梓醇-川芎嗪方對阿爾茨海默病模型小鼠認知功能的影響

孟勝喜，陳慧澤，王 兵，李文濤，潘衛東，張云云

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種以β淀粉樣蛋白沉積、神經原纖維纏結和老年斑形成為主要特征的神經退行性疾病[1]。AD是迄今為止癡呆的最常見原因，占所有癡呆的80%[2]。中醫藥具有多層次、多靶點、多通路作用的特點和優勢，在防治AD方面發揮著越來越大的作用，也受到越來越多的關注[3]。中藥有效組分是指中藥復方中具有相似化學性質或化學結構的對疾病具有治療作用的一類或多類有效成分群[4]。中藥有效組分配伍，不僅避免了傳統中藥方劑成分復雜等缺點，而且還保留了傳統方劑的特點和優勢。中藥組分配伍是微觀的中藥復方，是隨著中藥現代化進程不斷發展而出現的新的研究熱點[5]。本研究探討梓醇-川芎嗪方(CL方)對APPswe/PS1dE9雙轉基因AD模型小鼠認知功能的影響，以期為AD的防治提供新的方法和思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取無特定病原體(SPF)級雄性、APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠6月齡50只，按照隨機數字表法分為模型組、梓醇組、川芎嗪組、CL方組、鹽酸多奈哌齊(安理申)組，每組10只。另選10只6月齡C57BL/6J小鼠為對照組。全部動物購自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK(京)2018-0006，所有小鼠均適應性喂養2周后分別單籠喂養，光照/黑暗交替時間12 h/12 h，溫度(22±2)℃，相對濕度(60±5)%，自由攝食及飲水。

1.2 藥物、試劑與儀器

1.2.1 試驗藥物 鹽酸多奈哌齊(Aricept)，衛材(中國)藥業有限公司生產，國藥準字H20050978；批號：170508。CL方來源：CL方來源于本課題組長期臨床經驗總結出來的恒清Ⅱ號方[6-9]。恒清Ⅱ號方的主要組成包括熟地黃15 g、川芎10 g。梓醇在熟地黃中的平均含量為0.267%，因此，15 g熟地黃中含有梓醇0.040 05 g[10]。川芎中川芎嗪含量為0.152 3%，因此10 g川芎中含川芎嗪為0.015 23 g[11]。C組成為梓醇，CAS號：2415-24-9，純度93.7%，蘇州玉森新藥開發有限公司生產，批號：080301，梓醇含量4.274 mg。L組成為川芎嗪，CAS號：1124-11-4，純度：98%，購自成都瑞芬思生物科技有限公司，批號：081102，川芎嗪含量1.554 mg。CL方為4.274 mg的梓醇+1.554 mg的川芎嗪。

1.2.2 試劑與儀器 實驗Morris水迷宮(上海吉量軟件科技有限公司生產，型號：JLBehv-MWMG-1)，小鼠自主活動儀(成都泰盟科技有限公司生產，型號：ZZ-6型)，動物社會交互行為視頻分析系統(北京天鳴宏遠科技發展有限公司生產，型號：Xeye SI V1.2)。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組、造模與給藥 梓醇組、川芎嗪組、CL方組小鼠每天給予相對應劑量的梓醇、川芎嗪及CL方 100 mg/kg灌胃；安理申組小鼠每天給予安理申5 mg/kg灌胃。對照組和模型組小鼠每天給予等體積的生理鹽水灌胃。均每天1次，連續灌胃8周。然后進行行為測試，即Morris水迷宮(morris water maze，MWM)檢測和新物體識別(new object recognition，NOR)檢測[12]。

1.3.2 行為測試 ①Morris水迷宮實驗：共6 d，前5 d(定位航行試驗)每只小鼠每天訓練3次，分別從除平臺所在象限之外的另外3個象限、頭朝向槽壁、置于水中60 s，如果60 s內找到平臺，爬上平臺并停留5～10 s，小鼠所用時間則為逃避潛伏期(escaping latency，EL)；如果60 s內仍未找到平臺，則由實驗者引導小鼠爬上平臺、停留10 s，則將其潛伏期計為60 s，連續訓練5 d，記錄訓練當天3次逃避潛伏期，取其平均值。第6天(空間探索試驗)，撤去平臺，把小鼠放入目標象限入水點，60 s內記錄小鼠整個運動軌跡、在目標象限內的游泳時間、游泳距離、首次找到平臺時間及穿越原平臺所在位置的次數，計算小鼠在目標象限游泳時間占整個游泳時間的百分比以及在目標象限游泳距離占整個游泳距離百分比等。②新物體識別測試：準備50 cm×50 cm×40 cm的實驗箱和兩個大小相近但形狀、顏色都不一樣的物體(A和B)，在前3 d(訓練期)，同一時間點把兩個相同物體(A+A或B+B)對稱放在實驗箱中心位置上，小鼠面向籠壁放入，自由探測物體20 min；第4天(測試期)，將兩個不同物體(A+B)放在上面相同位置，小鼠自由探測物體5 min，如果小鼠頭部面向物品，頭部與物品之間的距離≤2 cm時則表明小鼠正在探索物體，記錄小鼠探測新物體和舊物體的時間，以相對識別指數(discrimination index，DI)來評價其學習記憶能力，DI=(新物體時間/總時間)×100%-(舊物體時間/總時間)×100%。

2 結 果

2.1 各組小鼠不同時間的逃避潛伏期比較 第1天，各組小鼠的逃避潛伏期之間比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。第2天，與對照組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，梓醇組、川芎嗪組、CL方組及安理申組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。第3天至第5天，與對照組比較，模型組逃避潛伏期明顯延長，差異均有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，梓醇組、川芎嗪組、CL方組及安理申組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.01)；與梓醇組比較，CL方組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.01)；與川芎嗪組比較，CL方組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05)；與安理申組比較，CL方組逃避潛伏期明顯縮短，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組小鼠不同時間逃避潛伏期比較 () 單位：s

2.2 各組小鼠空間記憶能力比較 與對照組比較，模型組目標象限出現次數減少，目標象限游程縮短，目標象限游程比下降，目標象限時間減少，目標象限時間比下降，穿臺次數減少，首次穿越平臺時間延長，差異均有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，梓醇組、川芎嗪組、CL方組及安理申組目標象限出現次數增加，目標象限游程延長，目標象限游程比上升，目標象限時間增加，目標象限時間比上升，穿臺次數增加，首次穿越平臺時間縮短，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與梓醇組比較，CL方組目標象限出現次數增加，目標象限游程延長，目標象限游程比上升，目標象限時間增加，目標象限時間比上升，穿臺次數增加，首次穿越平臺時間縮短，差異均有統計學意義(P<0.01)。與川芎嗪組比較，CL方組目標象限出現次數增加，目標象限游程延長，目標象限游程比上升，目標象限時間增加，目標象限時間比上升，穿臺次數增加，首次穿越平臺時間縮短，差異均有統計學意義(P<0.05)。與安理申組比較，CL方組目標象限出現次數增加，目標象限游程延長，目標象限游程比上升，目標象限時間增加，目標象限時間比上升，穿臺次數增加，首次穿越平臺時間縮短，差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠空間記憶能力比較 ()

2.3 各組小鼠新物體識別測試中DI比較 與對照組比較，模型組DI明顯下降，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，梓醇組、川芎嗪組、CL方組及安理申組DI明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與梓醇組比較，CL方組DI明顯上升，差異有統計學意義(P<0.01)。與川芎嗪組比較，CL方組DI明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)。與安理申組比較，CL方組DI明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組小鼠新物體識別測試中DI比較 ()

3 討 論

中藥有效組分配伍不僅突破了以往主要以臨床經驗積累為中藥研制新藥的模式，也繼承和發揚了中醫藥理論創新研究的模式，這將是中醫藥實現國際化、現代化的重要方向之一[5]。恒清Ⅱ號方是本課題組長期臨床摸索、總結、反復驗證過的防治AD有明確療效的經驗方[6-9]。熟地黃和川芎是恒清Ⅱ號方的主要組成藥物。熟地黃的主要成分為梓醇，川芎的主要成分為川芎嗪。梓醇是從玄參科植物地黃新鮮或干燥塊根中提取的小分子環烯醚萜類化合物，極性結構，易溶于水，分子式C15H22O10，分子量是362.33，CAS號：2415-24-9，EINECS：219-324-0。梓醇有神經保護、抗癌、抗炎、利尿、降血糖及抗肝炎病毒等作用，尤其在防治AD方面具有較好的作用，可以改善AD大鼠大腦皮質結構異常，升高大腦皮質膽堿能毒蕈堿受體M1亞型受體表達[13-14]。在血腦屏障的體外模型中，梓醇可以對β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)誘導的血腦屏障破壞具有保護作用[15]。川芎嗪為中藥川芎的主要有效成分，CAS號：1124-11-4；分子式：C8H12N2，分子量136.194 00。川芎嗪具有抗血小板聚集、擴張小動脈、改善微循環和腦血流等作用。由于其可通過血腦屏障，在中樞神經系統和周圍神經網絡均發揮著神經保護作用[16]。川芎嗪可以通過對AD大鼠海馬神經元RAGE-ERK1/2-p38-NF-κB信號通路的下調作用，有效抑制神經元活性氧生成，降低β淀粉樣蛋白的神經毒性，改善AD大鼠腦組織炎性，進而發揮其抗AD及神經保護作用[17]。

本研究結果顯示，單用梓醇或單用川芎嗪，均可縮短APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠的逃避潛伏期、增加目標象限出現次數、延長目標象限游程、提高目標象限游程比、延長目標象限時間、提高目標象限時間比、增加穿臺次數、縮短首次穿越平臺時間、提高新物體識別測試中DI(P<0.05)，與安理申比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；梓醇與川芎嗪聯用，即組成CL方，則可以明顯縮短APPswe/PS1dE9雙轉基因小鼠的逃避潛伏期、增加目標象限出現次數、延長目標象限游程、提高目標象限游程比、延長目標象限時間、提高目標象限時間比、增加穿臺次數、縮短首次穿越平臺時間、提高新物體識別測試中DI(P<0.05)。其以上作用不僅優于梓醇、川芎嗪，而且還優于安理申。表明梓醇與川芎嗪聯用起到了顯著的增效作用，其作用機制則有待進一步深入探索和研究。

綜上所述，CL方可以有效改善AD模型小鼠的認知障礙，其效果既優于其單一成分，也優于安理申。