谷氨酸、γ-氨基丁酸在偏頭痛模型PAG和TNC中的變化

張先元 張路平 陳強 嚴(yán)民力 周會霞 曹志堅 章正祥*

偏頭痛是一種以單側(cè)搏動性疼痛為主的頭痛病，常常反復(fù)發(fā)作，嚴(yán)重影響生活。其發(fā)病機制尚不明確，可能與腦干下行疼痛調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關(guān)，該系統(tǒng)包括中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)（periaqueductal gray，PAG）、三叉神經(jīng)脊束核尾側(cè)亞核（caudal spinal trigeminal nucleus，TNC）等［1］。偏頭痛發(fā)作間期進行磁共振彌散張量成像，發(fā)現(xiàn)三叉神經(jīng)脊束核和PAG表現(xiàn)出更大的平均擴散率［2］，磁共振波譜發(fā)現(xiàn)谷氨酸（glutamate，Glu）和γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric acid，GABA）存在異常［3］。Glu、GABA分別是神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，兩者之間調(diào)節(jié)異常可引起慢性疼痛［4］。本研究旨在探討偏頭痛模型PAG和TNC中的Glu及GABA變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級別SD雄性大鼠30只，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016，動物合格證編號：2008001670602。分籠飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心，自由取食、飲水。本實驗經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心批準(zhǔn)（動物實驗設(shè)施使用許可證編號：2016143），動物實驗條件合格證號：SYXK（浙）2013-0184。

1.2 藥物與試劑 硝酸甘油（批號：20150814，北京益民藥業(yè)有限公司）；重水（批號：MKBW4494V，美國Aldrich公司）；利扎曲普坦（批號：20160419，湖北歐力制藥有限公司）；甲醛溶液（批號：20170412，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

1.3 實驗器材 冰凍切片機（型號：HM 550 VPD，美國Thermo SCIENTIFIC公司）；600 M核磁共振波譜儀（型號：600 MHz/AVANCE HD，瑞士BRUKER公司）；5 MM核磁管（型號：WG-1000-7，美國WILMAD公司）。

1.4 實驗方法 （1）分組、給藥與造模：30只大鼠采用Excel軟件完全隨機設(shè)計的分組方法分為對照組、模型組和西藥組，每組各10只。對照組、模型組灌胃超純水，西藥組灌胃利扎曲普坦（溶于超純水配成0.102 mg/mL濃度），給藥劑量1 mL/100 g，每日上午1次，連續(xù)灌胃7天。在第7天灌胃結(jié)束后，于透明鋼化玻璃箱（30 cm×30 cm×40 cm）中適應(yīng)0.5 h，然后于上午9：30～10：00進行造模，對照組腹腔注射生理鹽水，模型組、西藥組腹腔注射濃度5 mg/mL硝酸甘油，給藥劑量0.2 mL/100 g。（2）行為學(xué)錄制與福爾馬林實驗：腹腔注射藥物5 min后，于玻璃箱中觀察大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，保持周圍環(huán)境安靜，用高清攝像機錄制4 h行為學(xué)視頻。行為學(xué)錄制結(jié)束后，在大鼠左后爪的中間跖區(qū)域皮下注射100 μL的1%福爾馬林（甲醛稀釋于0.9%生理鹽水），注射完成后立即放入鐵架上的玻璃箱中，通過下方45°斜放的鏡面反射大鼠足部動作，用攝像機錄制大鼠足部行為1.5 h。（3）取PAG與TNC：足部行為錄制結(jié)束后，予各組大鼠1%戊巴比妥鈉0.5 mL/100 g麻醉。取出腦組織，在低溫環(huán)境下分離出腦干，放入液氮中運輸至實驗室，再將腦干置于-20 ℃的冰凍切片機上，根據(jù)《大鼠腦立體定位圖譜》（第6版）進行特定核團的定位，進一步分離出PAG與TNC，所有組織存于-80 ℃冰箱。（4）核磁共振波譜代謝組學(xué)：①取出TNC和PAG用電子天平稱重并記錄；②樣品放入含有600μL 0.05% TSP-d4重水的研磨管中研磨，隨后轉(zhuǎn)移至直徑5 mm的專用核磁管中；③采用Bruker AVANCE ⅢTM 600 MHz（14.09T）核磁共振波譜儀主機，配備5 mm-BBFO探頭，D2O鎖場，自動勻場后，采用noesypr1d序列獲得壓水峰圖譜，獲取時間1.7 s，采集次數(shù)128次，數(shù)據(jù)點32 K，掃描時間約8.9 min；④測量的代謝物包括肌酸（Cr）、GABA、Glu，采用Bruker Topspin 3.2獲取原始數(shù)據(jù)；⑤利用波譜分析處理軟件MestRe Nove處理FID文件，進行傅里葉變換、相位校正和基線校正，以三甲基硅烷丙酸酯（TSP）為內(nèi)標(biāo)，TSP化學(xué)位移為0.00 ppm；⑥計算相關(guān)代謝物絕對濃度：CM=AM/ATSP*fP*CTSP*MWM/WM，再進一步校正TSP和重量因素，絕對濃度=CM/TSP/體重，表示為cGABA、cGlu；⑦計算代謝物相對濃度：相關(guān)代謝物絕對濃度與Cr的比率視為相對濃度，表示為rGABA、rGlu。1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素設(shè)計方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；不符合正態(tài)分布以［M（P25，P75）］表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis H法，兩兩比較采用all pairwise。采用廣義線性混合效應(yīng)模型分析不同部位腦代謝產(chǎn)物的區(qū)別。根據(jù)數(shù)據(jù)分布特點，cGlu光譜數(shù)值取lg值，表示為lg（cGlu）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組的腦代謝產(chǎn)物比較 對照組RTNC一個樣本丟失，一個樣本數(shù)據(jù)圖形差，所以只有8個樣本可進行分析。PAG內(nèi)rGlu的組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.034），模型組較生理鹽水組減少（P=0.031），西藥組與模型組比較有增多趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.288），其余腦代謝物質(zhì)值組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1～4。

表1 三組的cGABA值比較

表2 三組的cGlu值比較

表3 三組的rGABA值比較

表4 三組的rGlu值比較

2.2 腦代謝產(chǎn)物在不同部位的區(qū)別 對cGABA、cGlu、rGABA、rGlu進行廣義線性混合效應(yīng)模型分析。cGABA組間無統(tǒng)計學(xué)差異（F=0.252，P=0.778），部位之間有統(tǒng)計學(xué)差異（F=136.459，P＜0.001）；與RTNC的cGABA（Coefficient=0）相比，PAG的cGABA值更高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（PAG Coefficient=0.261，tPAG=12.483，P＜0.001），而LTNC的cGABA值無統(tǒng)計學(xué)差異（LTNC Coefficient=-0.026，tLTNC=-1.410，P=0.162）。cGlu組間無統(tǒng)計學(xué)差異（F=0.095，P=0.910），部位之間有統(tǒng)計學(xué)差異（F=32.118，P＜0.001）；與RTNC的cGlu（Coefficient=0）相比，PAG的cGlu值更高，差異有統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（PAG Coefficient=0.146，tPAG=6.762，P＜0.001），而LTNC的cGlu值無統(tǒng)計學(xué)差異（LTNC Coefficient=-0.016，tLTNC=-0.644，P=0.522）。rGABA組別與部位有交互效應(yīng)（F=2.957，P=0.025），單獨分析各個部位的組間差異，結(jié)果顯示PAG、RTNC、LTNC的組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。rGlu組間無統(tǒng)計學(xué)差異（F=2.117，P=0.127），部位之間有統(tǒng)計學(xué)差異（F=3.798，P=0.026）；與RTNC的rGlu（Coefficient=0）相比，PAG的rGlu值更高，差別有統(tǒng)計學(xué)意義（Coefficient=0.040，tPAG=2.736，P=0.008），LTNC的rGlu值無統(tǒng)計學(xué)差異（Coefficient=0.016，tLTNC=0.905，P=0.368）。

3 討論

Glu和GABA是偏頭痛的重要神經(jīng)遞質(zhì)，與頭痛的發(fā)生與終止密切相關(guān)［5］。TNC和PAG是偏頭痛的重要疼痛結(jié)構(gòu)。本研究模型組PAG的Glu較對照組減少，而GABA無明顯變化，因此重點圍繞Glu進行討論。

PAG是疼痛調(diào)節(jié)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)［6］，主要負(fù)責(zé)疼痛感知的下行調(diào)節(jié)［7］。PAG-中縫大核回路是偏頭痛主要的下行疼痛調(diào)節(jié)通路。PAG通過Glu激活中縫核，中縫核激活腦啡肽神經(jīng)元，從而抑制C纖維疼痛信號傳入［7］。中縫大核將下行纖維投射到TNC。研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛大鼠模型中PAG、中縫大核和TNC內(nèi)的c-Fos陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加，實驗結(jié)果可見PAG被激活的細(xì)胞數(shù)較TNC多［8］。本研究發(fā)現(xiàn)，PAG的Glu含量較TNC多，提示PAG在偏頭痛中扮演著更重要的角色。有研究發(fā)現(xiàn)，若腹外側(cè)PAG的谷氨酸能神經(jīng)元通過化學(xué)遺傳操作被激活，可抑制傷害感受，但不是所有腹外側(cè)PAG 的谷氨酸能神經(jīng)元亞群都有鎮(zhèn)痛作用，和此作用相關(guān)的是投射到延髓頭端腹內(nèi)側(cè)區(qū)（RVM）的亞群［9］。2020年，HOSSEINI等發(fā)現(xiàn)PAG中代謝型谷氨酸受體亞型8的活化通過調(diào)節(jié)RVM off細(xì)胞活性來改善痛閾。從以上研究可見，谷氨酸是PAG調(diào)節(jié)疼痛的重要神經(jīng)遞質(zhì)。2005年，ISHIDE等發(fā)現(xiàn)對大鼠后肢進行機械刺激可激活C纖維，使PAG內(nèi)的Glu增加，進一步研究發(fā)現(xiàn)L-精氨酸滲入PAG雙側(cè)后，會使機械刺激誘導(dǎo)的Glu釋放減少。本研究對大鼠腹腔注射硝酸甘油后，用福爾馬林對足部進行疼痛刺激，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PAG的Glu釋放減少。這兩個研究有一個共同點，即一氧化氮（nitric oxide，NO）在其中發(fā)揮介導(dǎo)作用。NO在體內(nèi)主要來自于精氨酸［10］，硝酸甘油也是NO的供體［11］，NO升高可誘發(fā)偏頭痛，使用硝酸甘油制備偏頭痛模型是經(jīng)典的造模方法。大鼠注射硝酸甘油后，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化生成NO，進而作用于PAG，使福爾馬林誘導(dǎo)的Glu釋放減少，進一步導(dǎo)致PAG內(nèi)Glu的鎮(zhèn)痛作用減弱［12］，因為Glu可誘導(dǎo)神經(jīng)元一氧化氮合酶釋放NO［13］，本研究結(jié)果還提示NO和Glu之間可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制。利扎曲普坦是臨床上用于治療偏頭痛的5-HT 1B / D受體激動劑，雖然西藥組PAG內(nèi)的Glu和模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，但也存在升高趨勢，可能與5-HT 1B / D受體激動劑可以降低大鼠腦中NO含量的作用有關(guān)［10］。TNC是三叉神經(jīng)通路的二級傷害感受神經(jīng)元。偏頭痛的發(fā)作最有可能起源于下丘腦，并激活TNC［14］。1987年，MAGNUSSON等發(fā)現(xiàn)谷氨酸能三叉神經(jīng)丘腦投射神經(jīng)元主要分布在三叉神經(jīng)感覺主核，三叉神經(jīng)脊束極間亞核，而在TNC分布較少。2006年，OSHINSKY等研究發(fā)現(xiàn)TNC細(xì)胞外Glu增加的時間過程與大鼠面部感覺閾值的變化有關(guān)。2014年，OSHINSKY等在慢性三叉神經(jīng)痛大鼠模型上腹腔注射硝酸甘油后，發(fā)現(xiàn)TNC上的Glu明顯增加。也有研究顯示，通過注射硝酸甘油獲得偏頭痛模型的面部疼痛閾值無明顯變化［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，偏頭痛模型TNC上的Glu無明顯變化，可能是因為造模后面部疼痛閾值無變化，并且本研究未對大鼠面部進行任何疼痛刺激。結(jié)合既往研究認(rèn)為，TNC的Glu主要參與面部疼痛的調(diào)控。

綜上所述，PAG在偏頭痛中發(fā)揮著重要作用，硝酸甘油可能通過NO影響PAG內(nèi)Glu的釋放，進而影響對疼痛的反應(yīng)，為偏頭痛患者鎮(zhèn)痛能力減弱的現(xiàn)象提供了一種解釋［16］，下一步將會進行NO如何調(diào)控PAG的Glu的研究。本研究PAG與TNC的GABA絕對濃度不同，但相對濃度無差異，雖然這兩個部位的GABA未受到硝酸甘油明顯影響，但是GABA和疼痛密切相關(guān)，還需進一步完善GABA在其他偏頭痛相關(guān)結(jié)構(gòu)中的研究。