養殖密度對厚頜魴幼魚生長、飼料利用及腸道抗氧化應激性能的影響*

王 堯 陳晨光 張潔若 高煜杰

(海南大學海洋學院 海南 海口 570228)

厚頜魴(Megalobrama pellegrini)俗稱烏鳊，屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、鲌亞科(Culterinae)、魴屬(Megalobrama)，主要分布在長江上游干流及烏江、岷江、赤水河、沱江、嘉陵江等支流的中下游，是我國長江上游地區具有較高經濟價值的魚類之一(李文靜等, 2007)。然而，由于棲息地的破壞以及過度捕撈等人為因素的影響，導致其種群數量急劇減少，現屬于三級保護物種(劉軍, 2004)。目前，雖已能夠進行厚頜魴的人工繁育，但其相關研究工作開展較晚，缺乏對其養殖模式的探究，因此，也限制了其種質資源的有效恢復以及此優良品種的快速發展。

集約化養殖已逐步成為我國漁業生產的主要方式，極大促進了我國水產養殖業的快速發展。而其中養殖密度是集約化養殖生產過程中最基本的生產管理要素，增加養殖密度也是提高單位水體產量的常用方法。然而，養殖密度過高，將對魚類生長產生負面影響，同時造成水體環境惡化，從而增大養殖風險(張曉等, 2020)。在多數常見魚類研究中如大菱鲆(Scophthalmusmaximus)(喬 瑋 等 , 2014)、 施 氏 鱘(Acipenser schrenckii) (任源遠等, 2014)、團頭魴(Megalobrama amblycephala) (亓成龍，2016)、瓦氏黃顙魚(Pelteobagrusvachelli) (姚清華等, 2018)和羅非魚(Oreochromisniloticus) (肖煒等, 2019)均發現養殖密度過高會抑制魚體的正常生長。此外，養殖密度引起的生理壓力會導致魚體產生氧化應激，加快活性氧(ROS)的產生，并對動物體內細胞結構產生損傷，從而危害魚體健康。同時，也會消耗參與組成抗氧化系統的某些維生素和礦物元素，導致必需營養元素的缺乏(Costas et al, 2013)。而機體內由超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和谷胱甘肽酶系(GR、GSH-Px、GST)組成的抗氧化體系能夠清除體內多余自由基，從而保證機體健康。而非酶系統中熱休克蛋白(HSP)及谷胱甘肽(GSH)等小分子物質，可保護蛋白質等分子物質免受自由基誘導的損害(Limon-Pacheco et al, 2009)。研究顯示，養殖密度過高時魚體內抗氧化酶活性(SOD, GSH-Px)減弱，抗氧化能力降低，而脂質過氧化產物(丙二醛)和應激反應代謝產物(葡萄糖、乳酸和皮質醇)升高(張龍等, 2019)。但對于有些魚類而言，養殖密度過低不利于其集群行為的發生，因而也會影響魚體生長，且較低的養殖密度也限制了資源的有效利用，減少養殖收益(Millancubilloet al,2016)。由此可見，適宜的養殖密度對養殖魚類生長和健康至關重要。

因此，本文以厚頜魴幼魚為研究對象，探究養殖密度對其生長性能、魚體組成和抗應激性能的影響，以期為提高厚頜魴幼魚苗種培育效率、恢復其種質資源提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與實驗設計

實驗用厚頜魴幼魚由金沙江珍稀特有魚類增殖放流站孵育，挑選健康活潑、規格相近的個體1620尾，初始平均體重為(0.45±0.01) g，體長為(3.10±0.02) cm，分別置于15個玻璃纖維缸(直徑為50 cm，高度為75 cm)中。實驗共設計5個密度梯度組，分別為0.15 kg/m3(50尾/桶)、0.24 kg/m3(80尾/桶)、0.34 kg/m3(110尾/桶)、0.42 kg/m3(140尾/桶)和 0.50 kg/m3(170尾/桶)，每個處理組設置3個平行，開展為期42 d的養殖實驗。實驗期間每天投喂魚體體重為5%的商品飼料(四川通威，粗蛋白為33%，粗脂肪為4%)，分別于09:00和16:30進行投喂。采用流水養殖，水溫為(26.0±0.5)℃，溶解氧(DO)為(6.02±0.20) mg/L。

1.2 樣品采集

42 d養殖實驗結束后，所有實驗魚饑餓24 h，統計每個養殖缸中魚體終末體重、尾數及投喂飼料總量，并依據以下公式計算相關指標：

增重率(WG, %)=100×(Wt-W1)/ W1；

特定生長率(SGR, %/d)=100×(lnW2-lnW1)/(t2-t1)；

飼料系數(FCR)=F/[n(W2-W1)]；

成活率(SR, %)=終末尾數/初始尾數×100%。

式中，n為尾數，F為總投餌量(g)，W1、W2為初始時間(t1)和實驗結束(t2)時魚體體重(g)。

每個實驗缸隨機選取 11尾魚，用 MS-222將其麻醉，從中選取5尾魚用于全魚組分分析；取6尾魚解剖得到腸道樣品，立即置于液氮中用于后續酶活分析和RNA提取。

1.3 體成分分析

水分含量：將全魚樣品放置在105℃烘箱中并按照減重法進行水分測定及計算(GB/T9695.15-2008)；粗蛋白含量：利用杜馬斯燃燒法快速定氮儀(Elementar,德國)(AOAC, 2005)進行測定；粗脂肪含量：利用脂肪抽提儀(海能SOX406, 中國)有機溶劑抽提法(石油醚，沸程為60℃～90℃)進行粗脂肪測定(GB/T14772-2008)。

1.4 腸道氧化應激相關指標測定

腸道粗提液的制備：準確稱取腸道樣本并記錄，與 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液按照質量體積比1∶9混合，進行冰浴勻漿，4℃ 12,000 r/min 離心 15 min，收集上清液轉到新的離心管，置于-80℃冰箱保存待測。總蛋白含量測定利用BCA微板法；超氧化物歧化酶(SOD)活性利用WST-8法測定；總抗氧化能力(T-AOC)利用ABTS法；丙二醛(MDA)含量利用硫代巴比妥酸法測定；還原性谷胱甘肽(GSH)含量利用DTNB微板法測定。其中，過氧化氫酶(CAT)活性和MDA含量測定采用碧云天試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，其他3種酶的測定均采用南京建成試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.5 腸道氧化應激相關基因表達分析

利用Trizol試劑法(Invitrogen, 美國)提取厚頜魴腸道總 RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗 RNA完整性，參照反轉錄試劑盒(PrimeScript RT Master Mix，TaKaRa)說明書，將RNA反轉錄為cDNA。在熒光定量 PCR 儀(QuantStudio 6 Flex, Applied Biosystems, 新加坡)上進行實時熒光定量PCR (qPCR)測定，該實驗反應總體系為10 μL，包括5 μL TB Green Premix ExTaq(TaKaRa，大連)，各 0.2 μL 正反引物(10 μmol/L)，4.1 μL無核酶DEPC水和0.5 μL cDNA。qPCR反應程序如下：95℃，10 min；95℃，15 s，56℃，60 s，40個循環；70℃，20 s。引物序列根據NCBI上魚類相關目的基因序列用Premier 5.0設計，驗證正確后使用，詳見表 1。在每個 PCR反應最后，擴增產物的溶解曲線表明這些反應均是單一產物。標準曲線采用8個不同稀釋濃度(每個3個平行)，擴增效率根據E=10(-1/slope)-1計算。目的基因表達水平由2-ΔΔCt法計算。

表1 實時熒光定量基因表達引物序列Tab. 1 Primers used for real-time quantitative RT-PCR (qPCR)

1.6 數據統計分析

數據用平均值±標準誤(Mean±SE)表示，采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和Tukey’s多重檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 實驗結果

2.1 養殖密度對厚頜魴幼魚生長、飼料利用及成活率的影響

如表 2所示，厚頜魴幼魚生長(末平均體重、增重率和特定生長率)隨著養殖密度的逐漸增大呈先上升后下降的趨勢。魚類增重率和特定生長率在密度為0.34 kg/m3時最高，顯著高于最高密度處理組(0.5 kg/m3)(P＜0.05)，但與其他密度處理組間無顯著差異(P＞0.05)。飼料系數在0.5 kg/m3密度處理組時最高，顯著高于 0.15、0.24和 0.34 kg/m3密度處理組(P＜0.05)，其他各組間飼料系數差異不顯著(P＞0.05)。提高養殖密度并沒有造成養殖魚成活率降低，實驗各組存活率均較高，差異不顯著(P＞0.05)。

表2 養殖密度對厚頜魴幼魚生長及飼料利用的影響Tab. 2 Effects of stocking density on growth and feed utilization of juvenile M. pellegrini

2.2 全魚體成分指標

厚頜魴幼魚體組成受到養殖密度的顯著影響(表 3)。隨著養殖密度的逐漸升高，魚體體組成呈現出先上升而后下降的趨勢。當養殖密度為0.34 kg/m3時，厚頜魴幼魚全魚粗蛋白和粗脂肪含量顯著高于其他各實驗組(P＜0.05)，而最高密度處理組(0.5 kg/m3)全魚粗蛋白和粗脂肪含量顯著低于其他各實驗組(P＜0.05)。

表3 養殖密度對厚頜魴幼魚全魚體成分的影響Tab. 3 Effects of stocking density on whole-body composition of juvenile M. pellegrini

2.3 腸道抗氧化酶活性相關指標

如表4所示，厚頜魴幼魚腸道抗氧化酶相關指標受到養殖密度的顯著影響。其中，低密度組(0.15 kg/m3)和高密度組(0.42和0.50 kg/m3)魚體腸道總抗氧化能力顯著低于0.24和0.34 kg/m3密度處理組(P＜0.05)。腸道SOD和CAT活性隨養殖密度增大呈顯著降低的趨勢，養殖密度為0.50 kg/m3時，腸道SOD和CAT活性最低，且顯著低于其他各處理組(P＜0.05)。GSH含量隨著養殖密度增大呈先上升后下降的趨勢，最高值出現在0.34 kg/m3處理組，且顯著高于其他各實驗組(P＜0.05)。最高養殖密度組(0.50 kg/m3)腸道MDA含量顯著高于其他各處理組(P＜0.05)，而0.24 kg/m3密度組魚體腸道MDA含量最低，并顯著低于其他各處理組(P＜0.05)。

表4 養殖密度對厚頜魴幼魚腸道抗氧化酶活性的影響Tab. 4 Effects of stroking density on intestinal antioxidant enzymes activities of juvenile M. pellegrini

2.4 腸道氧化應激相關基因表達

如圖1所示，厚頜魴幼魚腸道Hsp90基因表達在各密度處理組間無顯著差異(P＞0.05)。CYP1A基因表達隨養殖密度增大有升高趨勢，其中，最低密度實驗組(0.15 kg/m3)厚頜魴幼魚腸道CYP1A基因表達最低，且與0.42 kg/m3實驗組間有顯著性差異(P＜0.05)，其他各處理組間無顯著性差異(P＞0.05)。最高養殖密度組(0.50 kg/m3)魚體腸道Nrf2基因表達水平最高，顯著高于0.15和0.34 kg/m3密度處理組；而魚體腸道MnSOD基因表達在最高養殖密度組(0.50 kg/m3)顯著低于適中養殖密度組(0.34 kg/m3)。

圖1 養殖密度對厚頜魴幼魚腸道氧化應激相關基因表達的影響Fig.1 Effects of stocking density on intestinal oxidative stress related genes expressions of juvenile M. pellegrini

3 討論

適宜的養殖密度對魚類早期生長及存活起到至關重要的作用，同時，也是提高水產養殖生產收益的重要方式。結果顯示，過高的養殖密度(0.50 kg/m3)會顯著抑制厚頜魴幼魚生長，而適宜養殖密度(0.34 kg/m3)條件下魚體增重率達到最大值。同樣，在大口黑鱸(Micropterus salmoides)(倪金金等, 2020)、羅非魚(左騰等, 2019)、塞內加爾舌鰨(Solea senegalensis)(Andradeet al, 2015)及斑點叉尾(Ictalurus punctatus)(Refaeyet al, 2018)等魚類的研究中均發現，養殖密度過高時會顯著抑制魚體生長。劉群等(2014)認為，高密度養殖條件對魚體造成的應激效益會提高其對能量的消耗以及分配利用，從而干擾魚類正常生理狀態，進而對生長產生不利影響。然而，在石首魚(Argyrosomus japonicus)中的研究發現，提高養殖密度能夠促進魚體生長，低密度情況下反而會抑制魚體生長(Pirozziet al，2009; Millancubilloet al, 2016)。同樣，銀鯧(Pampusargenteus)幼魚在低密度養殖條件下生長顯著低于中密度組，表明群居習性魚類在過低養殖密度時不利于其生長(倪嘉豪等, 2020)。以上研究表明，養殖密度對魚體生長的影響與種類、生長階段、實驗設計以及養殖條件密切相關。因此，有必要研究和確定養殖對象的最適養殖密度，從而為提高養殖效率提供依據。

養殖密度較高時會增加魚體間攝食時的競爭及游動速度，導致能量消耗增加或者影響部分魚體的攝食過程，最終影響魚體生長(Calabrese et al, 2017)。本研究結果也顯示，當養殖密度過高時(0.50 kg/m3)厚頜魴幼魚飼料系數顯著升高。在雜交鱧(Channa maculata × C. argus)(吳曉清等, 2017)、施氏鱘(Li et al,2012)等魚類的研究中也呈現出類似實驗結果。同時，還發現隨著養殖密度升高，攝食率和蛋白質效率降低，表明過高的養殖密度降低了魚體對飼料的利用效率，繼而影響其生長。但在羅非魚(左騰等, 2019)、團頭魴(Qi et al, 2016)等魚類中的研究顯示，養殖密度對魚體飼料系數無顯著影響。本實驗結束時，所有實驗組魚體成活率均較高，未受到高密度的影響。Iguchi等(2003)認為，在適宜養殖密度范圍內，魚體成活率受到養殖密度的影響較小，但超過一定閾值后，成活率也會隨著密度的升高而降低，這也是大多數實驗中魚體成活率并未受到養殖密度顯著影響的主要原因。而Aksungur等(2007)研究顯示，養殖密度過高時底棲魚類大菱鲆成活率顯著降低。因此，養殖密度對魚類成活率的影響也與其生活習性密切相關。

魚類在養殖過程中不斷攝取營養物質，通過消化、吸收和轉化等過程，將一部分營養物質用于能量代謝而維持生命活動，其他部分則以蛋白質、脂肪等形式儲存，用于生長與繁殖。魚體蛋白質和脂肪水平能夠直接反映魚類營養價值。而除飼料組成之外，養殖環境和養殖方式等均會對魚體成分造成顯著影響(Toko et al, 2007)。本研究結果顯示，最高密度養殖條件下魚體水分含量、粗蛋白和粗脂肪含量相較于最低密度組顯著降低，在斑點叉尾研究中也發現類似結果(Omar, 1996)。Ren 等(2017)研究發現，高密度養殖會引起脂蛋白脂肪酶和脂肪酶mRNA表達量降低，過氧化物酶體增殖物激活受體α mRNA表達量升高，從而導致高密度組肌肉脂肪含量較低。由此可見，在高密度養殖條件下魚體脂肪代謝受到影響。針對雜交鱘幼魚的研究也顯示，魚體粗蛋白、粗脂肪含量隨養殖密度增大而降低，養殖60 d時，高密度組魚體粗蛋白含量顯著較低，而粗脂肪含量無顯著差異(步艷等, 2014)。亓成龍等(2016)研究顯示，團頭魴幼魚魚體粗脂肪含量則隨著養殖密度升高而顯著降低，而粗蛋白含量在不同的養殖密度組之前不存在顯著性的差異。但在施氏鱘(任源遠等, 2014)和瓦氏黃顙魚(姚清華等, 2018)的研究中，高密度條件下魚體肌肉粗脂肪含量顯著低于低密度組。

魚類進行正常生命活動時，細胞代謝不斷產生氧自由基。但當機體受到外界環境刺激時，體內產生過多自由基如不能及時清除，則會對細胞分子甚至機體產生危害。大量研究表明，不適宜的養殖密度會導致魚體產生應激反應，從而產生過量氧自由基(ROS)。SOD和CAT是動物體酶類抗氧化系統的重要組成部分，能夠清除體內多余自由基，保護自身免受氧化損傷(Barton, 2002)。本研究結果顯示，厚頜魴幼魚腸道SOD活性和CAT活性隨養殖密度的增大呈顯著下降趨勢。同樣，在斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)(鄭樂云等, 2013)和大菱鲆(Liu et al, 2016)研究中也發現，血清SOD活性和肝臟SOD、CAT活性隨著養殖密度升高而顯著下降。此外，養殖密度過高時，厚頜魴幼魚腸道脂質過氧化終產物MDA含量顯著增加，表明厚頜魴幼魚與其他大多數魚類一樣，養殖密度過高時，氧化應激水平會增加。而在鯽魚(Carassius cuvieri)中的研究同樣發現，高密度情況下不僅血清MDA含量顯著升高，堿性磷酸酶和溶菌酶等免疫指標也顯著降低(吳宗凡等, 2014)。然而，在石首魚中研究發現，低密度實驗條件下魚體更易處于應激狀態，與高密度組相比具有更高的血清皮質醇和葡萄糖水平(Pirozzi et al, 2009)。由此可見，不同魚類對養殖密度的耐受存在較大差異，且由應激引起的生理變化也各不相同。

細胞色素P450 (CYP450)是生物體內含有多種超家族CYP450血紅蛋白或相同結構域的酶系，作為生物標志物已廣泛應用于魚類環境毒理學研究，其基因或蛋白水平變化能夠反映魚體生理壓力和免疫反應(李春杰等, 2014)。當機體受到應激原刺激時，細胞受到損害從而導致變性蛋白數量增加、肽鏈空間結構改變、蛋白功能喪失。而熱休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)是生物體在外界環境應激刺激下誘導生成的一組蛋白質，其中，HSP90可以促進肽鏈重新折疊，修復變性蛋白，提高細胞對逆境的耐受性(默立賓等,2018)。本研究表明，在最高養殖密度(0.42 kg/m3)條件下厚頜魴幼魚腸道CYP1A基因表達水平顯著高于最低密度組(0.15 kg/m3)。Liu等(2016)在大菱鲆中的研究顯示，較長養殖周期時高密度才會對魚體產生氧化應激，肝臟CYP1A和HSP70基因表達水平顯著上調，而 HSP90基因表達不受影響。本研究與塞內加爾鰨魚等魚類中的研究一致，發現養殖密度對HSP90基因表達影響不顯著。由此可見，位于內質網和線粒體的CYP1A更易受到密度脅迫的影響，而HSP對密度脅迫的響應則與魚體種類、基因家族類型密切相關，且敏感性可能低于熱應激等脅迫因子。

Nrf2是一種重要的氧化應激敏感性轉錄因子。動物體在正常生理狀態下，Nrf2通過泛素化標記途徑降解，當受到氧化應激后，Nrf2游離出來并與抗氧化反應元件結合，促進抗氧化基因的表達，從轉錄水平調控體內的氧化應激反應。本研究結果顯示，最高養殖密度(0.50 kg/m3)條件下，厚頜魴幼魚腸道Nrf2基因表達水平顯著高于最低(0.15 kg/m3)和適中(0.34 kg/m3)養殖密度組，表明高密度環境讓魚體處于應激狀態從而激活了Nrf2信號分子。而Sahin等(2014)在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)中的研究也發現，高密度養殖條件下 Nrf2被激活由細胞質易位至細胞核從而導致其蛋白表達水平降低，而抗氧化劑番茄紅素使高密度養殖條件下魚體Nrf2蛋白表達處于較高水平。

錳超氧化物歧化酶(MnSOD)是一種含金屬輔基的抗氧化酶，能將氧自由基快速歧化為分子氧(O2)和過氧化氫(H2O2)。雖未有養殖密度對MnSOD基因表達影響的相關報道，但發現其他環境脅迫因子如pH、溫度、重金屬和氨氮等會調控其 mRNA表達水平，從而參與機體氧化應激反應。本研究發現，最高養殖密度(0.50 kg/m3)處理組厚頜魴幼魚MnSOD基因表達水平顯著低于適中密度處理組(0.34 kg/m3)，表明長期高密度養殖條件下魚體內氧化應激平衡狀態受到影響，從而抑制了抗氧化應激相關基因MnSOD的有效表達，導致魚體長時間處于應激狀態，生長也受到顯著影響。同樣，Hoseini等(2020)在虹鱒中的研究中也發現，養殖密度過高時會引起魚體腸道的氧化應激反應。Refaey等(2018)在斑點叉尾的研究中還發現，養殖密度過高時會損傷魚體腸道結構，如腸道肌層變厚、杯狀細胞數量變少、體積變小以及腸道絨毛變短等；Wang等(2020)在大口黑鱸研究中同樣發現，高密度組魚體腸道杯狀細胞數量變少、體積變小，腸道肌層變厚但腸道絨毛無顯著變化。而Sundh等(2019)研究顯示，高密度處理組大西洋鮭腸道屏障功能受到顯著影響。由此可見，在高密度養殖條件下腸道結構和功能均受到顯著影響，而未來對于養殖密度的研究也應更加關注魚體的腸道發育狀況和健康狀態。

4 結論

本研究表明，厚頜魴幼魚在體重為0.45～1.36 g階段時，0.34 kg/m3的養殖密度能讓其獲得最大生長。當養殖密度達到 0.5 kg/m3時，魚體不僅飼料利用率下降，生長受到抑制，而且受到氧化應激，表現在腸道氧化應激相關酶活性及基因表達受到顯著影響。因此，適宜的養殖密度對于提高厚頜魴幼魚苗種培育效率，保證其健康生長至關重要。