細胞分裂周期蛋白20、微小RNA-34a-5p在膀胱尿路上皮癌組織中的表達及與臨床病理的相關性

葛新國 原小斌

膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial cancer，BUC)是膀胱癌常見形式[1],預后很差。細胞分裂周期蛋白20(cell division cycle protein 20，CDC20)可激活促進復合物(anaphase-promoting complex，APC/C)啟動細胞分裂G2/M期。有證據表明，CDC20可能成為一個很有前途的腫瘤治療靶點[2]。CDC20的異常表達可能會擾亂APC/C的激活。有研究報道了其在前列腺癌、肝細胞癌中過度表達[3]。miR-34a-5p上調表達后，可有效抑制人肺癌H460細胞的增殖，并促進其凋亡[4]。經miRTarBase網站預測發現,miR-34a-5p與CDC20存在結合位點。本研究檢測BUC病人組織中CDC20、miR-34a-5p的表達，并分析二者與臨床病理的相關性。

對象與方法

一、對象

2015年2月～2017年2月本院腫瘤科收治的BUC病人80例，均接受手術治療，術中留取癌組織(BUC組)及相對應的癌旁組織(對照組，距離癌緣2.5 cm)。其中男56例，女24例，年齡43～79歲；組織學分級：高級別53例，低級別27例；發生在膀胱39例、腎盂27例、輸尿管14例。納入標準：(1)術后經病理切片證實為BUC；(2)術前未在本院或其他醫院接受放療、化療或分子靶向治療；(3)病歷資料完整，有完整隨訪記錄。排除標準：合并前列腺癌、腎細胞癌等其他癌癥；有嚴重的心腦血管疾病、肝腎疾病；合并自身免疫性疾病。病人及家屬知情并同意簽字，本研究經本院道德倫理委員會批準通過。

二、方法

1.主要試劑與儀器：Trizol試劑(美國Invirotrogen公司)；反轉錄試劑盒(上海吉至生化科技有限公司)；SYBR Premix Ex Taq TM real-time PCR試劑盒(大連TaKaRa公司)；CDC20兔抗人一抗、羊抗兔IgG二抗(英國Abcam公司)；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(Streptavidin-peroxidase linkage method，SP)試劑盒(福建邁新生物技術開發有限公司)；二氨基聯苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色試劑盒(貨號DAB002，合肥康源生物科技研究所)；實時熒光定量PCR儀(型號7300型，美國Applied biosygtems公司)；奧林巴斯顯微鏡(型號BX51、TSX40086V，日本奧林巴斯株式會社)；引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成。

2.樣品采集及保存：所有樣本均為手術中切除新鮮組織樣本，經10%甲醛固定4～6小時，梯度脫水，組織浸蠟，石蠟包埋，剩余組織保存于-80 ℃冰箱備用。

3.實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測BUC組織中CDC20 mRNA、miR-34a-5p表達水平。參照SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒說明書進行qRT-PCR反應，內參分別選用GAPDH、U6基因，CDC20 mRNA、miR-34a-5p、GAPDH、U6引物序列見表1。采用2-ΔΔCt方法計算BUC組織中CDC20 mRNA、miR-34a-5p相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

4.免疫組化法(S-P法)檢測BUC病人組織中CDC20的表達：以出現黃色或棕黃色顆粒為陽性表達。染色指數(staining index，SI)為陽性細胞表達百分比評分與著色強度評分乘積。

5.隨訪：通過門診復查的方式進行隨訪，開始于2015年2月，每2～3個月隨訪1次，截至2020年2月。隨訪期間，有淋巴結轉移16例；31例病人死亡(21例死于BUC，10例死于心血管疾病或意外等其他原因)；無失訪。

三、統計學分析

結果

1.CDC20和miR-34a-5p水平：BUC組組織中CDC20 mRNA為(2.68±0.35)，對照組為(1.05±0.19)，miR-34a-5p分別為(0.42±0.08)和(1.08±0.11)，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.CDC20 mRNA和miR-34a-5p水平相關性：Pearson法分析顯示，miR-34a-5p、CDC20 mRNA表達水平呈負相關(r=-0.696，P<0.05)。

3.CDC20在癌旁正常組織及BUC組織中的表達：免疫組化結果顯示，BUC組織中CDC20陽性率高于癌旁正常組織(76.25% vs 18.75%，χ2=53.033，P<0.05)。見圖1。

圖1 CDC20在癌旁正常組織及BUC組織中的表達(S-P法×200)

4.BUC組織中CDC20、miR-34a-5p表達與臨床病理特征的關系：以SI<2為陰性表達，SI≥2為陽性表達，分為CDC20陰性組(19例)和陽性組(61例)；以BUC組miR-34a-5p表達平均值為界值，分為miR-34a-5p低表達組(41例)與高表達組(39例)。BUC病人中CDC20、miR-34a-5p表達與組織學分級、組織浸潤、復發密切相關(P<0.05)，而與年齡、病變部位、淋巴結轉移無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 BUC組織中CDC20、miR-34a-5p表達與臨床病理特征的關系(例)

5.BUC組織中CDC20、miR-34a-5p表達水平與預后的關系：K-M法分析顯示，BUC病人3年累積生存率為61.25%(49/80)，CDC20陽性表達病人3年累積生存率低于CDC20陰性表達病人(52.46% vs 94.74%，Log-rank χ2=9.318，P<0.05)；miR-34a-5p高表達病人3年累積生存率高于miR-34a-5p低表達病人(87.18% vs 48.78%，Log-rank χ2=13.434，P<0.05)。見圖2。

圖2 BUC組織中CDC20、miR-34a-5p表達水平與預后的關系

6.Cox回歸分析BUC病人預后的影響因素：單因素Cox分析顯示，病變部位、淋巴結轉移、組織浸潤、復發、CDC20、miR-34a-5p均是影響BUC不良預后的危險因素；多因素Cox分析顯示，CDC20水平偏高、miR-34a-5p水平偏低是BUC不良預后的危險因素(HR=2.635、3.426，P<0.05)。見表3。

表3 Cox回歸分析BUC病人預后的影響因素

討論

BUC是膀胱癌的主要類型，為泌尿系統常見的惡性腫瘤[5]。BUC病人通常表現為無痛性血尿，診斷常被延誤。目前，膀胱癌的疾病管理主要依賴于積極的治療，以及根據疾病的分期和等級進行手術[6]。

有研究發現，CDC20在宮頸高級鱗狀上皮內病變和鱗狀細胞癌中上調[7]。CDC20的高表達與前列腺癌、口腔鱗狀細胞癌、胃癌、結直腸癌和非小細胞肺癌的預后不良相關[2,8-10]。miRNA通過引起靶mRNA的降解或通過其特異性結合來抑制其翻譯而充當基因表達的轉錄后調節子[11]。miR-34a包含miR-34a-3p和miR-34a-5p兩種形式，其強表達可誘導細胞周期阻滯、凋亡、衰老，抑制上皮間質轉化和腫瘤干細胞增殖[12]。miR-34a-5p來源于miR-34a，可以阻止腫瘤細胞的遷徙和侵襲[13]。本研究結果提示，CDC20、miR-34a-5p可能與BUC的發生有關。免疫組化結果表明，CDC20可能參與BUC的發病過程。BUC病人CDC20、miR-34a-5p表達與組織學分級、組織浸潤、復發密切相關。提示二者可能參與了BUC的發生、發展過程，可能與CDC20高表達、miR-34a-5p低表達促進腫瘤生長有關。

Lee等[14]研究了上尿路上皮癌(upper tract urothelial carcinoma ，UTUC)，發現病人組織中317個差異表達的基因，神經軸突導向分子SLIT3的低表達是BUC病人生存率差異的預測因子，而miR-34a-5p是其潛在的調節因子，推斷miR-34a-5p在UTUC中具有潛在的預后診斷價值。本研究經K-M法分析顯示,CDC20、miR-34a-5p的異常表達與BUC病人生存率有關。Cox分析提示,CDC20、miR-34a-5p水平異常可能與BUC不良預后有關，具有潛在的診斷價值。

綜上所述，BUC病人癌組織較正常組織中CDC20 mRNA和蛋白水平升高、miR-34a-5p水平降低。CDC20、miR-34a-5p與BUC組織學分級、淋巴結轉移、組織浸潤、復發及不良預后密切相關，具有潛在的診斷價值。本研究也存在未檢測血清中CDC20、miR-34a-5p的水平的不足，所以對發生BUC的預測價值不足。