山黧豆LsSULTR基因的克隆與表達分析

陳 紅，曾 鵬，徐全樂

(西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊陵 712100)

山黧豆(Lathyrussativus)具有較高的蛋白含量、廣譜的抗逆性以及對環境友好等特征，對于聯合國糧農組織零饑餓計劃(Zero Hunger in Asia and the Pacific)的實施具有重要的作用[1]。其內源活性成分β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸(β-N-oxalyl-L-α,β-diaminopropionic acid，β-ODAP)廣泛存在于三七和人參等傳統中藥材中，具有止血、抗炎、保護神經的作用，被命名為三七素[2-3]。研究表明，β-ODAP的生物合成途徑和硫代謝途徑密切相關[3-6]。

植物硫酸鹽轉運蛋白(sulfate transporter，SULTRs)可以吸收和轉運土壤硫酸鹽參與植物硫代謝[7]。目前，擬南芥[8](Arabidopsisthaliana)、大豆[9](Glycinemax)、水稻[10](Oryzasativa)等多種植物的SULTR基因已經得到克隆和鑒定。通常，植物基因組含有多個SULTR基因，例如擬南芥、水稻等基因組分別含有12和11個SULTR基因，苔蘚基因組含有5個SULTR基因[11-12]。植物硫酸鹽轉運蛋白屬于ABC轉運蛋白超家族(ATP-binding cassette transporter，ABC)，其特征為C端具有抗σ因子拮抗(antisigma factor antagonist，STAS)結構域，N端具有硫轉運(Sulfate_transp)結構域；同時，還包含跨膜結構域(transmebrane domains，TMDs)[13]。根據序列同源性、亞細胞定位、功能特異性等將SULTR劃分為SULTR Ⅰ-Ⅳ等4個亞家族，包含高親和力硫酸鹽轉運蛋白(high-affinitysulfatetransporters，HAST)、低親和力硫酸鹽轉運蛋白(low-affinity sulfate transporters，LAST)、液泡轉運蛋白、質膜及內共生體轉運蛋白等[14-15]。其中，HAST廣泛分布于根表皮，包含SULTR1;1、SULTR1;2、SULTR1;3，促進植物對土壤硫酸鹽的吸收；LAST主要在鄰近木質部和韌皮部的薄壁組織表達，負責長距離運輸，包含SULTR2;1、SULTR2;2、SULTR3;5。SULTR1;3、SULTR2;1、SULTR2;2、SULTR3;5協同作用將根吸收的硫酸鹽長距離運輸到莖及葉片的葉肉細胞，一部分被SULTR4;1和SULTR4;2運載到液泡儲存，一部分被SULTR3;1、SULTR3;2、SULTR3;3、SULTR3;4等運載到胞質參與代謝反應[7,12,16]。

本研究經序列比對分析，從山黧豆種子萌發期不同組織的轉錄組數據(SRP145030)中查找到13條LsSULTR基因序列。通過LsSULTR基因表達與β-ODAP含量的相關性分析，篩選了LsSULTR3;3和LsSULTR3;5進行功能預測、基因克隆和組織表達分析等，為進一步研究山黧豆LsSULTR基因在β-ODAP生物合成中的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

山黧豆(Lathyrussativus)種子為本實驗室保存，種植于西北農林科技大學試驗田。取山黧豆不同生長時期的主根、側根、幼葉、成熟葉、莖、花、莢，以及盛莢初期(S2)、鼓粒滿期(S6)和完熟期(S8)的種子，液氮速凍后于-80 ℃保存備用。

1.2 方 法

1.2.1 本地山黧豆轉錄組數據庫中鑒定LsSULTR從NCBI下載12條擬南芥(Arabidopsisthaliana)硫酸鹽轉運蛋白的編碼序列(coding sequence，CDS)作為參考序列，利用BioEdit在本實驗室前期所測的山黧豆種子萌發期不同組織[播種后2 d(days after sowing，DAS)種子、6DAS幼苗、25DAS葉片]的轉錄組分析數據庫(SRP145030)中進行本地序列比對，獲得山黧豆硫酸鹽轉運蛋白基因序列。用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)獲得轉錄本對應的蛋白序列，并用MEGA-X軟件按最大似然法(Maximum Likelihood)構建擬南芥和山黧豆硫酸鹽轉運蛋白進化樹，Bootstrap設置500次重復。

1.2.2 生物信息學分析利用MEGA-X軟件，以最大似然法建立山黧豆(L.sativus)、擬南芥(A.thaliana)、豌豆(Pisumsativum)等的硫酸鹽轉運蛋白SULTR3;3和SULTR3;5的進化樹。運用在線軟件SMART(http://smart. embl-heidelberg.de/)分析LsSULTR3;3和LsSULTR3;5蛋白的保守結構域，利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp. fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.

表1 本研究所用的引物

html)預測蛋白質的二級結構組成，TMHMM(http://www. cbs.dtu.dk/services/(TMHMM/)預測蛋白質跨膜結構域，SignalP 4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)和WoLFPSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)等方法預測蛋白亞細胞定位，SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org)預測蛋白質的三維結構。利用NetPhos3.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預測蛋白磷酸化位點，PlantCare(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html)預測啟動子順式作用元件。

1.2.3LsSULTR3;3和LsSULTR3;5基因CDS全長序列的克隆采用RNAiso Plus(TaKaRa)提取山黧豆25 DAS葉片的總RNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用FastKing RT Kit(With gDNase)反轉錄試劑盒(天根)獲得cDNA序列用于LsSULTR3;3和LsSULTR3;5基因CDS全長序列的克隆。PCR擴增體系為20 μL，包含cDNA模板1 μL，2×Green Taq Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL；PCR程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，67 ℃退火15 s，72 ℃延伸2 min，35個循環。PCR產物送北京擎科生物科技有限公司西安分公司測序。

1.2.4 基因表達分析采用RNAiso Plus(TaKaRa)提取不同生長時期山黧豆的主根、側根、幼葉、成熟葉、莖、花、莢、S2時期種子、S6時期種子、S8時期種子的總RNA。根據LsSULTR3;3和LsSULTR3;5序列設計基因特異性引物(表1)，以poly-ubiquitine(LspUBQ)為內參基因進行半定量RT-PCR分析。

2 結果與分析

2.1 本地轉錄組數據中LsSULTR基因的表達分析

以擬南芥硫酸鹽轉運蛋白的CDS序列為參考序列，在山黧豆種子萌發期不同組織的轉錄組學分析數據庫(SRP145030)中比對到13條山黧豆LsSULTR基因(表2)。進化樹分析表明，擬南芥SULTR蛋白和本地轉錄組數據庫中的LsSULTR基因編碼蛋白分別隸屬于SULTR Ⅰ-Ⅳ 4個亞家族，(圖1)。

黑色三角表示山黧豆硫酸鹽轉運蛋白圖1 山黧豆和擬南芥(AtSULTRs)硫酸鹽轉運蛋白的進化分析LsSULTRs were marked with black triangleFig.1 Phylogenetic tree of putative LsSULTRs and characterized AtSULTRs

在轉錄組樣本中，LsSULTR基因的表達量呈現顯著性差異。例如，當6 DAS和2 DAS比較時，LsSULTR3;5基因的表達量下調了6.067倍(P<0.05)；在25 DAS和6 DAS比較時，LsSULTR2;1和LsSULTR2;2-2基因的表達量分別上調了3.277(P<0.05)和3.865倍(P<0.01)(表2)。LsSULTR2;1和LsSULTR2;2與擬南芥低親和力轉運蛋白AtSULTR2聚為一簇(圖1)，可能主要負責硫酸鹽的運輸[14]；LsSULTR3;5與擬南芥 AtSULTR3;5聚為一簇(圖1)，可能參與硫酸鹽的跨膜運輸、還原或者增強SULTR2蛋白的硫酸鹽運輸能力[13-14]。本研究選取LsSULTR3;3和LsSULTR3;5進行后續分析。

表2 山黧豆種子萌發期LsSULTRs轉錄組數據的差異表達分析

2.2 LsSULTR3;3和LsSULTR3;5蛋白生物信息學分析

2.2.1 蛋白理化性質分析蛋白質理化性質分析顯示，LsSULTR3;3由653個氨基酸組成，分子量為71.39 kD，等電點為9.28；LsSULTR3;5蛋白由640個氨基酸組成，分子量為70.72 kD，等電點為9.01。

2.2.2 進化分析構建山黧豆、擬南芥、豌豆等物種的SULTR3;3和SULTR3;5蛋白系統發育樹(圖2)。結果顯示，LsSULTR3;3蛋白與豌豆PsSULTR3;3(AKV94662.1)聚在同一支，LsSULTR3;5蛋白與豌豆PsSULTR3;5(AKV94664.1)聚在同一支，且相似度均達到100%。說明LsSULTR3;3和LsSULTR3;5分別隸屬于SULTR3;3和SULTR3;5蛋白家族，山黧豆與豌豆硫酸鹽轉運蛋白的親緣關系最近。

2.2.3 蛋白結構分析SMART分析表明，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5具有硫酸鹽轉運蛋白的典型結構域。LsSULTR3;3在N端存在Sulfate_transp結構域(PF00916，80-461位氨基酸)，C端存在STAS結構域(PF01740，512-630位氨基酸)；LsSULTR3;5在N端存在Sulfate_transp結構域(PF00916，74-455位氨基酸)，C端存在STAS結構域(PF01740，506-620位氨基酸)。

黑色三角形為LsSULTR3;3和LsSULTR3;5蛋白圖2 硫酸鹽轉運蛋白SULTR3;3和SULTR3;5系統發育樹Black triangle represents LsSULTR3;3 and LsSULTR3;5 Fig.2 Phylogeny of SULTR3;3 and SULTR3;5 proteins

采用SignalP 4.0分析表明，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5均為分泌蛋白；采用WoLF PSORT分析表明，LsSULTR3;3定位于質膜、液泡和內質網，LsSULTR3;5定位于質膜。采用TMHMM預測蛋白質的跨膜結構域顯示，LsSULTR3;3有9個跨膜結構(transmebrane domains，TMDs)，跨膜區段分別為104-126、160-182、195-212、242-264、269-291、362-384、397-416、426-448和455-477位氨基酸。LsSULTR3;5有11個TMDs，跨膜區段分別為73-95、115-137、158-180、190-212、235-253、263-285、320-342、357-379、392-414、418-435、455-477位氨基酸。拓撲結構表明，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5蛋白N端位于質膜內，C端位于質膜外(圖3)。

運用在線軟件SOPMA進行二級結構預測顯示，在LsSULTR3;3蛋白中，β-螺旋50.23%、無規卷曲30.93%、β-轉角3.98%、延伸鏈14.85%；在LsSULTR3;5蛋白中，α-螺旋49.06%、無規卷曲31.56%、β-轉角4.22%、延伸鏈15.16%。說明α-螺旋和無規卷曲是LsSULTR3;3和LsSULTR3;5蛋白二級結構的主要元件。

采用SWISS-MODEL預測LsSULTR3;3 和LsSULTR3;5三維結構表明，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5蛋白三維結構相似，均可形成同源二聚體。LsSULTR3;3和LsSULTR3;5具有兩個明顯的結構域，其中N端主要由α-螺旋圍繞形成通道進行硫酸鹽的跨膜轉運，C端為STAS結構域。

2.2.4 蛋白磷酸化位點分析利用NetPhos3.1 Server預測蛋白磷酸化位點表明，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5具有多個潛在的磷酸化位點，可被PKA、PKC、cdc2、CKII、DNAPK等多個蛋白激酶磷酸化(圖4)。其中，LsSULTR3;3有101個潛在的磷酸化位點，預測得分大于0.5的有51個位點，包括32個Ser、16個Thr、3個Tyr。LsSULTR3;5有109個潛在的磷酸化位點，預測得分大于0.5的有60個位點，包括34個Ser、20個Thr、6個Tyr(圖4)。

圖3 LsSULTR3;3(A)和LsSULTR3;5(B)跨膜結構域預測Fig.3 Prediction of transmembrane domains of LsSULTR3;3 (A) and LsSULTR3;5(B)

圖4 LsSULTR3;3(A)和LsSULTR3;5(B)磷酸化位點預測Fig.4 Phosphorylation sites prediction of LsSULTR3;3 (A) and LsSULTR3;5 (B)

表3 LsSULTR3;3和LsSULTR3;5的啟動子順式作用元件分析

2.2.5 啟動子順式元件分析以LsSULTR3;3和LsSULTR3;5基因起始密碼子(ATG)上游2 000 bp作為啟動子區段，用在線軟件PlantCare預測啟動子順式作用元件。結果表明，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5啟動子除了含有真核生物啟動子基本元件CAAT-box、TATA-box等以外，還含有ABRE等脫落酸響應元件、干旱響應MYB結合位點MBS等干旱脅迫響應元件、GARE-motif等赤霉素響應元件、AuxRR-core等生長素響應元件及AAAC-motif等多種光響應元件等(表3)。

2.3 LsSULTR3;3和LsSULTR3;5基因克隆和組織表達分析

以山黧豆25DAS成熟葉片的cDNA為模板，以LsSULTR3;3和LsSULTR3;5基因特異引物進行PCR擴增，分別獲得1 962 bp和1 923 bp的目的條帶(圖5)。經測序后和轉錄組數據比對表明，所獲序列為LsSULTR3;3和LsSULTR3;5基因的CDS序列。

利用半定量RT-PCR分析LsSULTR3;3和LsSULTR3;5基因在山黧豆不同組織中的表達，結果顯示，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5的組織表達水平存在明顯差異。LsSULTR3;3在主根、成熟葉、莖、花、S2時期種子和S6時期種子中表達，以在莖中的表達量較高；LsSULTR3;5在主根、側根、花、S2時期種子中均有表達，以花中的表達量最為顯著(圖6)。

3 討 論

擬南芥中的研究表明，AtSULTR3調控硫酸鹽向葉綠體的轉運，影響Cys和ABA的生物合成，并參與硫酸鹽介導的氣孔關閉[17]；AtSULTR3;5在根部的維管組織中高度表達，本身不具有硫酸鹽轉運功能，但是能夠顯著促進SULTR2;1的轉運效率[18]。在山黧豆中，至少有13條SULTR基因，分別編碼SULTR Ⅰ-Ⅳ。其中，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5可能與山黧豆活性物質-ODAP的生物合成密切相關。蛋白結構預測分析表明，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5具有SULTR蛋白家族保守結構域STAS和Sulfate_transp[13]。包含胞質跨膜結構域TMDs說明LsSULTR3;3和LsSULTR3;5可能參與硫酸鹽的跨膜轉運，進而進行硫的同化作用，調控Cys及β-ODAP含量。

蛋白水平、翻譯后修飾水平等調控是植物硫代謝、Cys及β-ODAP代謝調控的重要方式[19]。例如，硫代謝調控關鍵酶絲氨酸乙酰基轉移酶(serine acetyltransferase，SAT)和半胱氨酸合成酶[cysteine synthase，CS；或 O-acetylserine (thiol)lyase，OAS-TL]或其家族成員β-腈基丙氨酸合成酶(β-cyanoalanine synthase，CAS)可以通過形成半胱氨酸調控復合物(cysteine regulatory complex，CRC)調控二者酶活性[20-21]。而SAT的磷酸化會降低Cys對SAT酶活性的反饋抑制程度[21-22]。對SULTR而言，AtSULTR1;2 蛋白STAS結構域和CS的結合可以增加CS酶活性[23]。在山黧豆中，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5可能以同源二聚體方式發揮活性。磷酸化位點預測則表明，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5具有PKA、PKC等多個蛋白激酶磷酸化作用的潛在位點，可能通過磷酸化/去磷酸化調控硫酸鹽轉運活力。針對擬南芥SULTR保守結構域 STAS磷酸化位點的研究也證實了該結論[24-27]。

M.DNA 標準分子質量；1.LsSULTR3;3；2.LsSULTR3;5圖5 LsSULTR3;3和LsSULTR3;5基因的CDS序列克隆M.DNA marker；1.LsSULTR3;3；2.LsSULTR3;5Fig.5 Cloning of coding sequences of LsSULTR3;3 and LsSULTR3;5

1.主根；2.側根；3.幼葉；4.成熟葉；5.莖；6.花；7.莢；8.S2時期種子；9.S6時期種子；10.S8時期種子圖6 山黧豆不同組織中LsSULTR3;3和LsSULTR3;5的相對表達分析1. Main root; 2. Lateral root; 3. Young leaf; 4. Old leaf; 5. Stem; 6. Flower; 7. Pod; 8. Seed of S2 stage; 9. Seed of S6 stage; 10. Seed of S8 stageFig.6 Expression analysis of LsSULTR3;3 and LsSULTR3;5 in different tissues of L. sativus

硫的同化途徑還受到植物激素信號及轉錄因子等的調控。缺硫條件導致生長素、茉莉酸(jasmonic acid，JA)水平及其合成基因上調[28-29]，JA處理上調硫同化通路和GSH合成相關基因表達水平[30-31]，這表明了生長素信號、JA信號通路和硫同化通路的交互作用[28,32]。細胞分裂素也可以顯著下調SULTR1;2表達水平[33]。LsSULTR3;3和LsSULTR3;5基因啟動子含有激素響應等多個順式作用元件，這表明山黧豆硫同化途徑及β-ODAP可能受到多種激素的交互調控。此外，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5基因啟動子還具有轉錄因子MYB的結合位點MBS，說明轉錄因子MYB可能調控山黧豆硫同化途徑。實際上，MYB-like 轉錄因子PHR1(phosphate starvation response 1)可以調節N、P、S、Fe和Zn的平衡[34]；而N、P、S、Fe和Zn等均可以影響山黧豆β-ODAP含量[35]。因此，MYB可能在山黧豆β-ODAP含量調控中起到重要作用。

綜上所述，山黧豆至少含有13條SULTR基因，分別編碼SULTRⅠ-Ⅳ。其中，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5編碼蛋白具有SULTR蛋白家族保守結構域STAS和Sulfate_transp，其表達水平可能與山黧豆活性物質β-ODAP的生物合成密切相關。生物信息學預測顯示，LsSULTR3;3和LsSULTR3;5活性受到轉錄因子MYB和激素響應等多個順式作用元件的共同調節，蛋白水平互作及磷酸化等翻譯后修飾也在該過程起到重要作用。上述結果為進一步研究山黧豆中硫酸鹽的吸收、轉運及同化、β-ODAP的生物合成途徑等奠定了基礎。