淫羊藿苷對去勢自發性高血壓大鼠平均動脈壓、心率、血清NO及ET-1的影響

于 淼，郭蓉娟，劉 欣，李秀珍，趙超群，李青穆，陳 夢，孟 園，袁 晶，李賽賽

高血壓是心腦血管病的獨立危險因素，且持續性的高血壓能夠引發心、腦、腎等靶器官的損傷甚至衰竭。因此，高血壓的產生機制及其防治一直是心血管領域研究的重點與熱點。高血壓的發病機制主要有：遺傳、交感神經系統[如腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)]激活、內皮功能紊亂、毛細血管血流受損及炎癥介質介導等學說[1-2]。其中內皮功能紊亂較復雜，主要由于內皮源性舒張因子(EDRFs)與內皮源性收縮因子(EDCFs)二者平衡失調所致[3]。其中，舒張因子一氧化氮(NO)與收縮因子內皮素-1(ET-1)常作為內皮功能的檢測指標。

雌激素能夠降低血壓，且對內皮功能有保護作用[4-8]。雌激素替代療法中，雌激素被用作女性圍絕經期及絕經后高血壓的臨床治療藥物，但尚存在一定爭議。中醫對于衰老性疾病的治療有其優勢，二仙湯(主要組分為仙茅、仙靈脾，又稱淫羊藿)治療女性圍絕經期及絕經后高血壓臨床療效明顯。淫羊藿苷作為淫羊藿的有效成分，屬于異戊烯類黃酮類化合物，結構與雌激素類似，屬于植物類雌激素，通過抑制心室重構、減少心肌肥厚等機制產生降壓作用[9-10]。本研究觀察淫羊藿苷對去勢雌性大鼠血壓、心率及血清NO、ET-1水平的影響，探討淫羊藿苷的降壓機制及其類雌激素作用，為植物類雌激素及中醫補腎法治療臨床心血管疾病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 9周齡清潔級雌性自發性高血壓大鼠(SHR)36只，體質量(150±10)g。9周齡清潔級具有相同遺傳背景的正常血壓雌性京都Wistar大鼠(空白組)6只，體質量(150±10)g，以上動物均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證編號：SCXK(京)2016-0006]。普通飼料喂養，室溫(22±2)℃，相對濕度(55±5)%，光照時間07：00～19：00。

1.2 實驗藥物 戊酸雌二醇片(補佳樂)，德國拜耳醫藥保健有限公司生產，批號：200A5；雌激素受體拮抗劑，氟維司群注射液(芙仕得)，國藥集團醫藥控股北京華鴻有限公司生產，批號：LK774；淫羊藿苷，98%純度標準品，南京廣潤生物制品有限公司生產，批號：GR-133-150509。

1.3 實驗儀器 大鼠尾套管法無創血壓計(日本Softron公司生產，型號：BP-2006A)，酶標儀(美國Thermo公司生產，型號：B004)。

1.4 實驗試劑 一氧化氮酶法(比色法)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號：A012-1-2)，ET-1酶聯免疫吸附測定(ELISA)測試盒(南京建成生物工程研究所，貨號：H093)，磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)兔來源單克隆抗體(美國CST公司，貨號：4060S)，蛋白激酶B(Akt)兔來源單克隆抗體(美國CST公司，貨號：4685S)。

1.5 實驗造模 6只京都Wistar雌性大鼠、36只雌性SHR給予普通飼料適應性喂養1周，繼而行無菌卵巢切除術。1 mL/100 g 4%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹位固定，于軀干下1/3、脊柱兩側各1 cm處沿脊柱方向作縱形切口，長約1 cm，逐層分離，深入體腔，可見肉色卵巢團塊，用眼科鑷輕輕將其拉出，下方連接直徑約0.1 cm的肉色輸卵管，在輸卵管近卵巢端穿一絲線，結扎，剪去卵巢及余線，將組織回納入腹腔，縫合切口，給予切口青鏈霉素預防感染。

1.6 實驗分組 術后14 d，6只京都Wistar去勢雌性大鼠作為空白組，36只去勢雌性SHR大鼠隨機分為模型組、雌激素組、淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組、淫羊藿苷高劑量組及淫羊藿苷中劑量+氟維司群組，每組6只。預實驗表明淫羊藿苷中劑量組每天20 mg/kg保護效應最明顯，因此，設置淫羊藿苷中劑量組+雌激素受體拮抗劑?？瞻捉M、模型組給予溶劑純水灌胃，雌激素組開始給予戊酸雌二醇(每天0.1 mg/kg)灌胃，淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組、淫羊藿苷高劑量組分別給予每天10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg的淫羊藿苷灌胃，淫羊藿苷中劑量+氟維司群組除給予淫羊藿苷每天20 mg/kg，皮下注射氟維司群注射液，每月52 mg/kg。

1.7 標本采集 ①血樣標本采集：于給藥8周后，用7%水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠腹主動脈取血，放入紅色促凝采血管，3 000 r/min離心15 min分離血清，檢測血清NO及ET-1水平。②蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測標本，剝離整根主動脈放入液氮中，后轉移至-80 ℃冰箱保存，檢測p-Akt蛋白及Akt總蛋白表達。

1.8 檢測指標

1.8.1 血壓及心率 藥物干預8周后測量各組大鼠平均動脈壓(MAP)及心率。測量方法：用動物無創血壓計BP-2006A，將套管套在大鼠尾部，加熱鼠籠，使大鼠在溫暖的環境中逐漸平靜，待情緒穩定后測量大鼠靜息狀態下的血壓及心率。

1.8.2 血清NO及ET-1水平檢測 硝酸還原酶法檢測各組大鼠血清NO水平，ELISA法檢測各組大鼠血清ET-1水平，操作按試劑盒說明書步驟進行。

1.8.3 主動脈Akt通路相關蛋白含量檢測 截取主動脈，用于主動脈p-Akt蛋白及Akt總蛋白表達的Western Blot檢測。

2 結 果

2.1 各組MAP、心率比較 與空白組比較，模型組MAP明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，雌激素組、淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組及淫羊藿苷高劑量組MAP明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與淫羊藿苷中劑量組比較，淫羊藿苷中劑量+氟維司群組MAP明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。模型組心率與空白組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組及淫羊藿苷高劑量組心率明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.01)；與淫羊藿苷中劑量組比較，淫羊藿苷中劑量+氟維司群組心率明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。詳見表1。

表1 各組MAP、心率比較 ()

2.2 各組血清NO、ET-1水平比較 與空白組比較，模型組血清NO水平明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，雌激素組、淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組及淫羊藿苷高劑量組血清NO水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與雌激素組比較，淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組NO水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.01)；與淫羊藿苷中劑量組比較，淫羊藿苷中劑量+氟維司群組NO水平明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。與空白組比較，模型組血清ET-1水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，雌激素組、淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組及淫羊藿苷高劑量組血清ET-1水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與淫羊藿苷中劑量組比較，淫羊藿苷中劑量+氟維司群組ET-1水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組血清NO、ET-1水平比較 ()

2.3 各組p-Akt/Akt相對表達量比較 與空白組比較，模型組p-Akt/Akt相對表達量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，雌激素組、淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組及淫羊藿苷高劑量組p-Akt/Akt相對表達量明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與淫羊藿苷中劑量組比較，淫羊藿苷中劑量+氟維司群組p-Akt/Akt相對表達量明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組p-Akt/Akt相對表達量比較 ()

3 討 論

本研究給予大鼠卵巢切除術，模擬圍絕經期及絕經后期低雌激素水平狀態。與具有相同遺傳背景的空白組比較，雌性SHR血壓明顯升高。既往研究證實，淫羊藿苷能通過改善腎損傷、減少心室重構及心肌細胞凋亡，從而改善高血壓靶器官損害，但尚缺乏淫羊藿苷對血壓作用的報道[9，11-12]。本研究表明，淫羊藿苷能降低去勢雌性SHR血壓，該作用與雌激素類似，且能夠被雌激素受體拮抗劑阻斷。

既往研究表明，京都Wistar雌性大鼠心率比雌性SHR快[13]。但本研究發現，去勢雌性京都Wistar大鼠與去勢雌性SHR心率無明顯差異。因此，雌激素水平的高低是否是導致這一差異的原因，尚需進一步研究。關于雌激素對SHR心率影響的國內外研究較少，本研究發現：外源性雌激素補充能降低雌性SHR的血壓，且淫羊藿苷與雌激素在對心率的影響方面相似，淫羊藿的該作用能被雌激素受體拮抗劑削弱。

NO是一種內皮源性舒張因子，具有較強的舒張血管的作用，其作用機制為NO激活可溶性鳥苷酸環化酶(sGC)，后者將三磷酸鳥苷(GTP)轉化為環磷鳥苷(cGMP)，從而激活蛋白激酶G導致細胞內鈣濃度下降；另一方面，NO 能夠激活內質網鈣三磷酸腺苷(ATP)酶，從而降低細胞內鈣濃度。此外，NO還能夠降低炎性因子及組織因子的釋放、抑制血管細胞增殖、減少血小板黏附。ET-1是迄今所知縮血管最強的物質，主要通過與血管平滑肌細胞上ET-A型受體結合，激活L-型鈣通道，使Ca2+內流，細胞內Ca2+濃度增加，與肌鈣蛋白結合引起收縮。ET-1還能影響炎癥反應、細胞生長、胚胎發育、腎功能、心血管穩態、內分泌功能、呼吸功能、生殖系統等。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是NO及ET-1共同的上游信號途徑，也是雌激素膜受體的下游信號通路[14]。既往研究表明，與京都Wistar大鼠比較，SHR血清NO水平明顯降低，而ET-1水平明顯升高；雌激素能夠通過下調PI3K/Akt通路蛋白表達，升高血清 NO，降低血清ET-1水平，起到對心血管系統的保護作用[15-19]。本研究表明，淫羊藿苷與雌激素相似，能夠升高血清NO水平而降低ET-1水平，從而調節內皮功能，該作用是通過下調Akt蛋白磷酸化表達實現的，且可被雌激素受體拮抗劑所阻斷。因此，淫羊藿苷的降血壓作用與其調節NO及ET-1的分泌量及功能有關。

綜上所述，淫羊藿苷作為植物類雌激素，能夠通過改善內皮功能而發揮降壓作用。其作用溫和，具有臨床藥用價值。本研究為二仙湯及補腎法在圍絕經期及絕經后女性高血壓的臨床治療提供了理論基礎，也為植物類雌激素在圍絕經期及絕經后女性心血管疾病的臨床預防及治療應用方面提供了理論基礎。