70株室間質量評價菌株鑒定差異及其糾正方法探討

馬 爽，湯鳳珍，杜利軍，伍國達，馮 峰，程 璐，馬 翔

1.廣東省廣州市花都區婦幼保健院檢驗科，廣東廣州 510800；2.廣東省廣州市花都區人民醫院檢驗科，廣東廣州 510899；3.廣東省江門市中心醫院檢驗科，廣東江門 529030；4.廣東省廣州市花都人愛醫院檢驗科，廣東廣州 510800

隨著自動化微生物鑒定儀、基質輔助激光解吸飛行時間質譜儀(MALDI-TOF MS)的廣泛應用，極大地提高了臨床微生物的鑒定能力。由于臨床微生物的種、屬繁多，存在多樣性、復雜性，選擇的鑒定特征可能難以代表全部的被鑒定菌株，特別是少見菌、疑難菌、分類“未明確菌”。當“試驗組合”不是所鑒定菌屬、菌種“獨有的”特征時，會出現不明確、不能鑒定、近緣菌株不能區分的“不確定”結果。自動化微生物鑒定系統根據“固定的”生理生化特征，不能自動補充鑒別試驗，是導致菌株鑒定為復合群、低分辨率或者不能鑒定的原因之一。顯色培養基雖具有快速篩查目標菌的優勢，但對于產生類似色素的菌株還需要進一步鑒別。志賀菌屬、沙門菌屬、大腸埃希菌O157、霍亂弧菌等經過生化特征鑒定后，還需要血清學的確認。微生物的藥敏試驗需要根據菌株種類選擇藥物[1]，因此鑒定結果的錯誤可能影響到藥敏結果的判讀和臨床用藥。為此，筆者探討了“不確定”菌株的進一步鑒定，以得到明確的病原菌鑒定結果[2-8]，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1試驗菌株 對國家衛生健康委臨床檢驗中心及廣東省臨床檢驗中心提供的室間質量評價菌株進行鑒定，將其中經自動化微生物鑒定系統鑒定為“不確定”菌和在不同顯色平板上產生類似色素的菌(非目標菌)共70株作為試驗菌株。

1.2儀器與試劑 全自動微生物分析儀Vitek 2 Compact、革蘭陽性菌鑒定卡(GP卡)、革蘭陰性桿菌鑒定卡(GN卡)和MALDI-TOF MS Vitek MS均購自法國生物梅里埃公司；DHP-9052型電熱恒溫培養箱購自上海一恒科學儀器有限公司。用于念珠菌、小腸結腸炎耶爾森菌和沙門菌鑒定的顯色平板，采用法國科瑪嘉公司生產的干粉配制；顯色平板及哥倫比亞血平板均從廣州迪景微生物試劑有限公司購進。微生物生化鑒定微量管以及氧化酶紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司，丁酸酯酶紙片購自Remel公司，3%過氧化氫試劑自配。志賀菌屬、大腸埃希菌O157:H7、沙門菌屬診斷血清購自丹麥國家血清研究院、中國蘭州生物制品研究所。儀器設備均按說明書操作，所有試劑均在使用有效期內。

1.3方法 取試驗菌株35 ℃孵育18～24 h的血平板生長物進行革蘭染色，革蘭陽性菌補充過氧化氫酶試驗，革蘭陰性菌補充氧化酶、葡萄糖氧化/發酵(O/F)和動力試驗。凡菌株在Vitek 2 Compact、Vitek MS上鑒定為“不確定”菌的，行補充試驗鑒別。對在顯色平板上產生類似色素的菌株，同時采用Vitek 2 Compact、Vitek MS鑒定；對出現鑒定差異的菌株行補充試驗確認。志賀菌屬、大腸埃希菌O157:H7和沙門菌屬菌株采用特異性血清學鑒定(均做鹽水對照)。

2 結 果

2.1試驗菌株自動化微生物鑒定系統鑒定結果 70株試驗菌株經Vitek 2 Compact、Vitek MS鑒定出現“不確定”菌共計32株，見表1。其中Vitek 2 Compact能夠鑒定志賀菌屬與大腸埃希菌O157:H7菌株共11株(均經過特異性的血清學鑒定)，其他21株“不確定”菌需要進一步鑒別到種，占65.6%(21/32)；Vitek MS能夠鑒定鶉雞腸球菌、鉛黃腸球菌、肺炎鏈球菌、緩癥鏈球菌、新洋蔥伯克霍爾德菌、快速生長分枝桿菌、諾卡菌共13株，其他19株“不確定”菌需要進一步鑒別到種，占59.4%(19/32)；部分菌株在兩種鑒定系統間出現鑒定差異。從鑒定的菌種比對看出，Vitek MS較Vitek 2 Compact可鑒定的微生物種類增多，具有對Vitek 2 compact不能鑒定菌株鑒定的優勢，但是，其對于志賀菌屬菌株、大腸埃希菌O157:H7不能明確鑒定。

表1 自動化微生物鑒定系統的“不確定”菌

2.2“不確定”菌Vitek 2 Compact與Vitek MS鑒定結果的差異及鑒別 通過不同鑒定系統及表型特征的互補、結合血清學試驗，均可以鑒定到種/型。通過同一菌株在不同系統上的鑒定比對，大多數菌種的鑒定結果是相符合的，但少數菌種有差異，見表2。

表2 “不確定”菌Vitek 2 Compact與Vitek MS鑒定結果的差異及鑒別

2.3試驗菌株顯色平板篩選結果 70株試驗菌株在不同顯色平板上產生類似色素的菌有38株，均確定為非目標菌(包含自動化鑒定系統鑒定的同種菌株)，見表3。

表3 不同顯色平板篩選的非目標菌

續表3 不同顯色平板篩選的非目標菌

2.4非目標菌Vitek 2 Compact與Vitek MS鑒定結果的差異及鑒別 都柏林念珠菌在念珠菌顯色平板也是綠色菌落，對于此平板上生長的綠色菌落的菌株需要鑒別；氣單胞菌在CIN平板也是紅色菌落，根據氧化酶試驗(+)即可排除小腸結腸炎耶爾森菌；在沙門菌顯色平板上為紅色菌落的非沙門菌包括多個菌屬，通過氧化酶、苯丙氨酸脫氨酶、動力、MUG等試驗鑒別，見表4。

表4 非目標菌Vitek 2 Compact與Vitek MS鑒定結果的差異及鑒別

2.5新洋蔥伯克霍爾德菌鑒定 新洋蔥伯克霍爾德菌在血平板上35 ℃孵育24 h，菌落細小，延長孵育時間菌落增大，圓形、凸起、光滑、濕潤。該菌為革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗(+)、葡萄糖O/F試驗為氧化型。洋蔥伯克霍爾德菌群種間的表型特征非常相似，即使補充試驗鑒別，菌種的鑒定仍然困難，MALDI-TOF MS有鑒別優勢。新洋蔥伯克霍爾德菌在Vitek 2 Compact上的鑒定結果為洋蔥伯克霍爾德菌群(置信度94.0%)；Vitek MS質譜儀鑒定結果為新洋蔥伯克霍爾德菌(置信度99.9%)。如果需要進一步鑒定到種水平，其鑒別特征見表5。

表5 洋蔥伯克霍爾德菌群種間鑒別特征

3 討 論

任何微生物鑒定系統都有鑒定菌種的范圍，實驗室人員要了解應用系統的鑒定菌譜。通常自動化微生物鑒定系統能夠對大多數臨床常見菌株鑒定到種，但對少部分菌株只能鑒定到復合群，需要補充鑒別試驗才能鑒定到種水平，這關系到藥敏試驗的結果解釋。同一菌株在不同系統上進行鑒定比對，少數菌株有差異，這會導致實驗室間、或者實驗室內使用不同的鑒定系統的結果不符合，因此，微生物實驗室需要重視類似菌株的鑒別，做到準確基礎上的可比。Vitek 2 Compact操作手冊指出了一些菌屬、菌群的菌株需要進一步鑒別。

不同菌屬的培養條件、菌落形態、色素、氣味以及染色性質、菌體形態、動力等不盡相同，甚至有“獨特性”，這是自動化微生物鑒定系統尚不能替代的。細菌的革蘭染色是全自動微生物分析儀鑒定的重要方向性試驗，如果革蘭陰性菌錯用GP卡可能有鑒定結果，但得到的結果南轅北轍，反之亦然。而顯色平板是專為目標菌的快速“篩選”研制的，其根據微生物特定的酶水解底物顯色，且目標菌在此培養基上生長良好，顯色快、顏色鮮艷而容易識別。雖然顯色平板中的抑菌劑會抑制“雜菌”的生長，但是，本試驗在念珠菌等3種顯色平板上觀察到38株產生類似色素的菌株，其鑒定的結果都不是目標菌株。因此，不能僅僅根據在顯色平板上菌落的色素而未經鑒定就直接發出報告，還需要進行鑒定確認，謹防誤報。因此，對于自動化微生物鑒定系統鑒定為“不確定”、或者顯色培養基“篩查”的菌株，需通過不同的方法互補，提高微生物鑒定的質量。快速生長分枝桿菌、諾卡菌根據培養特性、菌落形態、菌體抗酸染色特征，可以初步識別。

MALDI-TOF MS尚不能準確鑒定志賀菌屬細菌、大腸埃希菌O157，可能對患者的診治造成影響。對于來自糞便標本報告的大腸埃希菌，要做進一步甄別，報告正確的病原學結果，其對臨床治療有重要意義。

本研究對70株試驗菌株的鑒定結果與國家衛生健康委臨床檢驗中心及廣東省臨床檢驗中心反饋的鑒定結果一致。本研究列舉了“不確定”菌的鑒定及鑒別，但存在鑒定差異的菌株不僅限于此[9-10]，由于試驗菌株數量有限，有待進一步觀察。下列菌株鑒定錯誤可能影響疾病的診斷與治療。

病例概況1：福氏志賀菌、鮑氏志賀菌、痢疾志賀菌2型及宋內志賀菌從不潔飲食腹瀉患者的糞便中檢出，部分菌株也從健康帶菌者糞便中檢出。志賀菌屬是主要的腸道病原菌之一，引起人類細菌性痢疾，嚴重感染時可出現全身中毒癥狀。

病例概況2：大腸埃希菌O157:H7從一名14歲男性腹痛患兒的血便中檢出。大腸埃希菌O157為高致病性細菌，能導致出血性腸炎、甚至嚴重的溶血性尿毒癥綜合征。

病例概況3：新洋蔥伯克霍爾德菌從一名84歲女性呼吸機相關性肺部感染患者的吸痰標本中檢出。新洋蔥伯克霍爾德菌是此菌屬最常見的菌種之一，肺部感染難以治療，由于感染的患者術后預后差，將其感染視為肺移植術的絕對禁忌證。

病例概況4：鶉雞腸球菌從一名78歲女性腎盂腎炎患者的尿液中分離出來。鶉雞腸球菌、鉛黃腸球菌還可引起腹腔、盆腔及膽管等部位感染。鉛黃腸球菌和鶉雞腸球菌均對萬古霉素天然低水平耐藥，而糞腸球菌和屎腸球菌對萬古霉素是獲得性耐藥，這2類腸球菌的鑒別對臨床治療有重要意義。

綜上所述，通過不同鑒定方法的互補，可以提高臨床微生物的鑒定質量。