玉米沙棘復合酵素釀造工藝的研究

張莉莉， 張 軍，馬 驍，張 哲，王明潔，梁文衛，高 揚

（1.黑龍江省農業科學院鄉村振興科技研究所，黑龍江 哈爾濱 150086；2.黑龍江省農業科學院 食品加工研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

0 引言

隨著現代各種不良生活習慣、生活工作壓力的加大及年齡的增長，人體的酵素會慢慢減少，人體合成及細菌分泌的酵素只是一少部分，根本滿足不了人體的需要。因此，必須從膳食中攝取更多酵素，而食物經過高溫或加工，又使食物中的酵素遭到破壞[1-4]。近年來，隨著人們健康意識的逐漸增強，酵素將成為人們生活中必不可少的新一代健康食品。為進一步加大農產品加工轉化程度，不斷推出新的水果、大糧加工產品，同時也使酵素食品更符合現代人對營養需要的多樣性、平衡性和易于吸收性而研制開發玉米沙棘復合酵素產品是必要的[5-8]。制作便捷菜單式玉米復合酵素產品，縮短培養周期，提高發酵速率，在最短時間內做出高效的復合酵素產品來[9-10]。

1 材料與方法

1.1 材料

脫脂玉米粉、白砂糖、蜂蜜、食鹽，市售；沙棘果，本所資源室提供；酵母菌、雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌，北京川秀科技有限公司提供；安琪牌葡萄酒專用高活性干酵母、安琪果蔬酵素發酵劑，安琪酵母股份有限公司提供；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），中科院微生物研究所提供；白砂糖，黑龍江北方糖業股份有限公司提供；SOD酶活力檢測試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸（均為分析純），天津市大茂化學試劑廠提供；干酪素（分析純），天津市化學試劑供銷公司提供；L-酪氨酸（分析純），北京奧博星生物技術有限責任公司提供；福林酚試劑、酚酞（均為分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供。

1.2 儀器設備與檢測項目

30L型發酵罐，江蘇科海生物工程設備有限公司產品；DRH-A100型電熱恒溫培養箱，上海仙象儀器儀表有限公司產品；HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司產品；KJM-180型不銹鋼分體式膠體磨，北京錕捷玉誠機械設備有限公司產品；微波殺菌機，山東立威微波設備有限公司產品；WS108型手持糖度計，上海測維光電技術有限公司產品；EX324型電子分析天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司產品；TD5Z型低速平衡離心機，金壇市城西春蘭試驗儀器廠產品；UV-1100型紫外可見分光光度計，上海凌析達儀器有限公司產品；HR7633型打漿機，飛利浦家庭電器（珠海）有限公司產品；MLS-3780型高壓蒸汽滅菌鍋，杭州亞旭生物科技有限公司產品。

總酸的測定：參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[11]；可溶性固形物含量的測定：采用折光計法；蛋白酶活力測定：參照GB/T 28715—2012《蛋白酶活力測定法》，采用福林酚法測定蛋白酶活力[12]；SOD酶活力的測定：酵素液離心取上清液，根據SOD酶試劑盒說明書進行酶活力的測定[13]；數據標準化法：采用公式（1）進行數據的標準化處理[14]。

式中：Y——標準化值；

y——指標值；

ymin——指標最小值；

ymax——指標最大值；

綜合評分法：將各指標進行權重分析，給出各指標的權重系數，并將各指標的標準化值與對應的權重系數相乘后，再進行相加作為綜合分數[14]，計算公式（2）如下：

式中：Yi——綜合分數；

Bj——權重系數；

Yij——指標標準化值；

i——第i號試驗；

j——第j個指標。

1.3 技術路線

技術路線（工藝、流程）：脫脂玉米粉+沙棘果酶解液→滅菌→復合菌發酵→分離澄清→灌裝→包裝→成品。

1.4 操作要點

（1）原料選擇與處理。脫脂玉米粉1.0~1.5 kg，加入2倍的0.2%亞硫酸凈水溶液于48~50℃下浸泡40~42 h，淋干后備用。選取沙棘果各5~6 kg，挑選、除梗、清洗、淋干（或破碎）酶解后得酶解液滅菌，備用[15]。

（2）調糖。沙棘酶解液直接添加白砂糖調整糖度，用手持糖度儀測定糖度，調整糖度15%~20%。

（3）菌種活化。干酵母加入20倍蒸餾水及5%白砂糖溶解，30~35℃恒溫水浴鍋中活化30 min，備用；植物乳桿菌活化：將斜面保藏的植物乳桿菌在MRS肉湯培養基中活化，2次繼代培養后，于37℃條件下靜置培養48 h，備用。

（4）殺菌。采用巴氏殺菌的方式對原料進行殺菌，85℃殺菌25 min后冷卻至室溫。

（5）接種。處理后的原料，按試驗要求的比例接入活化后的植物乳桿菌和酵母菌。

（6）發酵。處理后原料按1∶1的比例加入發酵罐內，同時加入活化的菌種及1%食鹽、0.15%亞硫酸，于28~32℃溫度下密封發酵7~30 d，檢測沒有氣體產生，pH值為2~4，即判斷發酵結束，經分離、過濾得到酵素原液。發酵結束后測定蛋白酶活力與SOD酶活力。

（7）調整后熟。如果酸度過高，加入降酸酵母；如糖度過低可用白砂糖、木糖醇調整；如風味欠佳可加入植物香料。調整后的原液于25℃條件下進行后熟，經過30~35 d即可。

（8）調配。經過后熟的原液加入4%~8%白砂糖、0.8%~1.2%蜂蜜，調配后過濾。

（9）灌裝。在無菌條件下灌裝，包裝即為成品。

1.5 試驗方法

1.5.1 發酵溫度

為確定復合菌在玉米沙棘發酵液中的最佳發酵溫度，在保證發酵液充分溶氧的條件下，復合菌接種量為0.2%，分別控制發酵溫度為21，23，25，27，29℃，然后進行復合菌發酵，發酵時間為15 d，發酵結束后測定發酵液中超氧化物歧化酶（SOD）活力和蛋白酶活性，確定最佳的酵母菌發酵溫度。

1.5.2 起始pH值

試驗所用的復合菌種適宜在酸性環境下生長。為確定復合菌在玉米沙棘發酵液中的最佳發酵溫度，保證發酵液充分溶氧，控制發酵溫度為25℃，酵母菌接種量為0.2%，用CaCO3調節發酵液酸度，分別調節pH值在4.0，4.5，5.0，5.5，6.0條件下進行發酵，發酵時間為15 d。發酵結束后測定發酵液中超氧化物歧化酶（SOD）活力和蛋白酶活性，確定最適的發酵起始pH值。

1.5.3 接種量的確定

對玉米沙棘果發酵液來說，復合菌接種量不同，發酵液發酵的快慢就不同，進而影響發酵產物的品質和質量。為確定復合菌在玉米沙棘發酵液中的最佳發酵溫度，保證發酵液充分溶氧，控制發酵溫度為25℃，pH值設定為5.0，分別接種0.10%，0.15%，0.20%，0.25%，0.30%復合菌進行發酵，發酵時間為15 d。發酵結束后測定發酵液中超氧化物歧化酶（SOD）活力和蛋白酶活性，確定最佳的復合菌接種量。

1.5.4 發酵時間的確定

為確定復合菌在玉米沙棘發酵液中的最佳發酵時間，保證發酵液充分溶氧，控制發酵溫度為25℃，復合菌接種量為0.25%，pH值為4.0，發酵時間分別設置為6，9，12，15，18 d，發酵結束后測定沙棘果渣發酵液中超氧化物歧化酶（SOD）活力和蛋白酶活性，以確定最佳的酵母菌發酵時間。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 發酵溫度的確定

發酵溫度對SOD活力和蛋白酶活性的影響見圖1。

圖1 發酵溫度對SOD活力和蛋白酶活性的影響

發酵溫度25℃時，發酵15 d后測得SOD活力高達153 U/mL，蛋白酶活性48.21 U/mL。這與酵母菌本身適宜生長的溫度有關。

2.1.2 起始pH值的確定

起始pH值對SOD活力和蛋白酶活性的影響見圖2。

圖2 起始pH值對SOD活力和蛋白酶活性的影響

玉米沙棘發酵液起始pH值5.0時效果最佳，復合菌在pH值5.0時生長狀態最佳，在此條件下SOD活力高達133 U/mL，蛋白酶活性40.32 U/mL。

2.1.3 接種量的確定

復合菌接種量對SOD活力和蛋白酶活性的影響見圖3。

圖3 發酵時間對SOD活力和蛋白酶活性的影響

圖3 復合菌接種量對SOD活力和蛋白酶活性的影響

復合菌接種量為0.25%時，發酵15 d后測得SOD活力高達183 U/mL，蛋白酶活性44.20 U/mL。

2.1.4 發酵時間的確定

發酵時間對SOD活力和蛋白酶活性的影響見圖4。

沙棘果渣發酵液在發酵15 d結束時，SOD活力高達209 U/mL，蛋白酶活性45.35 U/mL。第16天開始，酶活性逐漸降低，可能是由于發酵初期糖源供應充足，酵母菌好氧發酵需要糖源源不斷地供應，隨著發酵時間的延長發酵液中的糖源被消耗，發酵末期糖源供應不足，發酵活力降低，影響了酶活力。

2.2 響應面法優化發酵工藝試驗

正交試驗因素與水平設計見表1，Box-behnken試驗方案及試驗結果見表2。

表1 正交試驗因素與水平設計

根據表2的試驗結果，將蛋白酶活性和SOD活力的數據進行標準化處理，再給出各指標的權重系數，蛋白酶活性的權重系數為0.4，SOD活力的權重系數為0.6。得出相應的綜合分數Y，并作為總指標進行試驗結果分析。

表2 Box-behnken試驗方案及試驗結果

回歸模型方差分析結果見表3。

表3 回歸模型方差分析結果

由表3中F值大小可知，各因素對綜合分的影響程度的主次關系為X4＞X3＞X2＞X1，即接種量＞發酵時間＞pH值＞發酵溫度。由于各因素與綜合分之間的影響并不是簡單的線性關系，為了更明確各因素與綜合分Y的關系，通過SAS9.1軟件進行數據分析，建立二次響應曲面回歸模型為：

典型分析見表4。

表4 典型分析

對響應面試驗結果進行回歸與方差分析，由表4可知，失擬項不顯著，回歸項顯著；且該模型R2=95.76%，R2Adj=90.82%，說明試驗設計所獲得的數學回歸方程與試驗結果能夠較好地進行擬合，自變量與響應值之間線性關系較為顯著。各因素對綜合分的影響程度的主次關系為X4＞X3＞X2＞X1，即接種量＞發酵時間＞pH值＞發酵溫度。

由表4可知，4個因素的特征值都為負，表明有極值。由SAS9.1軟件分析，得出各因素最優的水平組合為X1=0.083 85，X2=0.183 92，X3=0.151 83，X4=0.577 92，考慮到實際工藝過程的操作情況，對各因素的最優水平進行修正，即X1=0，X2=0，X3=0，X4=0.5，修正后的優化工藝條件為發酵溫度25℃，pH值5.0，發酵時間15 d，接種量0.275%。

3 結論

通過單因素試驗初步確定玉米沙棘復合酵素的發酵工藝條件，在此基礎上以蛋白酶活性和SOD酶活性為主要指標，將蛋白酶活性和SOD酶活性的數據進行標準化處理，再給出各指標的權重系數，在權重系數的分配上，蛋白酶活性權重系數為0.4，SOD活力的權重系數為0.6。采用響應曲面法中的Box-behnken模式，得出各因素對綜合分的影響程度的主次關系為X4＞X3＞X2＞X1，即接種量＞發酵時間＞pH值＞發酵溫度，通過二次回歸設計優化玉米沙棘復合酵素發酵工藝的最佳條件為發酵溫度25℃，pH值5.0，發酵時間15 d，接種量0.275%。