致癌細胞不受控制的增殖[18]，而CKS1基因控制細胞周期蛋白的豐度[19]，在肝癌組織中CKS1表達水平顯著高于正常肝組織[20]。本研究發現，與siRNA NC組相比，siRNA Skp2組細胞p27、p21、p57蛋白表達水平顯著升高，CKS1蛋白表達水平顯著降低。Vasile等[21]研究發現，Skp2過表達可誘導p27蛋白連續降解，而蛋白水解和降解需要依賴CKS1為輔助因子[22]。提示干擾Skp2可能通過提高p27等抑癌蛋白表達水平，降低CKS1蛋白表達水平，抑制CRC癌細胞的生長和遷移侵襲，進而影響CRC發生和發展。

綜上所述，Skp2/p27軸參與CRC發生發展，干擾Skp2可增高p27等抑癌蛋白表達，降低CKS1癌蛋白表達，抑制CRC細胞生長及遷移侵襲。推測靶向Skp2可能是一種潛在的CRC治療策略。