不同方法提取馬氏珠母貝外套膜膠原蛋白理化性質比較

林海生，王 雯，秦小明，曹文紅，章超樺，高加龍，鄭惠娜，陳憶賓，伍 彬

不同方法提取馬氏珠母貝外套膜膠原蛋白理化性質比較

林海生1,2,3，王 雯1，秦小明1,2,3，曹文紅1,2,3，章超樺1,2,3，高加龍1,2,3，鄭惠娜1,2,3，陳憶賓4，伍 彬1,2,3

（1. 廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省水產品加工與安全重點實驗室 // 廣東普通高等學校水產品深加工重點實驗室 // 國家貝類加工技術研發分中心 (湛江) // 南海生物資源開發與利用協同創新中心，廣東 湛江 524088；3. 大連工業大學，海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，遼寧 大連 116034；4. 海南盛美諾生物技術有限公司，海南 澄邁 571925）

【目的】系統分析不同方法提取的馬氏珠母貝（）外套膜膠原蛋白的理化性質及生物學功能。【方法】分別采用酸-酶法和熱水法從外套膜中提取得到兩種膠原蛋白（A-PSC(Pm)和HSC(Pm)），對其氨基酸組成、微觀結構及熱變性溫度等理化特性進行比較分析。【結果】HSC(Pm)提取率高于A-PSC(Pm)；HSC(Pm)中，Gly、Glu與Arg相對含量較高，分別為20.16%、17.57%和10.07%；而A-PSC(Pm)中，Glu、Asp與Arg相對含量為19.67%、11.63%和10.07%；紫外光譜和紅外光譜分別顯示，兩種膠原蛋白均在220 nm左右有強吸收峰，且具有典型的膠原蛋白特征帶（酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶）；掃描電鏡結果顯示，A-PSC(Pm)呈致密多孔網狀結構，HSC(Pm)則基本為薄片狀；DSC分析結果表明，HSC(Pm)具有更好的熱穩定性?！窘Y論】酸-酶法及熱水法提取的膠原蛋白均具有類V型膠原蛋白特性，其結構特征及其理化性質均存在差異，可根據需求選擇特定的膠原蛋白提取方法用以開發不同類型的產品。

馬氏珠母貝；外套膜；膠原蛋白；理化性質；提取方法

膠原蛋白為細胞外基質的一種結構蛋白質，是動物細胞合成的一種高分子蛋白質。膠原單體的典型重復單位是（Gly-X-Y），其中X和Y通常為脯氨酸和羥脯氨酸[1]。到目前為止，至少有29種膠原蛋白被鑒定并命名（I-XXIX型）[2]。每一種類型的膠原蛋白的氨基酸序列、結構和功能都有顯著的差異[3]。因其能提供彈性、穩定性和支持組織[4]，膠原蛋白被廣泛應用到醫療器械、藥品、化妝品、日用化學品工業、功能性食品制造等多領域。現階段，由于哺乳動物源膠原蛋白受到口蹄疫（FMD）、牛海綿狀腦?。˙SE）、傳染性海綿狀腦病（TSE）等多種感染性疾病的威脅[5]，水產動物副產物逐漸成為哺乳動物源膠原蛋白的良好替代品。

目前，水生生物源膠原蛋白研究主要集中在魚類、蛙類、海洋無脊椎動物（軟體動物、海參、腔腸動物等）等，其氨基酸組成特性差異較大，且其酶解產物含生物活性多樣[6-9]。研究表明，雙殼貝的外套膜膠原蛋白含量較高[10]，本團隊前期研究證實，貝類外套膜酶解產物具有創傷修復等生物活性[11]。但目前系統研究貝類膠原蛋白的理化性質及生物學功能的文獻較少。

馬氏珠母貝（）是用于培養海水珍珠最重要的雙殼貝類之一，廣泛分布于我國南方各省，特別是海南、廣東、廣西等地[12]。珍珠貝經過采珠處理后，其貝殼、外套膜軟體組織等加工副產物通常未進一步加工利用而被丟棄，少量鮮銷食用或加工生產飼料，并沒有充分開發其潛在價值[13]。馬氏珠母貝外套膜作為插核形成珍珠囊的重要組織，富含膠原蛋白、糖類和礦物質等。為了提高珍珠貝外套膜的附加值，本研究選用外套膜組織為原料，采用兩種不同提取方法制備膠原蛋白，并對其理化性質進行表征和對比分析，以期為珍珠貝高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鮮活馬氏珠母貝，采樣來源于廣東省湛江市雷州流沙灣養殖場，低溫?；钷D運至實驗室，開殼，取其外套膜組織于-80 ℃下冷凍備用。

1.2 試劑與儀器

胃蛋白酶（豬胃黏膜）（高純，10 000 U?g-1），上海源葉生物科技有限公司；-羥脯氨酸標準品、對二甲氨基苯甲醛、冰乙酸、氯胺T、溴化鉀、氯化鈉等試劑均為國產分析純，西隴科學股份有限公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE配制試劑盒、BCA試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE電泳液、R-250考馬斯亮藍、BeyoColorTM彩色預染蛋白分子質量標準（6.5 ～ 270 ku），碧云天生物技術。

835-50氨基酸自動分析儀，日本日立公司； Spectrum 100傅里葉變換紅外光譜儀，Bruker公司；Pyris1 DSC-7全自動熱分析儀，美國 TA 沃特斯；DYY-8C電泳儀，北京六一生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白的提取

1.3.1.1 酸-酶法提取膠原蛋白 取解凍后的外套膜，用濃度為0.5 mol/L的乙酸溶液進行酸處理。料液質量（g）體積（mL）比為1∶20，并添加外套膜質量分數2%的豬胃蛋白酶[14]，磁力攪拌24 h，在8 000 r/min下離心取上清，緩慢加入氯化鈉并持續攪拌至氯化鈉終濃度為0.9 mol/L，靜置12 h（膠原蛋白鹽析），在8 000 r/min下離心15 min，取出沉淀，緩慢加入0.1 mol/L的乙酸溶液并持續攪拌直至沉淀完全溶解。透析12 h，每4 h換一次透析液，至透析液中性，得膠原蛋白提取液（上述操作均在４℃進行）[15]。將透析液冷凍干燥得到酸-酶溶性膠原蛋白[9]（acid-pepsin soluble collagen，A-PSC(Pm)）。

1.3.1.2 熱水浸提法提取膠原蛋白 按質量（g）體積（mL）比1∶40的料液比加入0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，去除雜蛋白，以質量（g）體積（mL）比1∶20的料液比加入相應體積的蒸餾水置于95 ℃恒溫水浴磁力攪拌4 h，過濾，取濾液冷凍干燥得到膠原蛋白（hot water soluble collagen，HSC(Pm)）[16]。

1.3.2 膠原蛋白提取率的測定 參照GB/T 9695.23-2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測定》。膠原蛋白提取率（%）的計算如下式：

膠原蛋白提取率 = 羥脯氨酸×11.1÷凍干粉質量。

1.3.3 膠原蛋白理化性質的測定

1.3.3.1 氨基酸組成測定 參照GB5009.124-2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》。

1.3.3.2 紫外全波長掃描分析 以0.1 mol/L乙酸溶液作空白對照，取適量樣品溶于0.1 mol/L 乙酸溶液中，配制成0.1 mg/mL的膠原蛋白溶液。在190 ～ 400 nm處以2 nm/s的速度對兩種膠原蛋白溶液進行掃描[17]。

1.3.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析 參照楊慧等[18]的方法并略作修改。溴化鉀使用前于120 ℃烘箱烘4 h以上，烘干后加入適量樣品于瑪瑙缽體中進行研磨，壓片。使用紅外光譜掃描測定4 000 ～ 400 cm-1樣品透過率，分辨率為4 cm-1。

1.3.3.4 掃描電子顯微鏡觀察 取適量樣品固定在導電膠上，噴金時間400 s，加速電壓10.00 kV，真空噴金處理后，采用60、100、200、500放大倍數的掃描電子顯微鏡觀察兩種膠原蛋白的微觀結構。

1.3.3.5 熱變性溫度測定 取適量樣品溶于0.5 mol/L乙酸溶液中，準確移取8 μL樣品溶液于鋁坩堝后密封，采用空的鋁坩堝作空白對照。掃描溫度范圍為30 ～ 100 ℃，升溫速率為3 ℃/min，樣品室氮氣流量20 mL/min[19]。

1.4 數據統計分析

實驗進行三個重復，結果使用Microsoft Excel 2010軟件數據分析，數據均以平均值±標準差表示，使用Origin軟件進行數據繪圖。

2 結果與分析

2.1 膠原蛋白提取率

不同提取方法得到的珍珠貝外套膜膠原蛋白提取率，分別為HSC(Pm)提取率約為42%，A-PSC(Pm)提取率約為22%。其中HSC(Pm)提取率顯著高于A-PSC(Pm)提取率（> 0.05）。這一結果相較其他研究仍較低[20]。HSC(Pm)經過堿處理，使膠原內部的纖維暴露，在高溫作用下，膠原的三股螺旋結構被破壞，從而分解成大分子膠原蛋白變性產物明膠[21]；A-PSC(Pm)通過酶處理，裂解端肽結構，提高膠原蛋白在酸條件下的溶解度，從而可以提高膠原蛋白的提取率[22]。

2.2 膠原蛋白的氨基酸組成

表1為兩種提取方法所得的珍珠貝外套膜膠原蛋白的氨基酸組成，兩者均具有膠原蛋白的特征性氨基酸，即甘氨酸、亞氨酸（脯氨酸、羥脯氨酸），說明兩種不同提取方法對所得膠原蛋白氨基酸組成并無顯著影響。兩種膠原蛋白中，蛋氨酸、組氨酸、蘇氨酸含量相對較低，而胱氨酸含量均未檢出。

氨基酸的組成比例決定了蛋白質的結構、性質和品質[23]。HSC(Pm)和A-PSC(Pm)的氨基酸相對含量差異較大，表明不同提取方法對膠原蛋白結構的影響程度不同。A-PSC(Pm)由于酶解失去端肽鏈，肽鏈共價交聯被切斷，導致其脯氨酸含量低于其他膠原蛋白[24]。因所處環境溫度較低，一般認為水產源膠原蛋白的亞氨酸含量較哺乳動物源的膠原蛋白低[25]。同時，酶解能夠有效降解酸提物中的雜蛋白，從而導致HSC(Pm)和A-PSC(Pm)間氨基酸相對含量的差異，其中A-PSC(Pm)亞氨酸含量低于HSC(Pm)。HSC(Pm)甘氨酸質量分數約為20%，A-PSC(Pm)甘氨酸含量較低，占比約為10%，低于一般哺乳動物膠原蛋白中甘氨酸的含量[26]，遠低于紅唇魚和黃花魚（and）鱗片[27]、羅非魚（）皮[28]、與蝦夷扇貝（）[29]中含量相似，推測不同來源的動物物種對膠原氨基酸組成含量有一定的影響。此外還發現，兩種膠原蛋白都含有較多的酸性氨基酸（Glu和Asp），同Xia等[30]、馬婷等[10]研究結果相似，推測所得兩種膠原蛋白均為類V型膠原蛋白。谷氨酸在促進紅細胞形成方面具有一定的影響作用，Glu和Asp因在自由基鏈式反應中能夠清除過量的自由基因而具有一定的抗氧化作用[31]。

表1 不同方法提取的膠原蛋白氨基酸組成

注：“-”表示未檢出；“0.00”是其含量低于檢出限；“#”表示呈味氨基酸；“*”表示必需氨基酸；“&”表示亞氨基酸。1) 表示以100 g原料為基，2）表示以所有氨基酸為基。

Note: “-” means no detected; “0.00” indicated that the contents were below the detection limit; “#” represents flavor amino acid; “*” denotes essential amino acid; “&” stands for sub-amino acid. 1) represents based on 100 g raw materials; 2）denotes based on all amino acids.

2.3 膠原蛋白的紫外掃描光譜分析

通過紫外掃描光譜結果發現，HSC(Pm)和A-PSC(Pm)的特征吸收峰相差不明顯，均在220 nm附近有最大特征吸收（圖1），這與膠原蛋白中富含的羥脯氨酸和脯氨酸有關，由-C==O基團中n→π*躍遷導致[16]，證明外套膜膠原蛋白的三級螺旋結構未被破壞。這一結果與海蜇（）[32]、太平洋鱈（Tilesius）魚皮[33]、尼羅羅非魚（）皮[34]相似。此外，兩種膠原蛋白中均含有少量的芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）（表1），其R基團含有的苯環共軛雙鍵系統使其在280 nm處出現弱吸收峰。

圖1 馬氏珠母貝外套膜膠原蛋白紫外吸收光譜

2.4 膠原蛋白的紅外吸收光譜分析

兩種不同提取方法得到的外套膜膠原蛋白紅外吸收光譜如圖2所示，兩種膠原蛋白均具有膠原蛋白紅外光譜的特征吸收峰，包括酰胺A、B、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ帶，這與馬面鲀（）魚皮[35]、養殖花鰻鱺（）魚皮[36]、鰈（）魚皮[15]研究較為一致。

從表2兩種膠原蛋白的主要吸收峰的位置及特征基團可以看出，HSC(Pm)和A-PSC(Pm)的酰胺A帶的最大吸收峰分別是3 320 cm-1和3 296 cm-1。酰胺A帶產生的吸收峰通常在3 400 ～ 3 440 cm-1，但當N—H參與氫鍵的形成時，其伸縮振動便會向低頻率移動[37]，證明A-PSC(Pm)形成了較多氫鍵。由于蛋白質分子的亞甲基基團發生不對稱伸縮振動，兩種膠原的酰胺B帶均在2 930 cm-1附近[38]。HSC(Pm)和A-PSC(Pm)的酰胺Ⅰ帶在1 653 cm-1附近，這主要由于?C==O基團的伸縮振動。HSC(Pm) 和A-PSC(Pm)的酰胺III帶均出現在1 241 cm-1，酰胺Ⅰ帶與酰胺Ⅲ帶的存在可以說明，膠原蛋白的三螺旋結構均保持完整[39]。

2.5 膠原蛋白的表面形貌結構分析

將A-PSC(Pm)和HSC(Pm)分別在放大60、100、200和500倍的掃描電鏡下進行觀察，結果顯示，兩種膠原蛋白的微觀均存在顯著差異，但都保留較為完整的纖維結構（圖3）。

圖2 外套膜膠原蛋白紅外光譜

表2 馬氏朱母貝外套膜膠原蛋白的紅外光譜特征峰值及位置特征基團

(A) A-PSC(Pm)；(B) HSC(Pm)

A-PSC(Pm)呈現出不規則褶皺堆積且呈現致密網狀結構，膠原蛋白的薄片部分斷裂，說明在胃蛋白酶的作用下，膠原結構發生改變，膠原蛋白間的雜質蛋白被水解，交聯片段明顯被切碎[40]，結合其疏松多孔的特性，后續可通過測量其孔徑大小、物質空隙率等來探究A-PSC(Pm)在保濕及膠原蛋白海綿方面的應用[41]。

HSC(Pm)基本形成薄片狀結構，說明熱水處理能夠破壞膠原的三股螺旋結構使其變性，同時還存在分子間與分子內的交聯，使得HSC(Pm)纖維結構更加穩定有序，熱穩定性顯著提高，推測其具有較優的成膜性能，后續可進一步研究其熱變性溫度的偏移程度來判斷膠原蛋白的交聯程度[42]。

2.6 膠原蛋白的熱變性溫度分析

由圖4可知，A-PSC(Pm)和HSC(Pm)的熱變性溫度分別為91 ℃和93 ℃，兩種膠原蛋白的熱變性溫度差異不大，高于如鰱（）魚皮熱水提膠原蛋白[43]（43.8 ℃）、鯛（）酸溶性膠原蛋白[44]（82.1 ℃）等其他水產源膠原蛋白。

蛋白質的熱變性溫度與亞氨基酸的含量有關，亞氨基酸中的羧基通過形成氫鍵來維持蛋白的三螺旋結構穩定，亞氨基酸含量尤其是羥脯氨酸的含量越高，膠原蛋白的熱變性溫度也越高[45]。結合表1氨基酸組成結果中HSC(Pm)的羥脯氨酸含量較高，所以HSC(Pm)熱變性溫度高于A-PSC(Pm)。

圖4 外套膜膠原蛋白的熱變性溫度

3 結論

酸-酶法及熱水法從馬氏珠母貝外套膜提取的膠原蛋白均具有類V型膠原蛋白特性，胃蛋白酶處理未破壞膠原蛋白的三股螺旋結構。HSC(Pm)熱穩定性較高；A-PSC(Pm)具有疏松多孔的特性，其必需氨基酸占氨基酸總量的比例較HSC(Pm)高，提示A-PSC(Pm)營養價值較高。綜上，兩種方法提取的膠原蛋白結構特征及其理化性質均有較大差異，可在實際生產中根據需求選擇特定的提取方法用以開發不同類型的產品。

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Characterization of Collagens from Mantle ofby Different Extraction Methods

LIN Hai-sheng1,2,3, WANG Wen1, QIN Xiao-ming1,2,3, CAO Wen-hong1,2,3, ZHANG Chao-hua1,2,3, GAO Jia-long1,2,3, ZHENG Hui-na1,2,3, CHEN Yi-bin4, WU Bin1,2,3

（1.,,524088,; 2.////()//,524088,; 3.,116034,;4.,,571925,）

【Objective】Collagen were extracted from the mantle ofby different methods and their physical and chemical properties were analyzed, with aims to provide theoretical basis for the subsequent development of collagen products.【Methods】Collagens were extracted by acid-pepsic extraction and hot-water extraction, named acid-pepsin soluble collagen (A-PSC(Pm)) and hot water soluble collagen (HSC(Pm)). The amino acid composition, microstructure, secondary structure and thermal denature-temperature of both collagens were comparatively analyzed.【Results】The collagen extraction rate by hot water method was higher than that by acid-pepsic method. The contents of Gly, Glu and Arg in HSC(Pm) were the highest, which were 20.16%, 17.57% and 10.07%, respectively. The contents of Glu, Asp and Arg were about 19.67%, 11.63% and 10.07% respectively in A-PSC(Pm). UV and IR spectrums showed that HSC(Pm) and A-PSC(Pm) had strong absorption peak at 220 nm, and had typical characteristic bands of collagen (amide A, B, Ⅰ, Ⅱ and Ⅲ). The results of scanning electron microscopy(SEM) showed that A-PSC(Pm) was presented as dense porous network structure, while HSC(Pm) was basically in laminar. DSC analysis results show that HSC(Pm) has better thermal stability.【Conclusion】These results indicated that both HSC(Pm) and A-PSC(Pm) had V-like collagen properties, and there were differences in both structural characteristics and physicochemical properties. In conclusion, different collagen products could be developed according to pearl oyster collagen extraction methods.

; mantle; collagen; physicochemical properties; extraction method

TS 254.9

A

1673-9159（2022）01-0106-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.01.014

林海生，王雯，秦小明，等. 不同方法提取馬氏珠母貝外套膜膠原蛋白理化性質比較[J]. 廣東海洋大學學報，2022，42（1）：106-112.

2021-10-23

廣東海洋大學博士啟動項目（R17082）；2021年度省科技專項資金（“大專項+任務清單”）項目（2021A201-11）；財政部和農業農村部：國家現代農業產業技術體系資助（CARS-49）；廣東省現代農業產業技術體系創新團隊項目（2021 KJ146）；廣東海洋大學貝類高值化加工利用創新團隊（CXTD2021004）；廣東海洋大學創新強校專項項目（Q18292）；湛江市科技計劃項目（2014C01019）

林海生（1985―），男，博士，講師，研究方向為水產品精深加工。E-mail:haishenglin@163.com

伍彬（1984―），男，碩士，高級實驗師，研究方向為水產品精深加工。E-mail: wubin23air@126.com

（責任編輯：劉朏）