黑花生中黃酮和多糖類物質的提取方法研究

江 丹，余 策，陳 陽，陳志元，孫代華，張繼斌，丁 苗

（勁牌持正堂藥業有限公司，湖北省中藥配方顆粒工程技術研究中心，中藥保健食品質量與安全湖北省重點實驗室，湖北 黃石 435100）

花生是我國主要的油料作物，營養價值比糧食高，含有大量蛋白質和脂肪，有“長生果”之稱，作為重要創匯農產品和具有很強國際競爭力的大型農產品[1]，近年來，在國內市場和世界貿易中的地位及影響力一直處于上升狀態[2]。我國花生產量及出口量從2000年以來一直穩居前列[3]。花生在農產品經濟和貿易中的地位十分重要[4-6]。黑花生也稱富硒黑花生，作為具有推廣前景的優良品種，具備高蛋白、高精氨酸、高硒、高鉀含量的優良特性[7]。黑花生富含黃酮、二氫黃酮、多糖等多種有效成分，具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、降血壓、降血脂、降血糖等多種功能[8-9]。國內外對黑花生的黃酮和多糖類的提取方法研究較少，試驗以總黃酮和總多糖為目標，研究黑花生的提取方法，為進一步開發和利用黑花生資源提供理論基礎和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑花生，購自湖北大冶靈鄉；蘆丁標準品、D-無水葡萄糖標準品，中國食品藥品檢定研究院提供；95%乙醇（食品級）；超純水，公司超純水系統提供；甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、濃硫酸、重蒸苯酚，均為分析純。

AB135-S型電子天平，梅特勒-托利多公司產品；FA2004型電子天平，上海精密科學儀器有限公司產品；TU-1901型紫外可見分光光度計，北京普析通用有限公司產品；SFG-02.500型電熱恒溫鼓風干燥箱，黃石市恒豐醫療器械有限公司產品；DZKW-D-1型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器有限公司產品；SK8200LHC型超聲提取器，上海科導超聲儀器有限公司產品。

1.2 黑花生總黃酮和總多糖的提取

稱取20 g黑花生，加入料液比為1∶10（g∶mL）的60%乙醇，于90℃下加熱回流提取2次，2 h/次，提取結束后，用濾紙過濾，收集并合并2次提取液，測量體積，分別測定總黃酮和總多糖的含量，計算黑花生總黃酮和總多糖提取量。

1.3 單因素試驗設計

選擇影響黑花生提取工藝的5個主要因素即提取溶劑、料液比、提取溫度、提取時間和提取次數進行單因素試驗設計，各因素設計3個水平以上不等。

試驗因素與水平設計見表1。

表1 試驗因素與水平設計

1.4 正交試驗設計

在單因素試驗基礎上，分別選取提取溶劑、料液比、提取溫度和提取時間，進一步研究4個因素對提取量的影響，優化提取工藝，每個因素選取4個水平，采用L16（44）進行正交試驗。

1.5 總黃酮和總多糖含量測定

總黃酮含量的測定參照Gogna的比色法[10]，總多糖含量的測定參考苯酚-硫酸比色法[11]。

2 結果與分析

2.1 總黃酮和總多糖單因素試驗

2.1.1 提取溶劑對總黃酮和總多糖提取量的影響

提取溶劑對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響見圖1。

由圖1可知，總黃酮和總多糖的提取量均隨著乙醇體積分數的增大而呈現出先后減少的趨勢，總黃酮的提取率在40%乙醇中提取量達到最大值7.75 mg/g，而總多糖的提取率在20%乙醇中提取量達到最大值71.13 mg/g。故選擇乙醇體積分數20%，30%，40%進行正交設計試驗。

圖1 提取溶劑對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

2.1.2 料液比對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

料液比對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響見圖2。

圖2 料液比對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

由圖2可知，隨著料液比增加，黑花生總黃酮和總多糖提取量呈上升趨勢，但不是無限增加，當料液比大于1∶20時，總黃酮和總多糖提取量的增長趨勢變緩，這可能是因為料液比過低，不利于總黃酮和總多糖的提取，過高將會達到飽和，考慮總黃酮和總多糖提取后續工序中需要進行濃縮，為減少生產成本故選擇料液比為1∶10，1∶15，1∶20（g∶mL）進行正交設計試驗。

2.1.3 提取溫度對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

提取溫度對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響見圖3。

圖3 提取溫度對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

由圖3可知，隨著提取溫度的逐漸升高，黑花生總黃酮和總多糖的提取量呈現先增后減的趨勢，總黃酮在提取溫度為70℃的時候，提取量達到最大值7.41 mg/g；與總黃酮不同，總多糖的提取量在80℃時達到最大值40.80 mg/g，綜合考慮選擇提取溫度為70，80，90℃進行正交設計試驗。

2.1.4 提取時間對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

提取時間對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響見圖4。

由圖4可知，提取量在1.5 h時達到最大值，延長浸提時間，提取量緩慢下降，3.0 h時總多糖提取量增加，可能浸提更充分。考慮生產成本和提取效率，選擇1.0，1.5，2.0 h進行正交設計試驗。

圖4 提取時間對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

2.1.5 提取次數對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

提取次數對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響見圖5。

由圖5可知，提取1次即可將大部分黃酮提取出來，總多糖需要提取2次才可基本提取完全，綜合考慮選擇提取2次。

圖5 提取次數對黑花生總黃酮和總多糖提取量的影響

2.2 正交試驗結果

2.2.1 正交試驗模型與顯著性檢驗

正交試驗總黃酮和總多糖含量分析見表2。

由表2可知，影響提取總黃酮含量的因素依次為提取溫度＞提取次數＞料液比＞提取溶劑＞提取時間；影響總多糖因素依次為料液比＞提取溶劑＞提取次數＞提取溫度＞提取時間。提取黑花生總黃酮最佳條件為料液比1∶20（g∶mL），50%乙醇90℃下提取2次，1.0 h/次；提取黑花生總多糖最佳條件為料液比1∶15（g∶mL），20%乙醇80℃下提取2次，2.0 h/次。

2.2.2 設計驗證

為了檢驗正交設計試驗的可行性，在黑花生總黃酮和總多糖最佳提取條件下進行驗證，制備的黑花生提取物中總黃酮含量為88.3 mg/g，總多糖含量為667.2 mg/g。在此條件下檢測預測結果的可靠性，重復3次提取黑花生總黃酮和總多糖，制備的黑花生提取物2種有效成分含量分別為87.8±0.3 mg/g和667.7%±0.5 mg/g，與預測值很接近，說明該模型反映出的提取條件可靠，此優化方法可行。

3 結論

在單因素試驗基礎上，利用正交試驗設計黑花生總黃酮和總多糖提取參數，確定最佳提取條件，總黃酮料液比1∶20（g∶mL），50%乙醇90℃下提取2次，1.0 h/次；總多糖料液比1∶15（g∶mL），20%乙醇80℃下提取2次，2.0 h/次。根據效應曲線圖結果及驗證結果表明，按照最佳條件制備的黑花生提取物中總黃酮含量為88.3 mg/g，總多糖含量為667.2 mg/g，為進一步研究黑花生總黃酮和總多糖提供參考依據。