易通過冷凍食品傳播的新冠病毒解旋酶的表達純化及酶活研究

李海紅，鄭亞婷，高 博，韓曉睿，何怡寧， 侯錫苗

（西北農林科技大學生命科學學院生物化學與分子生物學教研室，陜西 楊凌 712100）

2019年12月下旬爆發的新型冠狀病毒（SARSCoV-2）導致了冠狀病毒疾病COVID-19，SARSCoV-2被世界衛生組織報道成為全球范圍內的大爆發，它的持續爆發已經給世界各地的人類生命和經濟造成了巨大損失。隨著近期全國多地的海關部門在冷凍食品中發現新冠病毒，此前武漢、北京、大連等多地的農貿及海鮮市場都曾檢測到新冠病毒，這表明新冠病毒對人類食品安全產生重大的威脅。

冠狀病毒屬（Coronavirus）在系統分類上屬于套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）[1]。冠狀病毒屬的基因組為線性單股正鏈RNA，基因組全長26-31kb，是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒[2]，其基因組編碼16種非結構蛋白，命名為Nsp1-Nsp16[3]，其中RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）、RNA解旋酶（Nsp13）及復制輔助因子（Nsp7、Nsp8）組裝成高效的RNA合成機器，該RNA復制體是病毒存活的核心部件，對病毒復制至關重要[4]。

由于Nsp13在所有冠狀病毒物種中的高度保守性，被作為理想的抗病毒靶點[5-7]。有研究表明，SARS-CoV的Nsp13，具有NTP水解活性[8]，可以水解所有類型的NTP，以NTP依賴的方式解開雙鏈DNA和RNA，解旋的極性是5'-3'[9]。盡管是RNA解旋酶，但是Nsp13大約以相同的速率解旋RNA和DNA底物[10]。與其他解旋酶相比，Nsp13解旋酶的解旋效率較低，但可能通過不同的機制增強，如通過協同作用或者與病毒的RdRp相互作用[11-12]，除解旋酶活性外，Nsp13被認為還具有RNA-5'-三磷酸酶活性，該活性可能在mRNA加帽中發揮作用。有研究表明，SARS-CoV-2的Nsp13解旋酶具有解旋DNA、RNA雙鏈的作用[9]。

研究表達并純化了高純度的SARS-CoV-2-Nsp13蛋白，對其與RNA和DNA底物的結合及解旋雙鏈DNA的能力進行了探究，研究結果可為理解SARSCoV-2的復制機理提供參考和支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

質粒與菌株pET21a-HMT表達載體和大腸桿菌菌株2984、BL21（DE3），均為實驗室保存。

1.1.2 試劑及儀器

Buffer A：25 mmol/L Tris-HCl溶液pH值8.0，500 mmol/L NaCl，5mmol/L咪唑；新冠病毒（SARSCoV-2）Nsp13蛋 白 編 碼 序 列（SARS-CoV-2-Nsp13），Bio Matik公司提供；限制性內切酶EcoRI和XhoI，Takara公司提供；Ni-NTA Resin，QIAGEN公司提供；Heparin柱，GE Healthcare公司提供。

高壓破碎儀，JNBIO公司產品；AKTA purifier型蛋白純化儀，GE Healthcare公司產品。

1.1.3 DNA底物

寡聚核酸鏈，生工生物工程（上海）股份有限公司提供。結合試驗及解旋試驗的底物標記有熒光素（Fluorescein，F）。底物的退火方式為寡聚核酸鏈按照摩爾比為1∶1的比例混合，95℃下加熱5 min，然后緩慢降至室溫。

結合及解旋試驗中所用的DNA底物見表1。

1.2 試驗方法

1.2.1 載體構建及蛋白質的表達與純化

產物經EcoR I和Xho I酶切后，連入pET-21a-HMT載體中，重組質粒經酶切鑒定及測序確認無誤后，轉入BL21（DE3）表達菌株進行蛋白質表達。37℃下培養至菌液吸光度A600約為0.6 h，加入終濃度為0.3 mmol/L的IPTG（Merck），18℃下誘導16 h，收集菌體。用緩沖液懸浮菌體，并用高壓細胞破碎儀破碎菌體。高速離心收集上清后，先利用Amylose親和層析柱進行初步純化，使用Elute Buffer（25 mmol/L Tris-HCl pH值8.0，200 mmol/L NaCl，5% Glycerol，0.5% Maltose）洗脫后，蛋白洗脫液稀釋降鹽后再利用Heparin Sepharose Fast Flow親和層析柱進一步純化。純化產物通過10% SDS-PAGE檢測純度，合并較純組分并使用30 kD的Millipore超濾管離心濃縮，分裝后立即用液氮速凍，保存于-80℃下備用。

1.2.2 SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶的DNA、RNA結合活性測定

利用熒光偏振原理，測定SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶與單熒光標記底物發生結合反應時的熒光各向異性的變化。反應體系150μL，其中熒光標記的DNA濃度為5 nmol/L，SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶的濃度依次增加，緩沖液成分為25 mmol/L Tris pH值8.0，50 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT，置于96孔黑色微孔板中，37℃孵育5 min后，使反應體系達到平衡狀態，之后利用Infinite F200Pro型多功能酶標儀（TECAN）測定每一個反應體系的熒光各向異性值。所有試驗均重復3次。用公式（1）對數據進行擬合，計算平衡解離常數。

式中：Δrmax——測得的最高各向異性值（Δrmax=rmax,complex-rfree,DNA）；

Δr——測得的熒光各向異性值；

Kd——平衡解離常數；

P——蛋白質的濃度，mmol/L；

n——希爾系數。

1.2.3 利用Electrophoretic Mobility Shift Assay（EMSA）方法測定SARS-CoV-2-Nsp13解旋dsDNA

將3 nmol SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶和40 pmol熒光標記的退火后雙鏈DNA底物5'OhS14D12加入到25 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0），50 mmol/L Na-Cl，10 mmol/L MgCl2，2 mmol/L DTT中，反應體系10μL，37℃孵育30 min，反應被5×loading buffer終止（100 mmol/L Tris-HCl，1% SDS，50% Glycerol，and Bromophenol blue（pH值7.5）），待反應結束后，以上混合物進行10% Native-PAGE電泳后，并使用ChemiDoc MP拍照分析試驗結果（BIO-RAD，USA）。

2 結果與分析

2.1 SARS-CoV-2-Nsp13表達載體的構建

重組pET21a-HMT-Nsp13的質粒圖譜及EcoRI、XhoI雙酶切檢測見圖1。

圖1 重組pET21a-HMT-Nsp13的質粒圖譜及EcoRI、XhoI雙酶切檢測

基因片段的前端依次連接有6×His標簽和Maltose-binding protein（MBP）促溶標簽。重組載體經EcoRI、XhoI雙酶切后出現了目的蛋白片段（約1.9 kb）（見圖1（b）），并通過測序確認無誤。

2.2 重組SARS-CoV-2-Nsp13的表達與純化

將鑒定正確的重組載體轉化到E.coli BL21(DE3)中，18℃下誘導表達16 h，目的蛋白在破菌后的上清中有比較明顯的表達。經Ni-NTA親和層析純化可獲得大量目的蛋白。

SARS-CoV-2-Nsp13蛋白的表達純化見圖2。

（圖2（a）泳道5-7）；再利用Heparin柱梯度洗脫得到較純的SARS-CoV-2-Nsp13蛋白（圖2（b）泳道1-7）；最終濃縮得到SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶（圖2（c）），大小約107 kD，與理論值相符。

圖2 SARS-CoV-2-Nsp13蛋白的表達純化

2.3 SARS-CoV-2-Nsp13的結合活力測定

利用熒光偏振原理，檢測SARS-CoV-2-Nsp13與單熒光標記底物發生結合反應時的熒光各向異性的變化。不同濃度的SARS-CoV-2-Nsp13依次加入到150μL包含有5 nmol/L底物的緩沖液中，緩沖液成分為25 mmol/L Tris-HCl pH值7.5，20 mmol/L NaCl，2 mmol/L DTT。結果表明，隨著SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶濃度的增加，其結合ssDNA-18nt、5'OhS12D20、5'RNA HP-12nt12bp底物的各向異性呈S型曲線上升趨勢（圖3（a）），SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶結合單鏈DNA、帶有5'尾鏈的雙鏈DNA及RNA發卡結構的活力具有差異性，通過希爾方程擬合，得到SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶結合ssDNA-18nt、5'OhS12D20、5'RNA HP-12nt12bp的Kd值依次是0.720 99±0.036，0.366 9±0.018，0.393 36±0.02μmol/L，由Kd值可知，解旋酶與不同底物的結合活性強弱依次為5'OhS12D20＞5'RNA HP-12nt12bp＞ssDNA-18nt（圖3（b））。

SARS-CoV-2-Nsp13與不同底物的結合活性見圖3。

2.4 SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶解旋活性的研究

由圖3（a）可知，在試驗條件下，當SARSCoV-2-Nsp13蛋白濃度在0.5~2.0μmol/L變化時，只能解開一部分雙鏈DNA，當SARS-CoV-2-Nsp13蛋白濃度達到3μmol/L時，其解旋完全，解旋活性隨著蛋白濃度的升高而增強，因此確定SARSCoV-2-Nsp13解旋酶濃度為3μmol/L時可以完全解開DNA雙鏈。由圖3（b）可知，在試驗條件下，反應buffer中NaCl的濃度為80 mmol/L時，SARSCoV-2-Nsp13蛋白解旋DNA雙鏈的活力受到較為明顯的抑制，NaCl濃度30 mmol/L和50 mmol/L時，解旋活力相當，考慮到底物的穩定性，將解旋的NaCl濃度確定為50 mmol/L。

圖3 SARS-CoV-2-Nsp13與不同底物的結合活性

利用凝膠阻滯試驗對SARS-CoV-2-Nsp13蛋白解旋雙鏈DNA的活性研究見圖4。

圖4 利用凝膠阻滯試驗對SARS-CoV-2-Nsp13蛋白解旋雙鏈DNA的活性研究

3 結論

研究了新冠病毒Nsp13解旋酶的體外生化活性，結果表明，該解旋酶具有與單鏈DNA、帶有5'尾鏈的雙鏈DNA及RNA發卡結構結合的活性；具有解旋帶有5'尾鏈的雙鏈DNA的活力，解旋的方向是5'-3'，且解旋活力受到NaCl的抑制。

新型冠狀病毒疫情已成為人類健康和生命的重大威脅。冠狀病毒編碼的RNA解旋酶是病毒復制復合體的重要組成部分，在病毒的傳播和感染中起到不可或缺的作用。因此，冠狀病毒編碼的RNA解旋酶被認為是理想的抗病毒靶點。研究利用原核表達系統純化了新冠病毒的解旋酶Nsp13。試驗測定了SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶與不同DNA及RNA底物的結合活性，發現其結合帶有5'尾鏈的雙鏈DNA及RNA發卡結構的活力要強于單鏈DNA，這表明SARS-CoV-2-Nsp13在病毒的轉錄和復制中發揮重要作用。通過希爾方程擬合，擬合曲線是S型，3個底物的n值均大于1，結果表明底物與SARSCoV-2-Nsp13的結合存在協同作用，這與先前文獻中研究一致[10]。SARS-CoV-2-Nsp13對于5'端存在尾鏈的雙鏈DNA和RNA發卡高的親和力是其能夠解旋雙鏈DNA和RNA的保證。EMSA試驗表明，SARS-CoV-2-Nsp13解旋酶具有解旋DNA雙鏈的活力，解旋的方向是從5'-3'，解旋的最適蛋白濃度為3μmol/L，解旋反應中高的NaCl濃度會抑制SARSCoV-2-Nsp13解旋雙鏈DNA的活力。

試驗結果表明，SARS-CoV-2-Nsp13解旋DNA雙鏈沿著5'-3'方向進行，而且需要DNA雙鏈的5'端帶有尾鏈，這與之前報道的SARS-CoV-Nsp13一致。不同的是Jia Z等人[11]報道SARS-CoV-Nsp13解旋酶可以解旋15 bp長度雙鏈DNA，比試驗結果稍長一些，可能的原因是試驗中所使用的底物序列不同，另外Jia Z等人[11]的解旋反應體系中加入了DNA trap，這可能在一定程度上有利于解旋。

研究進一步拓展了對新型冠狀病毒復制體的理解，對新型冠狀病毒解旋酶Nsp13可作為抗病毒藥物研發中一個有價值的靶點提供了試驗支持，從而有助于新冠疫情的防控和醫治。