TIGIT及其配體CD155在“怒”應(yīng)激大鼠胸腺細(xì)胞中的表達(dá)及其意義*

盧黃欣，陳俊賢，李瑋婷，歐陽彥楚，楊軍平△

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，江西南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌 330006

T細(xì)胞免疫球蛋白和ITIM結(jié)構(gòu)域蛋白(TIGIT)是一種具有免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的新型共抑制信號分子[1]，作為免疫調(diào)控受體，也是T細(xì)胞活化、凋亡以及效應(yīng)功能發(fā)揮過程中重要的信號分子，其不僅對細(xì)胞的免疫激活、成熟、分化有直接調(diào)控作用，還與細(xì)胞凋亡機(jī)制有密切聯(lián)系[2]。TIGIT可以與多種配體相結(jié)合發(fā)揮作用，如CD155、CD122、CD113，其中TIGIT與CD155的親和程度最高[3]。TIGIT作為T細(xì)胞表面的負(fù)性共抑制受體，其細(xì)胞內(nèi)的ITIM基序旁邊還存在一個(gè)類似免疫球蛋白尾絡(luò)氨酸(ITT)的磷酸化基序，在TIGIT與CD155信號結(jié)合后，ITT樣基序在其基點(diǎn)Tyr225處磷酸化并與靶淋巴細(xì)胞中的適配器Grb2結(jié)合，從而傳遞抑制性信號進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，降低機(jī)體免疫調(diào)控功能[4]。

研究表明，在應(yīng)激反應(yīng)中，機(jī)體可通過影響下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，造成激素分泌異常[5]；通過神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)(NEI)網(wǎng)絡(luò)的過度調(diào)控造成免疫損傷，導(dǎo)致胸腺出現(xiàn)萎縮，胸腺細(xì)胞出現(xiàn)衰竭[6]；相關(guān)研究表明，特異性活躍表達(dá)于各種T細(xì)胞亞群和自然殺傷(NK)細(xì)胞中的TIGIT可通過影響T細(xì)胞自身活化通路或結(jié)合多種合作細(xì)胞干擾免疫因子的分泌，造成直接或間接的免疫功能抑制，并誘導(dǎo)免疫細(xì)胞衰竭[7]，同時(shí)TIGIT可與CD155結(jié)合，傳遞抑制性信號，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡，降低機(jī)體免疫調(diào)控功能。本研究通過分析不同時(shí)程應(yīng)激“怒”模型大鼠中促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)及相關(guān)免疫因子白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)表達(dá)水平，探討“怒”情志對免疫功能的影響，分析不同時(shí)程應(yīng)激“怒”模型大鼠胸腺中TIGIT及其配體CD155的蛋白表達(dá)水平和胸腺T細(xì)胞凋亡率，以及TIGIT分子在應(yīng)激反應(yīng)中與胸腺T細(xì)胞凋亡及外周免疫功能紊亂的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及分組 雄性SPF級Wistar大鼠48只，雄性SPF級SD大鼠12只，均為8周齡，體質(zhì)量為180～200 g；2種品系的大鼠均由濟(jì)南鵬悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司提供。動物合格證號：SCXK(魯)2019-0003，飼養(yǎng)于江西中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室動物實(shí)驗(yàn)中心。購置后，隨機(jī)分籠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，飲食不限，環(huán)境濕度35%～45%，溫度(20±4)℃，采用自動明暗系統(tǒng)(7:00照明，19:00熄燈)；7 d后，Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，對照組、模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組，每組12只，對照組每6只1籠，模型各組分別單籠(50 cm×30 cm×20 cm)獨(dú)立飼養(yǎng)。SD大鼠作為入侵鼠，每6只1籠，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后放棄不用。對照組Wistar大鼠與SD大鼠放置于同一飼養(yǎng)房間，模型組Wister大鼠放置于另外一個(gè)飼養(yǎng)房間。實(shí)驗(yàn)已經(jīng)通過江西中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會審查，審查批號:JZLLSC2019-0153。

1.2儀器與試劑 PowerPacTM通用Bio-Rad電泳儀購自上海一恒科技有限公司。TIGIT多克隆抗體(批號PAN056Ra)、CD155抗體(批號PAB550Ra01)均購自美國Cloud-Clone Corp.公司；內(nèi)參β-actin抗體(批號mAbcam8266)購自美國mAbcam公司；一步法Tunel細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒(綠色FITC標(biāo)記熒光檢測法，通用型)購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；CRH、ACTH、IL-2、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技公司；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(批號G1120)購自北京索萊寶公司。

1.3方法

1.3.1大鼠應(yīng)激“怒”模型制備 參照文獻(xiàn)[8-9]方法,采用“社會隔離法”結(jié)合足底電擊法對獨(dú)立飼養(yǎng)的Wistar大鼠復(fù)制精神應(yīng)激“怒”模型。社會隔離法：制造晝夜顛倒的生存環(huán)境，每晚19:00開燈，上午7:00熄燈，飲食不限，持續(xù)14 d(對照組大鼠與入侵鼠在正常光照節(jié)律房間飼養(yǎng))；從第15天開始，每天13:30-15:30進(jìn)行入侵鼠干擾(隨機(jī)選取1只入侵鼠放入獨(dú)立飼養(yǎng)籠中接觸模型大鼠，持續(xù)15 min)；從第15天開始，每天16:00-17:30進(jìn)行不可避免的足底電擊(電擊棒4 000 V，<0.5 mA，脈沖15 s，持續(xù)15 min)。模型大鼠結(jié)合性刺激分別持續(xù)7、14、21 d，完成應(yīng)激“怒”模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組大鼠制備，對照組大鼠不進(jìn)行任何刺激。

1.3.2取材及稱質(zhì)量 記錄4組大鼠實(shí)驗(yàn)前1 d及實(shí)驗(yàn)后體質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)完成后采取頸椎脫臼法處死大鼠，取出胸腺，以生理鹽水浸洗2次、定性濾紙吸干液體并稱質(zhì)量記錄，計(jì)算胸腺指數(shù)，胸腺指數(shù)=胸腺凈質(zhì)量/體質(zhì)量(mg/g)。

1.3.3HE染色 胸腺標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，進(jìn)行包埋、脫水、透明和浸蠟，將蠟塊固定于切片機(jī)，切下2～4 μm厚度的胸腺組織于 40 ℃水中，60 ℃烘烤2 h。經(jīng)脫蠟、染色、透明和封片，于高清顯微鏡下拍照。

1.3.4胸腺細(xì)胞TIGIT、CD155蛋白表達(dá)水平測量(免疫印跡法) 提取各組大鼠胸腺組織蛋白，經(jīng)過灌膠、上樣、轉(zhuǎn)模、封閉、洗膜等工作后，分別浸入TIGIT、CD155、內(nèi)參一抗中孵育過夜，洗膜，孵育二抗完成后進(jìn)行顯影，用軟件Alphaview SA分析蛋白條帶的相對灰度值。

1.3.5Tunel法檢測胸腺細(xì)胞凋亡率 按照1.3.3步驟將胸腺組織切片后進(jìn)行脫蠟，透明，然后放入盛有pH值6.0的枸櫞酸鹽緩沖液的燒杯中，92 ℃加熱30 min，進(jìn)行磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，用免疫組化筆外圈標(biāo)記，按照Tunel(FITC)Kit試劑盒說明書進(jìn)行熒光染色，隨機(jī)選取染色完成后的分組標(biāo)本的切片，隨機(jī)視野下拍照，以Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行吸光度分析，并計(jì)算平均吸光度，分析胸腺T細(xì)胞凋亡率。

1.3.6血清CRH、ACTH、IL-2、IL-10水平測量 采用真空無菌采血管取2 mL血液，以3 000 r/min離心15 min，用移液槍抽吸“透亮”上清液，轉(zhuǎn)移至EP管待測。后續(xù)操作過程嚴(yán)格遵從ELISA試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.14組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量及實(shí)驗(yàn)后胸腺指數(shù)比較 實(shí)驗(yàn)前1 d，4組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，實(shí)驗(yàn)后4組大鼠體質(zhì)量均較實(shí)驗(yàn)前1 d升高(P<0.05)，但“怒”模型各組大鼠體質(zhì)量均低于對照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)后“怒”模型各組大鼠胸腺指數(shù)均低于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 4組大鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量及實(shí)驗(yàn)后胸腺指數(shù)比較

2.24組大鼠胸腺組織形態(tài)學(xué)觀察 光學(xué)顯微鏡下(×400)觀察可見：對照組大鼠胸腺皮質(zhì)部飽滿，幼稚T細(xì)胞布排整齊、細(xì)胞間隙疏松，結(jié)構(gòu)分明，其細(xì)胞核染色較深，呈深藍(lán)紫色，出現(xiàn)少量巨噬細(xì)胞呈淡紅色(圖1A)。“怒”模型各組大鼠胸腺皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不同程度的損壞，幼稚T細(xì)胞布排紊亂無序或呈“條索狀”堆積，細(xì)胞間隙縮小，細(xì)胞數(shù)量較對照組降低，細(xì)胞核染色變淺，呈淡紫色，并出現(xiàn)不同程度的核固縮、核分裂、細(xì)胞溶解等凋亡細(xì)胞增多現(xiàn)象，其中以模型7 d組、模型14 d組較為明顯(圖1B、C、D)。

注：A、B、C、D分別為對照組、模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組大鼠胸腺組織HE染色(×400)，標(biāo)尺為200px。圖1 實(shí)驗(yàn)后4組大鼠胸腺組織HE染色結(jié)果

2.34組大鼠胸腺細(xì)胞TIGIT、CD155蛋白表達(dá)水平比較 4組大鼠胸腺細(xì)胞TIGIT蛋白表達(dá)水平比較，模型7 d組、模型14 d組高于對照組，模型7 d組高于模型14 d組、模型21 d組，模型14 d組高于模型 21 d組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；“怒”模型各組大鼠胸腺細(xì)胞CD155蛋白表達(dá)水平比較，模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組均高于對照組(P<0.05)。見圖2、3。

注：A、B、C、D分別為對照組、模型7 d組、模型14 d組、模型21 d組大鼠胸腺TIGIT和CD155蛋白表達(dá)水平。圖2 4組大鼠胸腺細(xì)胞TIGIT和CD155蛋白表達(dá)水平

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型7 d組比較，bP<0.05；與模型14 d組比較，cP<0.05。圖3 4組大鼠胸腺細(xì)胞TIGIT/β-actin和CD155/β-actin的相對灰度值比

2.44組大鼠胸腺T細(xì)胞的凋亡率比較 熒光顯微鏡下(×400)，以發(fā)射波長515～565 nm觀察，可見胸腺凋亡細(xì)胞呈綠色熒光；DAPI陰性復(fù)染，以發(fā)射波長340～380 nm觀察，可見凋亡細(xì)胞以外區(qū)域正常細(xì)胞胞核呈藍(lán)色熒光。4組大鼠胸腺組織凋亡細(xì)胞的吸光度比較，模型7 d組(19.92±4.04)、模型14 d組(13.53±1.56)、模型21 d組(7.97±1.37)高于對照組(5.01±1.35)，模型7 d組高于模型14 d組、模型21 d組，模型14 d組高于模型21 d組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5實(shí)驗(yàn)后4組大鼠血清CRH、ACTH、IL-2、IL-10水平比較 血清CRH、ACTH水平比較，模型7 d組、模型14 d組高于對照組及模型21 d組(P<0.05)；IL-2水平比較，“怒”模型各組均低于對照組(P<0.05)，且模型7 d組、模型14 d組低于模型21 d組(P<0.05)；IL-10水平比較，“怒”模型各組均高于對照組(P<0.05)，且模型14 d組高于模型7 d組及模型21 d組(P<0.05)。見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)后4組大鼠血清CRH、ACTH、IL-2、IL-10水平比較

2.6TIGIT、CD155表達(dá)水平與ACTH、CRH、IL-2、IL-10、胸腺指數(shù)、胸腺細(xì)胞凋亡程度的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，TIGIT的表達(dá)水平與CD155、ACTH、CRH、胸腺細(xì)胞凋亡程度呈正相關(guān)(P<0.05)，與IL-2呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與IL-10、胸腺指數(shù)無相關(guān)性(P>0.05)；CD155的表達(dá)水平與TIGIT、胸腺細(xì)胞凋亡程度呈正相關(guān)(P<0.05)，與IL-2呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與ACTH、CRH、IL-10、胸腺指數(shù)無相關(guān)性(P>0.05)。見表3。

表3 TIGIT、CD155表達(dá)水平與ACTH、CRH、IL-2、IL-10、胸腺指數(shù)、胸腺細(xì)胞凋亡程度的相關(guān)性

指標(biāo)IL-2rPIL-10rP胸腺指數(shù)rP胸腺細(xì)胞凋亡程度rPTIGIT-0.690<0.01 0.288>0.050.086>0.050.863<0.01CD155-0.570<0.05-0.317>0.050.099>0.050.562<0.05

3 討 論

隨著健康概念的更新和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)模式的改變，“怒”等負(fù)性情緒在疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用和機(jī)制已成為研究熱點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)理論之七情致病論也認(rèn)為情志與健康和疾病密切相關(guān)，其中“怒”情志首傷肝，肝失疏泄，則諸病叢生。研究表明，“肝主疏泄”是機(jī)體調(diào)控免疫系統(tǒng)功能活動的核心，與心理應(yīng)激的免疫功能調(diào)控密切相關(guān)[10]。同時(shí)，長期心理應(yīng)激和情緒異常容易導(dǎo)致機(jī)體NEI網(wǎng)絡(luò)被過度激活，HPA軸分泌異常，進(jìn)一步誘發(fā)多系統(tǒng)組織細(xì)胞損傷，從而增加自身免疫系統(tǒng)疾病、癌癥、精神性疾病等的患病可能性[11-12]。

在情志致病模型中，“怒傷肝”類型是相對研究廣泛且較為成功的一種。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[8-9]方法，采用“足底電擊”和“社會隔離入侵”的方法制備“怒傷肝”模型大鼠。其中“社會隔離法”由國外學(xué)者DAVIS發(fā)明，該法對大鼠進(jìn)行長期的單獨(dú)隔離并日夜顛倒飼養(yǎng)，有利于使動物進(jìn)入“孤立無援”的生存狀態(tài)，由此提高大鼠對環(huán)境刺激的敏感性，加入入侵鼠干擾以及足底電擊更能充分體現(xiàn)軀體性、社會性、心理性三類應(yīng)激源因素，在造模期間，大鼠表現(xiàn)為怒叫、呼吸加速、易激怒等明顯盛怒現(xiàn)象。

國外最新研究發(fā)現(xiàn)，身體應(yīng)激和心理應(yīng)激能夠引起TIGIT高表達(dá)，其對T細(xì)胞存在抑制性作用[13]，并發(fā)現(xiàn)TIGIT的表達(dá)與在T細(xì)胞衰竭中起關(guān)鍵作用的幾種抑制調(diào)節(jié)因子的上調(diào)有關(guān)[14]，同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)，TIGIT和CD155表達(dá)水平的升高與多種免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制、不良預(yù)后密切相關(guān)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)免疫印跡法結(jié)果顯示，各模型組大鼠胸腺的TIGIT和CD155蛋白的表達(dá)水平均有所上升，而CD155蛋白呈持續(xù)高水平表達(dá)趨勢，以應(yīng)激7 d時(shí)效果最為明顯，提示了應(yīng)激反應(yīng)中大鼠胸腺幼稚T細(xì)胞的凋亡可能與TIGIT-CD155軸的表達(dá)活性存在正相關(guān)關(guān)系。目前應(yīng)激反應(yīng)中的NEI網(wǎng)絡(luò)存在多種機(jī)制相互協(xié)助，共同介導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)[17]。本實(shí)驗(yàn)通過不同時(shí)程的慢性“怒”應(yīng)激能有效提高大鼠血清中CRH、ACTH的分泌水平，提示“怒”應(yīng)激大鼠HPA軸功能亢進(jìn)并成功處于應(yīng)激狀態(tài)，另外Tunel法結(jié)果顯示模型組大鼠胸腺皮質(zhì)部幼稚T細(xì)胞的凋亡率明顯高于對照組，以應(yīng)激7 d時(shí)效果最為明顯，而胸腺指數(shù)持續(xù)降低，說明了在應(yīng)激反應(yīng)中，大鼠的胸腺抑制與HPA軸興奮有直接關(guān)系。研究表明樹狀突細(xì)胞(DC)上的CD155與TIGIT相結(jié)合，使DC的分泌格局發(fā)生改變，促進(jìn)抑制因子IL-10水平升高，活化因子IL-2水平下降，間接抑制T細(xì)胞的活化[18]。在本實(shí)驗(yàn)中模型大鼠血清正性免疫調(diào)節(jié)因子IL-2水平明顯降低，而負(fù)性免疫調(diào)節(jié)因子IL-10水平明顯上升，符合TIGIT-CD155軸對DC的免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)通過對TIGIT及其配體CD155進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果提示TIGIT、CD155與HPA軸、IL-2密切相關(guān)，共同作用抑制免疫應(yīng)答。值得注意的是，在此實(shí)驗(yàn)中TIGIT、ACTH、CRH、IL-2的水平變化及胸腺細(xì)胞凋亡程度均在模型7 d組效果最為明顯，而模型14 d組次之，模型21 d組趨于正常；而各模型組CD155表達(dá)水平均明顯高于對照組(P<0.05)，但各模型組間對比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果提示表達(dá)閾值及胸腺細(xì)胞凋亡情況可能與隨應(yīng)激時(shí)間延長機(jī)體對應(yīng)激源出現(xiàn)“適應(yīng)性”改變或者通過機(jī)體“內(nèi)環(huán)境”的穩(wěn)態(tài)調(diào)整進(jìn)行修復(fù)等有關(guān)[19]，其中IL-10表達(dá)水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，以模型14 d組最為突出，其結(jié)果可能與應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞因子釋放時(shí)間的早晚有關(guān)；胸腺指數(shù)的持續(xù)降低可能與應(yīng)激后體質(zhì)量保持持續(xù)低值有關(guān)，其原因尚需更多研究說明。

綜上所述，“怒”應(yīng)激可致HPA軸調(diào)節(jié)功能紊亂及免疫耐受能力下降，同時(shí)應(yīng)激反應(yīng)所造成的胸腺萎縮和胸腺細(xì)胞凋亡，可能是TIGIT-CD155軸以及HPA軸、IL-10、IL-2共同作用的結(jié)果。其結(jié)果需要進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍深入探討。本研究為闡述“怒”應(yīng)激致使免疫功能損傷提供新角度，旨在強(qiáng)調(diào)避免“怒”情志發(fā)生，預(yù)防疾病發(fā)生或復(fù)發(fā)，為提高臨床療效提供新思路。